呂翠翠，袁 敏，石服鑫，曹 慧，徐 斐，于勁松

(上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院，上海200093)

超聲波輔助抽提法在孔雀石綠分子印跡固相萃取中的應(yīng)用

呂翠翠，袁 敏，石服鑫，曹 慧，徐 斐，于勁松

(上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院，上海200093)

采用沉淀聚合法制備孔雀石綠分子印跡聚合物(MG-MIPs)，以洗脫效率及吸附量為指標(biāo)，考察超聲波輔助抽提法對(duì)MIPs中MG洗脫效果及吸附性能的影響，通過(guò)掃描電鏡觀察MIPs的表面形態(tài)，并對(duì)其吸附性能進(jìn)行研究。結(jié)果表明：模板分子MG在超聲30 min、超聲10次、料液比m(MG-MIPs)∶V(甲醇-乙酸溶液)為1∶ 10(g/mL)、溫度為25 ℃、超聲功率為270 W的條件下，洗脫效果最好，MIPs在固相萃取柱中的吸附效率較高，達(dá)到198 μg/g。

分子印跡；固相萃??；模板洗脫；超聲波輔助抽提；孔雀石綠

固相萃取是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種樣品預(yù)處理技術(shù)，主要用于樣品的分離和濃縮，然而傳統(tǒng)的固相萃取技術(shù)存在選擇性差的不足[1-2]。分子印跡聚合物 (molecularly imprinted polymers,MIPs) 是一種對(duì)特定分子具有專一識(shí)別性能的高分子材料，其特異性和親和性為食品安全檢測(cè)中痕量物質(zhì)的富集與分析提供了便利[3]。將MIPs作為固相萃取填料，有助于增強(qiáng)萃取的選擇性和吸附容量，但MIPs中模板分子的洗脫限制了其在固相萃取中的應(yīng)用。目前，常用的模板分子洗脫方法為索氏抽提法，該法耗時(shí)、耗溶劑且洗脫效果欠佳[4]，因而迫切需要尋找一種快捷高效的洗脫方法。超聲波輔助抽提法因其具有高效、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)在分子印跡固相萃取中得到廣泛應(yīng)用[5]。

孔雀石綠(malachite green，MG) 主要用于治療各類水產(chǎn)動(dòng)物的水霉病[6],由于其易在生物體內(nèi)和環(huán)境中長(zhǎng)期殘留，且對(duì)人體具有致癌、致畸、致突變等毒害作用[7-10]，因而已被許多國(guó)家列為水產(chǎn)養(yǎng)殖禁用藥物[11]。我國(guó)于2002年5月出臺(tái)的國(guó)標(biāo)(GB/T 19857—2005)規(guī)定孔雀石綠在水產(chǎn)品中的檢出率不得超過(guò)1 ng/g[12]。但由于孔雀石綠防治水霉病的效果顯著且價(jià)格低廉，目前仍有部分不法分子違規(guī)使用[10]。

基于此，本試驗(yàn)采用沉淀聚合法制備孔雀石綠分子印跡聚合物，以洗脫效率及吸附量為指標(biāo)，考察超聲波輔助抽提法對(duì)MIPs中MG洗脫效果及吸附性能的影響，通過(guò)掃描電鏡觀察了MIPs的表面形態(tài)，并對(duì)其吸附性能進(jìn)行研究。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)品，Sigma公司；甲醇、乙腈、乙酸、甲基丙烯酸(MAA)、偶氮二異丁腈(AIBN)、乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA) 等均為分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 主要儀器

JY92-IIDN型超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)，寧波新藝超聲設(shè)備有限公司；UV-6000型紫外分光光度計(jì)，上海元析儀器有限公司；Breeze HPLC高效液相色譜儀，Waters公司；Quanta FEG FEI掃描電子顯微鏡(SEM)，F(xiàn)EI公司。

1.3 MG-MIPs的制備

取0.5 mmol MG于100 mL錐形瓶中，用40 mL乙腈超聲溶解10 min，再加入4.0 mmol MAA，搖勻，避光靜置30 min。向以上體系中加入20.0 mmol EGDMA和40 mg引發(fā)劑AIBN，超聲10 min后充N210 min，密封并于60 ℃水浴聚合24 h。除不加模板分子，非印跡聚合物(NIPs)的制備過(guò)程同上。

