楊同香，陳俊亮，吳孔陽，李全陽，李智麗，康懷彬

（1.河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，河南 洛陽 471023；2.廣西大學(xué)輕工與食品工程學(xué)院，廣西 南寧 530004；3.洛陽師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，河南 洛陽 471022）

水牛奶酪蛋白膠束結(jié)構(gòu)的熒光光譜研究

楊同香1,2，陳俊亮1，吳孔陽3，李全陽2，李智麗1，康懷彬1

（1.河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，河南 洛陽 471023；2.廣西大學(xué)輕工與食品工程學(xué)院，廣西 南寧 530004；3.洛陽師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，河南 洛陽 471022）

利用內(nèi)源熒光團(tuán)色氨酸（Trp）和外源熒光探針8-苯胺基-1-萘磺酸（8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid，ANS）的熒光特性對水牛奶酪蛋白膠束結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究。結(jié)果表明：當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)質(zhì)量濃度較低時，酪蛋白膠束結(jié)構(gòu)變化不明顯，而較高的蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度會破壞其膠束結(jié)構(gòu)，使其疏水基團(tuán)暴露；此外，在離子強(qiáng)度較大、pH值較低條件下，對酪蛋白膠束結(jié)構(gòu)影響較大，使酪蛋白疏水基團(tuán)暴露，酪蛋白微球先膨脹后聚集并形成酪蛋白膠束。

酪蛋白；膠束結(jié)構(gòu)；熒光光譜

酸乳凝膠主要組分是蛋白質(zhì)，牛奶中蛋白質(zhì)以酪蛋白和乳清蛋白為主，其中酪蛋白占牛奶總蛋白含量的80%，乳清蛋白占20%。酪蛋白在酸乳凝膠制作過程中逐漸酸化，變性并發(fā)生聚集，最終形成立體網(wǎng)狀的膠束結(jié)構(gòu)。目前，有關(guān)荷斯坦牛奶酪蛋白的分離[1-3]和結(jié)構(gòu)解析[4-6]等研究已經(jīng)相當(dāng)成熟，但是，膠束粒度分布與離子強(qiáng)度大小間的關(guān)系尚不清楚[7]，且對水牛奶酪蛋白的研究還較少。

蛋白質(zhì)各級結(jié)構(gòu)解析的主要方法有圓二色譜法、熒光光譜、X射線衍射法、動態(tài)光散射技術(shù)等。熒光光譜主要通過疏水性表征蛋白質(zhì)的膠束結(jié)構(gòu)[8]。蛋白質(zhì)形成三維結(jié)構(gòu)的主要原因是氨基酸殘基的非極性側(cè)鏈之間疏水相互作用的結(jié)果，疏水相互作用對于維持蛋白質(zhì)膠束結(jié)構(gòu)具有重要作用[9]?；谇捌趯λＤ碳八Ｄ趟崛槟z的研究[10]，本實驗主要通過熒光光譜分析影響蛋白結(jié)構(gòu)變化的主要因素（pH值、離子強(qiáng)度和蛋白質(zhì)量濃度）對酪蛋白膠束結(jié)構(gòu)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

水牛奶購于廣西南寧市聯(lián)利奶水牛農(nóng)民專業(yè)合作社，其他試劑等均為分析純級及以上。

1.2 儀器與設(shè)備

超速冷凍離心機(jī) 美國Backman公司；Hettich離心機(jī) 德國Hettich公司；UV-1601紫外分光光度計、RF-5301PC熒光光度計 日本島津公司；PB10 pH計德國Sartorius公司。

1.3 方法

1.3.1 酪蛋白的分離純化

分離方法按照文獻(xiàn)[1-3]。

1.3.2 熒光光譜法表征水牛奶酪蛋白（casein，CN）膠束結(jié)構(gòu)

