呂昌勇，陳朝銀，徐致遠(yuǎn)

(1.光明乳業(yè)股份有限公司乳業(yè)生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,上海200436；2.昆明理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,昆明650500)

一種改進(jìn)的普洱茶固態(tài)發(fā)酵過程微生物DNA提取方法

呂昌勇1，2，陳朝銀2，徐致遠(yuǎn)1

(1.光明乳業(yè)股份有限公司乳業(yè)生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,上海200436；2.昆明理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,昆明650500)

為開發(fā)一種改進(jìn)的普洱茶固態(tài)發(fā)酵過程微生物DNA提取方法，首先配制含有吐溫-20、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、乙二胺四乙酸二鈉(Na2EDTA)等組分的洗滌緩沖液，引入超聲波振蕩、渦旋、65 ℃水浴、反復(fù)洗滌等手段，把普洱茶發(fā)酵微生物較高質(zhì)量的收集起來，再使用十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)法提取微生物總DNA。按照本文所述方法所得到的菌體沉淀接近白色，后續(xù)提取出的DNA總量高、色度低、雜質(zhì)少，適用于PCR及基因組學(xué)等研究。

普洱茶；固態(tài)發(fā)酵；提取DNA；發(fā)酵食品

渥堆發(fā)酵是現(xiàn)代普洱茶發(fā)酵的主要手段[1]，即利用濕熱原理、微生物及其代謝作用加速普洱茶發(fā)酵過程[2-3]。通常環(huán)境中可培養(yǎng)的微生物不足1%[4-6]，利用常規(guī)方法對環(huán)境中微生物真實(shí)群落結(jié)構(gòu)了解的非常有限[7-8]，因此，采用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)對傳統(tǒng)發(fā)酵工藝中的微生物進(jìn)行研究是提高普洱茶質(zhì)量的有效途徑。但是，普洱茶茶葉自身生長過程中就代謝有非常復(fù)雜的次生代謝產(chǎn)物，加之在渥堆發(fā)酵過程中茶葉成分的分解轉(zhuǎn)化更為復(fù)雜[9-10]，這些都影響著普洱茶渥堆發(fā)酵過程微生物總DNA的高質(zhì)量提取，進(jìn)而影響著分子生物學(xué)在普洱茶研究中的應(yīng)用。

普洱茶發(fā)酵微生物的收集好壞，直接影響著后面微生物DNA提取質(zhì)量的好壞，如果收集到的菌體本身表面附著太多色素及多酚類等次級代謝產(chǎn)物，或者菌體里面混雜著植物葉片茶渣，在提取DNA裂解細(xì)胞的時候，這些次級代謝產(chǎn)物很容易與釋放出來的DNA結(jié)合交纏在一塊，一旦這些物質(zhì)交纏在一塊，就很難再分開，進(jìn)而嚴(yán)重影響DNA的提取質(zhì)量。

為此筆者在總結(jié)了最近有關(guān)普洱茶微生物DNA提取的論文所用的微生物收集方法的基礎(chǔ)上，結(jié)合在實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)明總結(jié)的方法并對這些方法收集后的菌體進(jìn)行提取DNA效果比較，以期得到一種能較為科學(xué)高效的普洱茶發(fā)酵微生物收集方法及建立其DNA提取體系。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)所用的普洱茶樣品采自云南省勐?？h鵬程茶廠正在渥堆發(fā)酵的普洱茶，樣品在干冰環(huán)境下運(yùn)輸，回到實(shí)驗(yàn)室后置于-70 ℃冰箱內(nèi)保存。

主要試劑： NaCl，北京市化學(xué)試劑三廠；十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)、乙二胺四乙酸(EDTA)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，Solarbio公司；三羥甲基氨基甲烷(Tris),Novon公司；冰乙酸，天津化學(xué)試劑三廠；巰基乙醇，Amresco公司； Taq酶、PCR試劑盒，TaKaRa 公司；Tween-20，Sigma公司。