1.4 超聲波輔助抽提法對(duì)MG-MIPs模板分子的洗脫

采用超聲波輔助抽提法對(duì)MG-MIPs的模板分子進(jìn)行洗脫，以洗脫后MG的殘留量和MG在MIPs固相萃取柱中的吸附量為指標(biāo)，考察超聲時(shí)間、洗脫次數(shù)、料液比、溫度、超聲波功率對(duì)MIPs中模板分子洗脫效果及吸附性能的影響。

1.4.1 高效液相色譜(HPLC)對(duì)模板分子的檢測(cè)

采用HPLC檢測(cè)洗脫液中模板分子MG的殘留量，直至無(wú)模板分子析出。液相色譜條件為：C18色譜柱(4.6 mm × 250 mm，5 μm)，流動(dòng)相 0.05 mmol/LV(乙酸銨)∶V(乙腈)為2∶ 8，流速1 mL/min，柱溫室溫，進(jìn)樣量20 μL。

1.4.2 MIPs固相萃取柱對(duì)模板分子的吸附

將不同洗脫條件下獲得的MG-MIPs于60 ℃真空干燥至恒質(zhì)量，各取100 mg于6 mL空柱中干法裝柱，所得固相萃取小柱(MIPSE)依次用5 mL甲醇、5 mL乙腈活化。取3 mL 3 μg/mL MG溶液以0.2 mL/min 的流速過(guò)MIPs柱，然后淋洗，用2 mL的V(甲醇)/V(乙酸)為9混合液洗脫，收集洗脫液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，用甲醇/乙酸定容至2 mL，經(jīng)0.45 μm濾膜過(guò)濾后采用HPLC測(cè)定MG濃度。

1.5 平衡吸附實(shí)驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取20 mg MIPs、NIPs于具塞試管中，分別加入3 mL不同濃度(0.5～20 μg/mL)的MG乙腈溶液，置于水浴振蕩器中恒溫振蕩24 h后，移取適量上層清液，微濾。用乙腈將濾液稀釋至合適的濃度，并于618 nm處測(cè)定平衡吸附液中MG的游離濃度。根據(jù)結(jié)合前后溶液中MG的濃度變化計(jì)算聚合物對(duì)MG的吸附量(Q)。根據(jù)Q值繪制MIPs的結(jié)合等溫線圖和Scatchard圖，并評(píng)價(jià)MIPs的結(jié)合性質(zhì)。

1.6 MIPs的SEM分析

將樣品粘在托盤上的導(dǎo)電膠上，放進(jìn)真空艙抽真空，噴金，結(jié)束后于掃描電子顯微鏡上觀察MG-MIPs的形貌及粒徑大小。

2 結(jié)果與討論

2.1 超聲時(shí)間對(duì)MIPs中模板分子洗脫效果及吸附性能的影響

超聲時(shí)間對(duì)MIPs中模板分子的洗脫及吸附性能有一定的影響。超聲時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，其超聲能量可能會(huì)破壞MIPs的結(jié)構(gòu)，從而降低MIPs在分子印跡固相萃取柱中對(duì)MG的吸附效率；超聲時(shí)間過(guò)短，MIPs與模板分子之間的非共價(jià)鍵還沒(méi)有完全斷裂，模板分子溶出不充分，進(jìn)而影響其在固相萃取中的應(yīng)用。因而，考察超聲時(shí)間對(duì)MIPs中模板分子洗脫效果及吸附性能的影響，結(jié)果如圖1所示。其余超聲條件為：超聲10次，每次超聲后換液，料液比1∶ 10 g/mL，溫度25 ℃，超聲功率270 W。

圖1 超聲時(shí)間對(duì)MIPs中模板分子洗脫效果 及吸附性能的影響Fig.1 Effects of extraction time on elution of template molecule and adsorptive property of MIPs