將酪蛋白凍干樣品用適量0.01 mol/L的磷酸鹽緩沖液溶解，樣品預(yù)處理同圓二色譜處理方法。配制溶液后，恒溫靜置 1.0 h，在激發(fā)波長為295 nm，測定酪蛋白在波長300～420 nm范圍內(nèi)的熒光發(fā)射光譜[11]。

1.3.2.1 pH值對酪蛋白Trp熒光特性的影響

用0.01 mol/L磷酸緩沖溶液將樣品的pH值分別調(diào)至5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5，在室溫（25±1）℃下，測定其內(nèi)源熒光強(qiáng)度，研究pH值對酪蛋白Trp熒光性的影響。

1.3.2.2 離子強(qiáng)度對酪蛋白Trp熒光特性的影響

用NaCl溶液將樣品的離子強(qiáng)度調(diào)節(jié)至0.01、0.05、0.08、0.1、0.2、0.3 mol/L，在室溫（25±1）℃、pH 7.0條件下測定其內(nèi)源熒光強(qiáng)度，研究離子強(qiáng)度對酪蛋白Trp熒光性的影響。

1.3.3 ANS熒光光譜法表征水牛奶CN膠束結(jié)構(gòu)

熒光探針選用8-苯胺基-1-萘磺酸（8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid，ANS），取一定量的樣品用各自的緩沖溶液稀釋蛋白質(zhì)量濃度在0.04～0.20 mg/mL之間。 再加入20 μL的8 mmol/L的ANS熒光探針，混勻，避光15 min，然后于熒光分光光度計下比色，將激發(fā)波長設(shè)為390 nm，發(fā)射波長設(shè)為470 nm，測定樣品的熒光強(qiáng)度[12]。

1.3.3.1 質(zhì)量濃度對酪蛋白ANS熒光性的影響

配制CN樣品質(zhì)量濃度依次為12.5、25、50、100、200、400 μg/mL，離子強(qiáng)度為0.01 mol/L，pH 7.0，然后測定其熒光強(qiáng)度。

1.3.3.2 pH值對酪蛋白ANS熒光特性的影響

用0.01 mol/L磷酸緩沖溶液將樣品的pH值分別調(diào)至5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5，在室溫（25±1） ℃下測定其外源熒光強(qiáng)度，研究pH值對酪蛋白外源熒光性的影響。

1.3.3.3 離子強(qiáng)度對酪蛋白ANS熒光特性的影響

用NaCl溶液將樣品的離子強(qiáng)度調(diào)節(jié)至0.01、0.05、0.08、0.1、0.2、0.3 mol/L，在室溫（25±1）℃下測定其外源熒光強(qiáng)度，研究離子強(qiáng)度對酪蛋白外源熒光性的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 Trp熒光光譜法表征水牛奶CN膠束結(jié)構(gòu)

色氨酸（Trp）是一種很強(qiáng)的內(nèi)源熒光團(tuán)，對蛋白所處的極性環(huán)境具有高度敏感性。Trp位于折疊蛋白的內(nèi)部疏水基團(tuán)核心位置，最大發(fā)射波長約在335 nm。當(dāng)Trp所處微環(huán)境從疏水性環(huán)境變?yōu)闃O性環(huán)境時，往往會使其本身的熒光發(fā)射波長發(fā)生紅移，同時伴隨著發(fā)射強(qiáng)度的降低。αs-CN有兩個Trp殘基，β-CN和κ-CN只有一個Trp殘基。對Trp進(jìn)行熒光檢測可以有效地反映蛋白結(jié)構(gòu)的變化[13]。

圖1 水牛奶酪蛋白的內(nèi)源熒光性受環(huán)境中離子強(qiáng)度的影響Fig.1 Intrinsic tryptophan fluorescence intensity of buffalo casein as a function of ionic strength