主要儀器:核酸電泳槽，Wealtec公司; X-22低溫離心機(jī)，Beckman Coulter公司; HHS-S恒溫水浴鍋，上海比朗儀器有限公司; 2100 Pro紫外分光光度計，GE公司; SW-CJ-2D型無菌操作臺，蘇州凈化設(shè)備有限公司；VGT-1613T超聲波清洗機(jī)，深圳威固特清洗設(shè)備有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 普洱茶表面微生物的收集

1) 無菌水浸泡分離(方法1)

參考Chen等[11]提取分離普洱茶微生物的方法，具體操作如下：① 取3 g茶葉樣品加入裝有30 mL無菌水中；② 3 000 r/min 1 min去除茶葉殘渣，收集懸浮液；③ 15 000 r/min 10 min收集菌體沉淀。

2) 磷酸鹽緩沖液浸泡分離(方法2)

參考張陽等[12]分離普洱茶微生物的方法，具體操作如下：① 取3 g茶葉樣品加入裝有30 mL無菌的磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)中；② 用超聲波振蕩(40 kHz，500 W) 7 min；③ 在搖床搖動30 min(200 r/min)；④ 后低速(500 r/min)離心7 min去除掉葉片殘留樣品，9 000 r/min離心8 min，收集菌體沉淀。

3)Tween-NaCl 緩沖液分離(方法3)

參考孫婷婷等[13]分離普洱茶微生物的方法，具體操作如下：① 取3 g茶葉樣品加入裝有30 mL無菌的Tween-NaCl 緩沖液(10 g/L Tween-20，1.5 mol/L NaCl，pH 7.5～8.0)；② 靜置30 min；③ 超聲波振蕩(40 kHz，500 W)10 min；④ 離心(12 000 r/min,10 min)的菌體收集。

4) 筆者改進(jìn)的方法(方法4)

① 稱取2～3 g普洱茶樣品，剪碎，放到50 mL離心管中；② 按照10 mL/g茶葉的比例加入配置的洗滌緩沖液(含有1.5 mol/L NaCl、100 mmol/L Tris-HCl、50 mmol/L Na2EDTA、0.6 g/L Tween-20、質(zhì)量分?jǐn)?shù)2% PVP、pH為8.0的溶液)，茶葉浸泡其中，靜置15 min；③ 在超聲波清洗儀(40 kHz，500 W)環(huán)境中振蕩10 min，渦旋45 s，上清液轉(zhuǎn)入新的離心管中；④ 65 ℃水浴6 min，低速離心去除殘渣，高速離心收集沉淀；⑤ 加入適當(dāng)?shù)南礈炀彌_液(組分同上)，渦旋振蕩混勻，65 ℃水浴6 min，高速離心收集(10 000 r/min，10 min)菌體，完成一次洗滌過程；步驟⑤洗滌重復(fù)多次，直到離心收集菌體的上清液接近透明為止。筆者改進(jìn)的方向主要為洗滌緩沖液的配方調(diào)整及組合優(yōu)化洗滌方法。

1.2.2 DNA的粗提

1)向步驟1.2.1中所得到的沉淀用液氮充分研磨，以1.0 mL/g茶葉的用量加入DNA提取液(成分為10～20 g/L CTAB、20～50 mmol/L Na2EDTA、80～100 mmol/L Tris-HCl、1～1.5 mol/L NaCl、10～20 mL/L 巰基乙醇)；