由圖1可見(jiàn)：超聲30 min時(shí)，洗脫液中MG的殘留量較低，為3.29 ng/mL，已達(dá)到高效液相色譜儀法的檢測(cè)限，洗脫后MIPs在分子印跡固相萃取柱中對(duì)MG的吸附量達(dá)到198 μg/g。這可能是由于功能單體MAA的羧基與孔雀石綠的堿性氨基之間形成的氫鍵或離子鍵已斷裂，MG溶出較為充分，同時(shí)，能量適中的超聲波保持了MIPs結(jié)構(gòu)的完整，使其在固相萃取柱中對(duì)MG具有較強(qiáng)的吸附能力。此外MIPs對(duì)MG的吸附量顯著高于NIPs對(duì)MG的吸附量，表明在印跡聚合物中存在MG的特異結(jié)合位點(diǎn)。因此，選擇30 min為最適超聲時(shí)間。

2.2 洗脫次數(shù)對(duì)MIPs中模板分子洗脫效果及吸附性能的影響

超聲次數(shù)是決定MIPs中模板分子洗脫效果及吸附性能的重要因素之一，因而考察了洗脫次數(shù)對(duì)MIPs中模板分子洗脫效果及吸附性能的影響，結(jié)果如圖2所示。其余超聲條件為：每次超聲30 min，料液比1∶ 10(g/mL)，溫度25 ℃，超聲功率270 W。

圖2 洗脫次數(shù)對(duì)MIPs中模板分子洗脫效果 及吸附性能的影響Fig.2 Effects of extraction times on elution of template molecule and adsorptive property of MIPs

由圖2可見(jiàn):隨著超聲次數(shù)的增加，MIPs中殘留的模板分子濃度迅速降低，當(dāng)超聲次數(shù)達(dá)到10次以上，洗脫液中殘留的模板分子低于3.50 ng/mL，且隨著超聲次數(shù)的進(jìn)一步增加，不再發(fā)生顯著變化。這可能是由于較少的超聲次數(shù)使得洗脫液受到的負(fù)壓力不足，空化作用弱，MG無(wú)法充分溶出，因而殘留量較高，進(jìn)而降低了固相印跡柱的萃取效率,故選定超聲次數(shù)為10次為宜。

2.3 料液比對(duì)MIPs中模板分子洗脫效果及吸附性能的影響

考察料液比對(duì)MIPs中模板分子洗脫效果及吸附性能的影響，結(jié)果如圖3所示。其余超聲條件為：每次超聲30 min，超聲10次，溫度25 ℃，超聲功率270 W。

圖3 料液比對(duì)MIPs中模板分子洗脫效果 及吸附性能的影響Fig.3 Effects of solid-liquid ratios on elution of template molecule and adsorptive property of MIPs

由圖3可見(jiàn)：當(dāng)料液比小于1∶ 10(g/mL)時(shí)，MIPs中殘余的模板分子濃度相對(duì)較高，這可能是由于料液比較低時(shí)，模板分子在洗脫液中的濃度迅速達(dá)到平衡，降低了洗脫效率，進(jìn)而影響MIPs在固相萃取柱中對(duì)MG的吸附效果。當(dāng)料液比小于1∶ 10(g/mL)時(shí)，MG殘留量為2.62 ng/mL，MIPs在固相萃取柱中對(duì)MG的吸附量達(dá)到較高的水平，其值為205 μg/g，這與料液比為1∶ 10(g/mL)時(shí)MIPs對(duì)MG的吸附數(shù)值無(wú)顯著差異,因此最適料液比為1∶ 10(g/mL)。

2.4 溫度對(duì)MIPs中模板分子洗脫效果及吸附性能的影響

考察了溫度對(duì)MIPs中模板分子洗脫效果及吸附性能的影響，結(jié)果如圖4所示。其余超聲條件為：每次超聲30 min，超聲10次，料液比1∶ 10(g/mL)，超聲功率270 W。

圖4 溫度對(duì)MIPs中模板分子洗脫效果及吸附性能的影響Fig.4 Effects of temperature on elution of template molecule and adsorptive property of MIPs