檢測水牛奶CN內(nèi)源熒光特性受環(huán)境中離子強(qiáng)度的影響。如圖1所示，當(dāng)離子強(qiáng)度由0.01 mol/L增至0.05 mol/L時，CN內(nèi)源熒光強(qiáng)度（If）輕微增大，但熒光最大發(fā)射波長（λmax）并未變化，這表明分子內(nèi)部發(fā)生膨脹，給予酪氨酸（Tyr）和Trp等基團(tuán)自由轉(zhuǎn)動度，這個過程由疏水性基團(tuán)的水合作用完成，此時Trp依然保持在內(nèi)部疏水環(huán)境中。當(dāng)CN微環(huán)境中離子強(qiáng)度從0.1 mol/L增至0.3 mol/L時，CN內(nèi)源If發(fā)生顯著增大，同時伴隨著λmax的藍(lán)移（從346 nm藍(lán)移至340 nm）。這表明Trp內(nèi)部的剛性環(huán)境減弱，芳香族氨基酸殘基暴露，Trp殘基埋藏在疏水環(huán)境中，分子內(nèi)Trp猝滅作用減弱，導(dǎo)致CN分子結(jié)構(gòu)被破壞。隨環(huán)境中離子強(qiáng)度增大，CN發(fā)生折疊聚集，分子結(jié)構(gòu)改變。St?nciuc[14]和Chakraborty[15]等對荷斯坦牛奶apo-α-乳白蛋白的研究指出λmax發(fā)生移動，則表示Trp內(nèi)部疏水環(huán)境發(fā)生改變。

圖2 水牛奶酪蛋白的內(nèi)源熒光性受環(huán)境中pH值的影響Fig.2 Intrinsic tryptophan fluorescence intensity of buffalo casein as a function of pH

由圖2可知，CN周圍環(huán)境由中性變?nèi)鯄A性時，由于負(fù)電荷的加入，使分子內(nèi)部靜電斥力增大，If降低。天然狀態(tài)下的Trp很可能被周圍的氨基酸分子淬滅了熒光特性[14,16]。而隨著pH值的降低，使得CN所處微環(huán)境的H+濃度增大，中和CN表面的負(fù)電荷，使其分子間的靜電斥力減弱，CN微球發(fā)生膨脹，形成熔球態(tài)。CN周圍環(huán)境在pH 6.0時，其If相對與天然狀態(tài)約增加了20%，伴隨分子內(nèi)色氨酸淬滅和λmax的藍(lán)移。這表明色氨酸內(nèi)部的剛性環(huán)境減弱，芳香族氨基酸殘基暴露，Trp殘基埋藏在疏水環(huán)境中。隨著CN微環(huán)境中pH值進(jìn)一步降低，其相互作用也進(jìn)一步加強(qiáng)，被其他氨基酸遮蔽的Trp殘基暴露，從而使內(nèi)源If發(fā)生顯著增大，λmax發(fā)生藍(lán)移。pH 5.0條件下，Trp殘基分子內(nèi)淬滅，使If相對與天然狀態(tài)約增加了39%，λmax從346 nm 藍(lán)移至 339 nm，表明色氨酸殘基進(jìn)一步暴露在疏水性環(huán)境中。pH值的降低使CN分子結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。劉燕[17]對荷斯坦牛奶酪蛋白的Trp熒光性進(jìn)行了研究，指出在pH 5.5～10范圍內(nèi)，隨著pH值的升高，蛋白分子上的部分氨基酸去質(zhì)子化現(xiàn)象導(dǎo)致CN膠束形成過程中，氫鍵和鹽鍵作用遭到破壞，同時分子間較強(qiáng)的靜電斥力使膠束結(jié)構(gòu)變得疏松。