2)加入0.1 mg/mL蛋白酶K，55 ℃環(huán)境水浴30 min，接著65 ℃水浴1 h；

3)加入等體積氯仿-異戊醇混合液(兩者體積比為24∶ 1)，混勻后10 000g離心10 min，上層的水相回收于新的離心管中，重復(fù)此步驟1次；

4)加入等體積預(yù)冷的異丙醇，1/10體積3 mol/L醋酸鈉，混勻，置于-20 ℃靜置45 min；

5)15 000g離心20 min，所得沉淀用75%(體積分?jǐn)?shù))乙醇洗滌，自然風(fēng)干，加入100 μL雙蒸水，此為粗提的總DNA。

1.2.3 粗提DNA的純化

1)粗提的DNA中加入0.5 mg/ mL RNAse，37 ℃水浴1 min以上；

2)加雙蒸水補(bǔ)足至500 μL，加等體積的Tris飽和酚，混勻，10 000g離心10 min，上層水相回收于新離心管中；

3)加等體積的氯仿-異戊醇混合液，混勻，10 000g離心10 min，上層水相回收于新離心管中；

4)加2倍體積的無水乙醇，1/10體積3 mol/L醋酸鈉，混勻，-20 ℃靜止30 min；

5)15 000g離心20 min，所得沉淀自然風(fēng)干后，加100 μL雙蒸水，此為純化后的總DNA。

1.2.4 DNA提取效率及提取質(zhì)量的檢測

1)提取的DNA通過瓊脂糖電泳后在凝膠成像系統(tǒng)下觀察，以此判斷DNA提取效果及完整性；

2)選擇16S rDNA通用引物27F：(5′-A￣G￣A￣G￣T￣T￣T￣G￣A￣T￣C￣C￣T￣G￣G￣C￣T￣C￣A￣G-3′)和1492R：(5′-G￣G￣T￣T￣A￣C￣C￣T￣T￣G￣T￣T￣A￣C￣G￣A￣C￣T￣T-3′)進(jìn)行細(xì)菌PCR擴(kuò)增，間隔約1.5 kb； PCR反應(yīng)體系20 μL，成分為0.5 μL未經(jīng)純化的DNA模版，250 μmol/L dNTP(每種)，0.1 μmol/L引物，10×Buffer(含MgCl2)2 μL，TaqDNA聚合酶1 U，其余為去離子水，擴(kuò)增過程先94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，53 ℃ 35 s，72 ℃ 1.5 min，設(shè)定32個循環(huán)，最后72 ℃ 7 min。

選擇18S rDNA通用引物ITS3:(5′-G￣C￣A￣T￣C￣G￣A￣T￣G￣A￣C￣G￣C￣A￣G￣C-3′)和ITS4：(5′-T￣C￣C￣T￣C￣C￣G￣C￣T￣T￣A￣T￣T￣G￣A￣T￣A￣T￣G￣C-3′)進(jìn)行真菌PCR擴(kuò)增，間隔約300 bp；PCR反應(yīng)體系同上，擴(kuò)增過程先94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，55 ℃ 35 s，72 ℃ 30 s，設(shè)定32個循環(huán)，最后72 ℃ 7 min。

3)利用紫外分光光度計對純化后的DNA吸光度進(jìn)行測量，計算OD260/OD280，并根據(jù)吸光度值估算提取DNA的濃度及產(chǎn)率。

2 結(jié)果與討論

2.1 洗滌后所得菌體的顏色及粗提DNA所得沉淀顏色

對已經(jīng)報道的4種收集菌體的方法進(jìn)行比較，分析比較洗滌所得到的微生物沉淀的顏色及醇沉DNA后沉淀顏色結(jié)果見表1。由表1可知：無菌水、磷酸鹽、Tween-NaCl緩沖液所分離出來的菌體均有較深的顏色，這些顏色很有可能是由于得到的沉淀菌體表面附著大量次級代謝產(chǎn)物，從而導(dǎo)致粗提得到的DNA醇沉后有較深的顏色，DNA沉淀的顏色較深從側(cè)面說明含有的雜質(zhì)較多。從一個側(cè)面說明筆者所用的洗滌緩沖液及收集微生物方法在一定程度上優(yōu)于其他普洱茶發(fā)酵微生物的收集方法。

表1 4種方法收集菌體顏色及粗提DNA顏色對比

2.2 粗提DNA電泳圖

圖1為4種方法分離后菌體粗提微生物總DNA的電泳圖。由圖1可知：利用方法1和2分離微生物后提取的DNA條帶非常不明顯，表明提出的DNA含量極少，質(zhì)量很差，可能原因是洗滌過程中，菌體收集質(zhì)量太差，含有大量雜質(zhì)，影響了微生物DNA的提取；方法3所得到的DNA隱約有條帶，提取量高于方法1和2，表明所用的收集菌體的緩沖液在一定程度上可以達(dá)到保護(hù)DNA的效果，但是提取率相對較少；方法4所得的DNA主條帶清晰，片段較大且亮度較高，初步確定為最好的DNA分離菌體方法。