由圖4可見(jiàn):溫度對(duì)MIPs中模板分子洗脫效果及吸附性能的影響并不顯著。印跡聚合物中功能單體上的功能基與模板分子通過(guò)離子鍵或氫鍵結(jié)合，雖然溫度可為價(jià)鍵的斷裂提供一定的能量，但相對(duì)超聲波本身的空化作用及能量而言，這種破壞作用較小，故溫度對(duì)MIPs中模板分子洗脫效果及吸附性能的影響并不顯著。為便于實(shí)驗(yàn)操作，選定25 ℃為洗脫溫度。

2.5 超聲波功率對(duì)MIPs中模板分子洗脫效果及吸附性能的影響

考察了超聲波功率對(duì)MIPs中模板分子洗脫效果及吸附性能的影響，結(jié)果如圖5所示。其余超聲條件為：每次超聲30 min，超聲10次，料液比1∶ 10(g/mL)，溫度25 ℃。

圖5 超聲波功率對(duì)模板分子洗脫效果及 MIPs吸附性能的影響Fig.5 Effects of ultrasonic power on elution of template molecule and adsorptive property of MIPs

由圖5可見(jiàn):當(dāng)功率過(guò)低時(shí)，超聲波能量太弱，模板分子與MIPs之間的價(jià)鍵無(wú)法斷裂，使得包埋于高度交聯(lián)的網(wǎng)狀分子印跡聚合物中的MG無(wú)法快速溶出，洗脫效率降低，進(jìn)而影響固相萃取柱中MIPs對(duì)MG的吸附。而較高的超聲波能量不僅使MG與MIPs之間的氫鍵、離子鍵斷裂，更使形成印跡聚合物框架的價(jià)鍵斷裂，導(dǎo)致整個(gè)MG-MIPs的結(jié)構(gòu)坍塌，MIPs在固相萃取柱中對(duì)MG的吸附量大幅度降低。因此，選定超聲波功率270 W為宜。

2.6 平衡吸附實(shí)驗(yàn)

采用平衡吸附實(shí)驗(yàn)考察印跡聚合物的結(jié)合特性。在孔雀石綠質(zhì)量濃度為0.5～20 μg/mL范圍內(nèi)，測(cè)定聚合物對(duì)不同初始濃度孔雀石綠溶液的結(jié)合量，結(jié)果如圖6所示。由圖6可見(jiàn)：在研究的濃度范圍內(nèi)隨著孔雀石綠濃度的增加，單位質(zhì)量MIPs對(duì)模板孔雀石綠分子的吸附量也隨之增加，可以明顯地看出MIPs的吸附量大于NIPs的吸附量，表明在印跡聚合物微球中存在特異的結(jié)合位點(diǎn)。

圖6 孔雀石綠印跡聚合物的結(jié)合等溫線Fig.6 Binding isotherm of MG-MIPs

圖7 MIPs的Scatchard曲線Fig.7 Scatchard curve of MIPs

根據(jù)吸附等溫線數(shù)據(jù)，進(jìn)行Scatchard分析，考察聚合物對(duì)孔雀石綠的結(jié)合情況。Scatchard方程為Q/ρ=(Qmax-Q)/Kd，式中ρ為溶液中孔雀石綠的平衡質(zhì)量濃度(μg/mL)；Qmax為結(jié)合位點(diǎn)最大表觀結(jié)合量；Kd為結(jié)合位點(diǎn)的平衡離解常數(shù)，Kd=-1/斜率。以Q/ρ對(duì)Q作圖得圖7。從圖7可以看出，Q/ρ對(duì)Q呈非線性關(guān)系，說(shuō)明聚合物中的結(jié)合位點(diǎn)是非均一性的。圖中有2個(gè)部分呈線性關(guān)系，據(jù)此判斷在測(cè)定的濃度范圍內(nèi)，MIPs對(duì)孔雀石綠分子存在兩類不同的結(jié)合位點(diǎn)。由兩端直線的斜率和截距可近似求得高親和力結(jié)合位點(diǎn)的平衡離解常數(shù)Kd1=11.223 μg/mL，

最大表觀結(jié)合量Qmax1=4.45×102μg/g；低親和力結(jié)合位點(diǎn)的平衡離解常數(shù)Kd2=156.25 μg/mL，最大表觀結(jié)合量Qmax2=5.033×103μg/g。