2.2 ANS熒光光譜法表征水牛奶CN膠束結(jié)構(gòu)

ANS是一種疏水熒光染料，作為外源的熒光團(tuán)追蹤監(jiān)測蛋白密集程度。相對于ANS在水溶液中的熒光參數(shù)，在存在蛋白的溶液中，ANS優(yōu)先占據(jù)溶液中易于接觸到的蛋白疏水基團(tuán)或簇，If產(chǎn)生顯著增大，并伴隨著其最大發(fā)射波長（通常為530 nm藍(lán)移至470 nm）明顯的藍(lán)移。ANS熒光參數(shù)可以有效的檢測蛋白結(jié)構(gòu)的變化，尤其是疏水區(qū)域暴露于溶劑中的中間態(tài)的變化[15,18]。為進(jìn)一步探究CN微環(huán)境變化對其結(jié)構(gòu)的影響，利用ANS熒光光譜分析水牛奶CN在不同蛋白質(zhì)量濃度、不同pH值和離子強(qiáng)度環(huán)境條件下熒光特性的變化。

圖3 水牛奶酪蛋白的外源熒光性受蛋白質(zhì)量濃度的影響Fig.3 Relative fluorescence intensity of buffalo casein as a function of protein concentration

如圖3所示，在水牛奶C N質(zhì)量濃度較低時（12.5～25 μg/mL），ANS的最大發(fā)射波長并未發(fā)生藍(lán)移，表明CN單體分子的疏水區(qū)域無法與ANS 分子結(jié)合，只有當(dāng)CN分子的疏水區(qū)自組裝形成膠束時，才能提供 ANS 結(jié)合所需的疏水結(jié)合位點。隨著CN質(zhì)量濃度的增加（50～400 μg/mL），ANS熒光明顯發(fā)生藍(lán)移，從504 nm藍(lán)移至472 nm，并伴隨著If的顯著增強(qiáng)。CN外源熒光強(qiáng)度隨蛋白質(zhì)量濃度的增大呈線性增大趨勢，擬合直線方程為：y = 0.979 5x + 46.082（R2 = 0.998 3）。這主要是由于CN質(zhì)量濃度的增大，使得CN分子的疏水區(qū)域自組裝成膠束，更多的疏水基團(tuán)暴露，從而使得ANS與疏水基團(tuán)的結(jié)合位點增多，進(jìn)而表現(xiàn)為ANS發(fā)生藍(lán)移，同時伴隨著If的增強(qiáng)。

圖4 水牛奶酪蛋白的外源熒光性受環(huán)境離子強(qiáng)度的影響Fig.4 Relative fluorescence intensity of buffalo casein as a function of ionic strength

圖5 水牛奶酪蛋白的外源熒光性受環(huán)境pH值的影響Fig.5 Relative fluorescence intensity of buffalo casein as a function of pH

ANS的熒光特性與其所處微環(huán)境的極性有密切關(guān)系。ANS本身并無強(qiáng)熒光性，只有ANS與蛋白疏水基團(tuán)相結(jié)合時，熒光性才會增強(qiáng)。由圖4、5可知，隨著CN環(huán)境中離子強(qiáng)度增大、pH值降低，ANS熒光強(qiáng)度呈顯著增強(qiáng)趨勢。酪蛋白ANS熒光圖譜隨著CN微環(huán)境中離子強(qiáng)度的增大發(fā)生明顯藍(lán)移，并伴隨著If的顯著增大。CN微環(huán)境中的離子強(qiáng)度0.30 mol/L時的熒光強(qiáng)度較離子強(qiáng)度0.10 mol/L時約升高了47%。這表明隨著離子強(qiáng)度的增大，伴隨著水合作用，CN暴露出更多的疏水基團(tuán)，使ANS獲得更多的結(jié)合位點，從而使其If增強(qiáng)。隨著溶液pH降低，ANS熒光圖譜If顯著增大，同時λmax發(fā)生稍許藍(lán)移。在pH 7.0～7.5時，ANS的If與λmax并未發(fā)生明顯變化，說明CN天然狀態(tài)下，由于靜電斥力的作用，疏水基團(tuán)被遮蔽，形成較好的動態(tài)平衡。隨著pH值降低，CN微環(huán)境中的質(zhì)子增多，逐漸中和CN表面的負(fù)電荷，使靜電斥力減弱，而疏水基團(tuán)暴露。隨著pH值進(jìn)一步降低，靜電斥力繼續(xù)減弱，當(dāng)pH值達(dá)到5.0時，暴露出更多的疏水基團(tuán)，從而使其疏水性增強(qiáng)。