M—標(biāo)準(zhǔn)DNA；1～4— 4種方法收集后提取微生物DNA圖1 4種方法粗提DNA效果比較Fig.1 Comparison of four methods to extract DNA

2.3 粗提DNA PCR

圖2和圖3分別為普洱茶渥堆發(fā)酵過程中總微生物DNA 16S rRNA基因、18S rRNA基因PCR凝膠電泳圖。由圖2和圖3可以看出：只有方法4在1.5 kb和300 bp左右處有明顯主條帶，片段大小符合細(xì)菌和真菌的特征條帶大小，表明該方法提取出的微生物總DNA既包括細(xì)菌的又包括真菌的DNA，且可以直接用于PCR擴(kuò)增。

M—標(biāo)準(zhǔn)DNA；1～4—4種方法收集后微生物圖2 普洱茶渥堆發(fā)酵過程中總微生物 DNA 16S rRNA基因PCRFig.2 16S rRNA gene PCR of extraction of total microbial DNA of Puer tea during pile-fermentation

M—標(biāo)準(zhǔn)DNA；1～4—4種方法收集后微生物圖3 普洱茶渥堆發(fā)酵過程中總微生物 DNA ITS3-ITS4基因PCRFig.3 ITS3-ITS4 gene PCR of extraction of total microbial DNA of Puer tea during pile-fermentation

2.4 提取效率

對純化后所提取的DNA，使用紫外分光光度計進(jìn)行純度檢測并進(jìn)行提取率的計算。提取DNA所用樣品為3 g，溶解DNA為100 μL，稀釋12倍。所得數(shù)據(jù)如表2所示。

表2 DNA紫外分光光度計檢測結(jié)果

注：“-”表示比值無比較意義。

由表2可知：方法1和方法2提取率非常小，幾乎可以忽略其提取率，方法3和方法4的提取率分別為1.03、7.60 μg/g普洱茶。

結(jié)合用OD260和OD280的比值估計核酸的純度，OD260和OD230比值估計去鹽的程度，可以明顯發(fā)現(xiàn)，方法3所得到的DNA純度較差，難以滿足后續(xù)分子生物學(xué)的要求。而方法4收集菌體后提取的DNA OD260/OD280=1.84，OD260/OD230=1.66，能比較好地滿足后續(xù)分子生物學(xué)研究的要求，同時具有較高的提取率，可以認(rèn)為方法4優(yōu)于方法1、2和3，較好地收集菌體后對高質(zhì)量地提取DNA具有關(guān)鍵的作用。

值得強(qiáng)調(diào)的是，本文所用的提取DNA方法是較為普遍的CTAB法。雖然如參考文獻(xiàn)所述方法沒有對收集的微生物進(jìn)行一定的處理，但是依舊取得了一定的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，筆者認(rèn)為這是由于他們在提取DNA過程中采用了一定的補(bǔ)救措施。而本文中所述的提取DNA的方法所需試劑等均為常規(guī)試劑，在菌體分離后，沒有用到DNA提取試劑盒、溶菌酶破壁酶等試劑等，操作簡單，目的就是直觀地說明微生物收集及其預(yù)處理對發(fā)酵微生物DNA提取的重要性。

對比之前報道，Chen等[11]對發(fā)酵普洱茶微生物總DNA進(jìn)行提取，然后用真菌DGGE分析，最終在整個發(fā)酵過程只得到3種真菌的信息；張陽等[12]和孫婷婷等[13]的方法提取出來的DNA必須經(jīng)過一定的稀釋(100～1 000倍)才可以用于擴(kuò)增出細(xì)菌16S rDNA和真菌β-微管蛋白基因，表明所提取出來的DNA含有較多雜質(zhì)，多酚等代謝產(chǎn)物殘存量都沒有被完全去除，所以必須將粗提總DNA樣品進(jìn)行稀釋后才能作為模板；表明這些文獻(xiàn)所述的方法均有一定的局限性，其中的原因很有可能就與沒有進(jìn)行恰當(dāng)科學(xué)的微生物收集和洗滌有關(guān)，

