郭旭光，鄭子棟，郭海波（.河南省食品藥品檢驗所，鄭州 450003；.河南省藥品審評認(rèn)證中心，鄭州450004）

HPLC法測定曲安奈德益康唑乳膏中的有關(guān)物質(zhì)

郭旭光1＊，鄭子棟1，郭海波2（1.河南省食品藥品檢驗所，鄭州 450003；2.河南省藥品審評認(rèn)證中心，鄭州450004）

目的：建立測定曲安奈德益康唑乳膏中有關(guān)物質(zhì)的方法。方法：采用高效液相色譜法。色譜柱為VenusilASBC18，流動相A、B分別為甲醇-0.077%醋酸銨溶液（20∶80，V/V，磷酸調(diào)節(jié)pH至4.5）和甲醇-乙腈（40∶60，V/V），梯度洗脫，流速為1.0m l/min，檢測波長為225 nm，柱溫為35℃，進(jìn)樣量為10μl。結(jié)果：曲安西龍、硝酸咪康唑以及3個單個未知雜質(zhì)均能與曲安奈德益康唑乳膏中的主成分完全分離；曲安西龍、硝酸咪康唑的檢測質(zhì)量濃度分別在1.071～8.568、1.039～8.312μg/m l范圍內(nèi)與各自峰面積積分值呈良好的線性關(guān)系（r＝0.999 8、0.999 6），檢測限分別為5.15、7.31 ng，定量限分別為15.69、21.97 ng。結(jié)論：該方法靈敏、準(zhǔn)確、專屬性強(qiáng)、重復(fù)性好，可用于曲安奈德益康唑乳膏的質(zhì)量控制。

高效液相色譜法；梯度洗脫；曲安奈德益康唑乳膏；有關(guān)物質(zhì)

曲安奈德益康唑乳膏具有廣譜抗真菌、抗炎、抗過敏和止癢功效，臨床廣泛用于真菌引起的皮膚病[1]，其有關(guān)物質(zhì)主要有曲安西龍、硝酸咪康唑以及3個單個未知雜質(zhì)。該藥雖然收載于《中國藥典》2010版（二部）[2]，但其檢測項下并未規(guī)定對曲安奈德益康唑乳膏的有關(guān)物質(zhì)進(jìn)行檢測。因此，筆者參考相關(guān)文獻(xiàn)[2-10]，建立了高效液相色譜（HPLC）法梯度洗脫測定曲安奈德益康唑乳膏有關(guān)物質(zhì)的方法，以更好地控制產(chǎn)品質(zhì)量。

1 材料

1.1 儀器

1100型HPLC儀，包括G1314A可變波長檢測器（VWD）、ChemStation色譜工作站等（美國Agilent公司）；ME235S電子天平（德國Sartorius公司）。

1.2 藥品與試劑

曲安奈德、硝酸益康唑、苯甲酸、曲安西龍、硝酸咪康唑?qū)φ掌罚ㄖ袊称匪幤窓z定研究院，批號：100055-200302、100214-200903、100419-200301、100333-200201、100213-200705，質(zhì)量分?jǐn)?shù)均為100%）；曲安奈德益康唑乳膏（市售，批號：130101、 130102、130103）；甲醇、乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純，水為重蒸水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Venusil ASB C18（250 mm×4.6mm，5μm）；流動相：甲醇-0.077%醋酸銨溶液（20∶80，V/V，磷酸調(diào)節(jié)pH至4.5）為流動相A，甲醇-乙腈（40∶60，V/V）為流動相B，采用梯度洗脫（梯度洗脫程序見表1）；柱溫：35℃；流速：1.0m l/m in；檢測波長：225 nm；進(jìn)樣量：10μl。

表1 梯度洗脫程序Tab 1 Program of gradient elution

2.2 溶液的制備

2.2.1 系統(tǒng)適用性溶液 取硝酸益康唑、硝酸咪康唑、曲安奈德、曲安西龍和苯甲酸對照品適量，制成質(zhì)量濃度均為0.2mg/ m l的溶液，即得。

2.2.2 供試品溶液 精密稱取曲安奈德益康唑乳膏約1 g，置于10m l量瓶中，加甲醇適量，50℃水浴加熱并振搖使溶解，放至室溫，加甲醇定容至刻度，搖勻，冰浴1 h，濾過，取續(xù)濾液放至室溫，即得。