2.7 孔雀石綠分子印跡聚合物的SEM分析

圖8為孔雀石綠分子印跡聚合物的SEM照片。由圖8可見(jiàn)，在相同條件下制備的非印跡聚合物和印跡聚合物，形態(tài)為微球狀，無(wú)明顯差異，主要粒徑為0.5～1.5 μm，粒子之間存在一定的黏連。沉淀聚合物微球是在大量反應(yīng)介質(zhì)中形成的，沉淀聚合發(fā)生于由均相的印跡分子、功能單體、交聯(lián)劑以及引發(fā)劑組成的混合溶液中。引發(fā)劑引發(fā)聚合反應(yīng)，生成可溶于連續(xù)相的線型和支鏈的低聚物；隨著低聚物分子鏈增長(zhǎng)，低聚物在連續(xù)相中的溶解度逐漸降低，最終從連續(xù)相中沉淀出來(lái)，形成聚合物核；聚合物核之間相互碰撞、聚集，并不斷吸收單體、自由基以及低聚物逐漸長(zhǎng)大，最終形成聚合物微球。

圖8 分子印跡聚合物的掃描電鏡照片F(xiàn)ig.8 SEM images of MG imprinted polymers

3 結(jié) 論

1)采用超聲波輔助抽提法洗脫孔雀石綠分子印跡聚合物中的模板分子，最優(yōu)洗脫條件為：超聲時(shí)間30 min，超聲10次，料液比1∶ 10(g/mL)，溫度25 ℃，超聲功率270 W。在此最佳洗脫條件下，印跡聚合物中MG的殘留量低于3 ng/mL，已達(dá)到HPLC的檢測(cè)限，洗脫后的MIPs在固相萃取柱中對(duì)MG的吸附量達(dá)到198 μg/g，表明制備的印跡聚合物可以用于食品中MG的富集與檢測(cè)。

2)采用沉淀聚合法制備的分子印跡聚合物微球，粒徑為0.5～1.5 μm，粒子之間存在一定的黏連。

3)平衡吸附實(shí)驗(yàn)表明在孔雀石綠質(zhì)量濃度為0.5～20 μg/mL內(nèi)，MIPs、NIPs的吸附量隨著孔雀石綠濃度的增加而增大，MIPs的吸附量顯著大于NIPs的吸附量。Scatchard分析表明MIPs對(duì)孔雀石綠分子存在兩類不同的結(jié)合位點(diǎn)。

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[12] 國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局.GB/T 19857—2005水產(chǎn)品中孔雀石綠和結(jié)晶紫殘留量的測(cè)定[S].北京:中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社,2005.

(責(zé)任編輯 荀志金)

Application of the ultrasound-assisted extraction inmolecularly imprinted solid phase extraction of malachite green

LYU Cuicui,YUAN Min,SHI Fuxin,CAO Hui,XU Fei,YU Jinsong

(School of Medical Instrument and Food Engineering,University of Shanghai for Science and Technology,Shanghai 200093,China)

Malachite green(MG)-molecularly imprinted polymers(MIPs) were prepared via precipitation polymerization.Using elution efficiency and adsorption of malachite green as indexes,we studied the effects of ultrasonic-assisted extraction on the elution of malachite green and adsorptive property of molecularly imprinted polymers were studied.Surface structure of molecularly imprinted polymers was observed by scanning electron microscope (SEM).Adsorption properties of molecularly imprinted polymers were studied.Results show that the optimum technical parameters for elution efficiency were 30 mins,10 times,the ratio of MG-MIPs to methanol-acetic acid solvent=1/10(g/mL),25 ℃ and 270 W.The adsorption properties of molecularly imprinted polymers in solid phase extraction column attained 198 μg/g.

molecular imprinting;solid phase extraction;template removal;ultrasound-assisted extraction;malachite green

10.3969/j.issn.1672-3678.2014.06.014

2013-07-10

上海市自然科學(xué)基金(11ZR1424400)

呂翠翠(1988—)，女，山東德州人，碩士研究生，研究方向：食品安全快速檢測(cè)；曹 慧(聯(lián)系人)，副教授，E-mail：caohuian@126.com

TQ461

A

1672-3678(2014)06-0073-05