本文在實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上配制專門用于洗滌用的緩沖液，其包含的Tween-20是一種乳化劑，有去污功能；PVP能有效去除多糖多酚類物質(zhì)；Na2EDTA可以螯合普洱茶葉表重金屬離子，這些物質(zhì)的配合使用，可以有效去除微生物表面的次級代謝產(chǎn)物；同時在收集微生物時摒棄了用恒溫振蕩器等較為溫和的方法，因?yàn)樵谖⑸锓蛛x耗時越長，微生物在分離出茶葉表面的同時次生代謝產(chǎn)物也會分離出來，進(jìn)而與微生物表面二次黏附，本文首先對茶葉短時間浸泡，使其吸水膨脹，增加表水接觸面積，然后快速激烈地分離微生物，盡量減少次生代謝物的浸出；收集菌體后又采取較高溫水浴、振蕩等方法反復(fù)洗滌以使菌體表面殘存的色素、多酚類等次生代謝產(chǎn)物等去除。本文所提取的DNA已經(jīng)應(yīng)用于普洱茶發(fā)酵微生物高通量測序的研究，說明了本文所述的收集微生物及后續(xù)的提取DNA可以用于后續(xù)分子生物學(xué)研究。

3 結(jié) 論

按照本文的方法，所得到的菌體沉淀和DNA沉淀顏色均有較大的改觀，所得到的菌體沉淀接近白色，后續(xù)沉淀出的DNA為白色，此方法可以比較有效地去除次生代謝物質(zhì)對提取DNA的干擾。因此在后續(xù)的提取DNA過程中不需要昂貴的實(shí)驗(yàn)儀器、試劑盒及復(fù)雜的提取手段，依然能得到較高質(zhì)量的DNA。所提取出的DNA條帶完整，RNA有效去除，提取率為7.60 μg/g以上，OD260/OD280=1.84，OD260/OD230=1.66，經(jīng)過細(xì)菌及真菌PCR均能擴(kuò)增出符合特征大小的條帶。

目前，關(guān)于普洱茶的分子生物學(xué)研究開展較少，而本研究方法的體系為普洱茶發(fā)酵分子生物學(xué)的研究奠定了一定的基礎(chǔ)，進(jìn)而從分子水平揭露普洱茶發(fā)酵微生物中關(guān)鍵菌群及其代謝過程，為普洱茶產(chǎn)業(yè)的科技化提供了理論依據(jù)。

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(責(zé)任編輯 荀志金)

Modified extraction total microbial DNA in Puer tea solid-state fermention

LYU Changyong1,2,CHEN Chaoyin2,XU Zhiyuan1

(1.State Key Laboratory of Dairy Biotechnology,Bright Dairy & Food Co.Ltd.,Shanghai 200436,China; 2.Faculty of Life Science and Technology,Kunming University of Science and Technology,Kunming 650500,China)

Isolation high purity,large fragment DNA is important in microbial molecular research and while collecting microbial cells properly plays key roles to isolate total DNA.We developed a modified method to extract total microbial DNA in Puer tea fermentation.First,microbes tea was collected by washing samples several times with a buffer containing with Tween-20,polyvinylpyrrolidone(PVP),and ethylenediaminetetraacetic acid disodium (Na2EDTA),in combination with ultrasonic oscillations and vortex at 65 ℃ until microbial cells with nearly white color.Then,microbial total DNA was extracted by using hexadecyltrimethylammouium bromide(CTAB) approach to obtain an integral,light color and pure microbial DNA suitable for PCR and genomics research.

Puer tea;solid-state fermentation;DNA extraction;fermented food

10.3969/j.issn.1672-3678.2014.06.010

2013-08-18

國家科技支撐計劃(2013BAD18B01)；國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃(863計劃)(2011AA100901)

呂昌勇(1987—),男,河南固始人,碩士,助理工程師,研究方向:微生物工程與酶工程,E-mail:abcd1000efgh2000@163.com

Q93

A

1672-3678(2014)06-0052-05