2.2.3 空白基質(zhì)溶液 取缺少苯甲酸、曲安奈德和硝酸益康唑的空白基質(zhì)，按“2.2.2”項下方法制備溶液，即得。

2.2.4破壞性試驗貯備液 精密稱取樣品5.106 1 g，置于25 m l量瓶中，加甲醇適量，50℃水浴使溶解，放至室溫，加甲醇定容至刻度，搖勻，冰浴1 h，濾過，取續(xù)濾液放至室溫，即得。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗

取“2.2.1”項下系統(tǒng)適用性溶液適量，按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，色譜見圖1。結(jié)果，相鄰峰的分離度均大于1.5，表明系統(tǒng)適用性試驗結(jié)果符合要求。

圖1 高效液相色譜圖1.苯甲酸；2.曲安奈德；3.硝酸益康唑；4.曲安西龍；5.硝酸咪康唑Fig 1 HPLC chrom atogram s1.benzoic acid；2.triamcinolone acetonide；3.econazole nitrate；4.triamcinolone；5.m iconazole nitrate

2.4 專屬性試驗

2.4.1 空白基質(zhì)干擾試驗 取“2.2.3”項下空白基質(zhì)溶液適量，按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，色譜見圖2。由圖2G可見，空白基質(zhì)不干擾有關(guān)物質(zhì)的測定。

2.4.2破壞性試驗 （1）酸破壞：取“2.2.4”項下貯備液2m l，加入1mol/L的鹽酸溶液1m l，放置1 h，用1mol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)pH至中性，搖勻，按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定。（2）堿破壞：取“2.2.4”項下貯備液2m l，加0.2 mol/L的氫氧化鈉溶液1m l，放置1 h，用1mol/L的鹽酸溶液調(diào)pH至中性，用甲醇稀釋至4m l，搖勻，按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定。（3）氧化破壞：取“2.2.4”項下貯備液2m l，加30%雙氧水1m l，搖勻，放置5 h，用甲醇稀釋至4m l，搖勻，按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定。（4）高溫破壞：取“2.2.4”項下貯備液2m l，置于密封小瓶中，100℃烘箱中放置5 h，取出，放至室溫，用甲醇稀釋至4m l，搖勻，按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定。（5）光照破壞：取“2.2.4”項下貯備液2m l，置于透明密封小瓶中，4 000 lx下照射8 h，用甲醇稀釋至4m l，按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定。破壞性試驗色譜見圖2。由圖2可見，酸、堿、氧化、高溫、光照破壞條件下的降解產(chǎn)物峰與主峰分離均良好。

2.5 線性關(guān)系考察

精密稱取苯甲酸對照品10.92mg，置于10m l量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，精密吸取5m l，置于50m l量瓶中。精密稱取曲安奈德對照品11.48mg，置于10m l量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，精密吸取1m l，置于同一50m l量瓶中。精密稱取硝酸益康唑?qū)φ掌?2.74mg、曲安西龍對照品10.71mg和硝酸咪康唑?qū)φ掌?0.39mg，置于上述同一50m l量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取5m l，置于50m l量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，再精密量取1、3、4、5、6、8m l，分別置于10m l量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜。以質(zhì)量濃度（x，μg/m l）為橫坐標(biāo)，峰面積（y）為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，回歸方程和線性范圍見表2。

圖2 專屬性試驗高效液相色譜圖A.酸破壞樣品；B.堿破壞樣品；C.氧化破壞樣品；D.高溫破壞樣品；E.光破壞樣品；F.未破壞樣品；G.空白基質(zhì)；1.苯甲酸；2.曲安奈德；3.硝酸益康唑Fig 2 HPLC chromatograms of destruction testsA.destroyed by acid；B.destroyed by alkali；C.destroyed by oxidization；D.destroyed by heat；E.destroyed by light；F.undestroyed；G. blank matrix；1.benzoic acid；2.triamcinolone acetonide；3.econazole nitrate