3 討 論

Liu Yan等[19]指出酪蛋白膠束主要通過靜電作用、疏水相互作用和氫鍵作用而形成，Chakraborty等[15]認(rèn)為低pH值條件下，酪蛋白膠束由靜電相互作用形成，而且還指出酪蛋白分子先重排再展開，不同于其他球蛋白的構(gòu)象變化。有研究表明酪蛋白膠束在大約pH 5.90時，已出現(xiàn)模糊的凝膠輪廓。在pH 5.40～5.35 時，乳蛋白開始聚合，且隨著pH值的降低，凝膠應(yīng)力也逐步增強(qiáng)[20]。還有研究指出，在酸性條件下CN膠束主要是依靠疏水作用和氫鍵作用形成[17]。另外研究發(fā)現(xiàn)離子對酪蛋白膠束形成產(chǎn)生一定影響，在荷斯坦牛奶中添加NaCl可以提高酪蛋白膠束的水合作用[21-23]。而Huppertz等[24]認(rèn)為NaCl改變了酪蛋白膠束的理化性質(zhì)是由于NaCl中和了酪蛋白膠束表面電荷，從而改變了酪蛋白膠束的穩(wěn)定性。本實驗發(fā)現(xiàn)，隨著水牛奶CN質(zhì)量濃度的增大，CN環(huán)境中離子強(qiáng)度的增大、pH值的降低，在靜電作用、疏水相互作用和氫鍵作用下，水牛奶CN分子結(jié)構(gòu)遭到破壞，CN發(fā)生折疊、重排，疏水基團(tuán)暴露，ANS熒光強(qiáng)度呈顯著增強(qiáng)趨勢。這些結(jié)果表明改變酪蛋白所處環(huán)境的離子強(qiáng)度、pH值均可影響酪蛋白膠束的結(jié)構(gòu)。水牛奶酸化形成凝膠過程中，其膠束結(jié)構(gòu)均發(fā)生變化，進(jìn)而影響酸乳凝膠的質(zhì)構(gòu)特性，且乳蛋白含量對其凝膠形成也有一定的影響。

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Structure of Casein Micelles from Buffalo Milk Determined by Fluorescence Spectroscopy

YANG Tong-xiang1,2, CHEN Jun-liang1, WU Kong-yang3, LI Quan-yang2, LI Zhi-li1, KANG Huai-bin1
(1. College of Food and Bioengineering, Henan University of Science and Technology, Luoyang 471023, China; 2. Institute of Light Industry and Food Engineering, Guangxi University, Nanning 530004, China; 3. College of Life Science, Luoyang Normal University, Luoyang 471022, China)

The structure of casein micelles from buffalo milk was analyzed by fluorescence spectroscopy with the extrinsic fluorescent probe 8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid (ANS) and the intrinsic fluorophore tryptophan (Trp). The results showed that the effect of buffalo milk protein at low concentration on the structure of casein micelles was obvious. As the structure of casein micelles was broken, the hydrophobic groups were exposed to the solvent with high protein concentration. In addition, the structure of casein micelles was influenced evidently at higher ionic strength and lower pH level, which could cause exposure of hydrophobic groups of casein to the solvent so that the casein micelles could be formed by the expansion and aggregation of casein microspheres.

casein; micelles structure; fluorescence spectroscopy

TS252

A

1002-6630（2014）23-0084-04

10.7506/spkx1002-6630-201423017

2013-12-18

河南科技大學(xué)博士科研啟動基金項目（09001785）；國家自然科學(xué)基金面上項目（31071576）

楊同香（1984—），女，講師，博士，研究方向為乳品科學(xué)與工程。E-mail：txyamy@163.com