表2 回歸方程和線性范圍（n＝6）Tab 2 Regression equation and linear range（n＝6）

2.6 檢測限和定量限試驗

以信噪比3∶1測得苯甲酸、曲安奈德、硝酸益康唑、曲安西龍和硝酸咪康唑的檢測限分別為1.11、3.27、5.59、5.15、7.31 ng；以信噪比10∶1測得各成分定量限分別為3.28、9.77、17.03、 15.69、21.97 ng。

2.7 精密度試驗

取“2.2.1”項下的系統(tǒng)適用性溶液適量，分別連續(xù)進(jìn)樣6次測定。結(jié)果，苯甲酸、曲安奈德、硝酸益康唑、曲安西龍和硝酸咪康唑峰面積的RSD分別為0.5%、0.5%、0.6%、0.7%和0.6%，說明儀器精密度良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗

取樣品（批號：130101）適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，在常溫下放置0、2、4、6、8、12 h時進(jìn)樣測定。結(jié)果，樣品的雜質(zhì)峰數(shù)目、單個雜質(zhì)的峰面積和總雜質(zhì)峰面積（RSD＝0.09%）均無明顯變化，說明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.9 重復(fù)性試驗

取樣品（批號：130101）適量，共6份，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣，測定總雜質(zhì)峰面積。結(jié)果，總雜質(zhì)峰面積平均值為34 654.4，RSD＝0.7%，說明本方法重復(fù)性較好。

2.10 耐用性試驗

分別選用VenusilASB C18（250mm×4.6mm，5μm）和Agilent ZORBAX Eclipse XDB C18（250mm×4.6mm，5μm）在2臺儀器上測定3批樣品的有關(guān)物質(zhì)。結(jié)果，不同色譜柱檢測到的雜質(zhì)峰數(shù)目、出峰順序、分離效果和總雜質(zhì)峰面積（RSD＝0.17%）均無明顯變化，說明本方法耐用性良好。

2.11 樣品有關(guān)物質(zhì)測定

采用主成分自身對照法測定樣品中的有關(guān)物質(zhì)。取3批樣品，按照“2.2.2”項下方法制備供試品溶液。精密量取供試品溶液1m l，置于100m l量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為對照溶液。精密量取對照溶液10μl，注入HPLC儀，調(diào)節(jié)檢測靈敏度，使主成分色譜峰的峰高約為滿量程的20%。取上述供試品溶液、對照溶液和“2.2.1”項下系統(tǒng)適用性溶液適量，按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣。系統(tǒng)適用性溶液中相鄰峰的分離度均不應(yīng)小于1.5；供試品溶液色譜中如有雜質(zhì)峰，除去空白基質(zhì)峰及苯甲酸、曲安奈德和硝酸益康唑峰外，單個雜質(zhì)峰的峰面積不得大于對照溶液中硝酸益康唑峰面積的0.5倍（0.5%），而各雜質(zhì)峰的面積之和不得大于對照溶液中硝酸益康唑峰面積的1.5倍（1.5%）。結(jié)果表明，3批樣品有關(guān)物質(zhì)均符合規(guī)定，詳見表3。

表3 樣品有關(guān)物質(zhì)測定結(jié)果（%）Tab 3 Content determ ination of related substances（%）

3 討論

3.1 流動相梯度洗脫程序的選擇

筆者比較了3種不同的流動相梯度洗脫程序。結(jié)果，本研究選取的流動相梯度洗脫程序各主成分峰之間均能完全分離，且對稱性良好。

3.2 流動相A的pH選擇

因本研究流動相要分離的組分中酸性組分多，所以流動相的pH對分離效果影響較明顯。筆者比較了流動相A的不同pH（pH 4.3、pH 4.5、pH 4.7），結(jié)果顯示流動相A的pH在4.3～4.7范圍內(nèi)均滿足系統(tǒng)適用性要求，但以pH 4.5最佳。

3.3 檢測波長的選擇

本品中硝酸益康唑的處方量為曲安奈德的10倍，故有關(guān)物質(zhì)檢測以硝酸益康唑的雜質(zhì)為主要雜質(zhì)，曲安奈德的雜質(zhì)為次要雜質(zhì)。檢測波長選擇主要考慮到硝酸益康唑雜質(zhì)的最大檢出。筆者參考相關(guān)文獻(xiàn)[2-4]，發(fā)現(xiàn)硝酸益康唑引入的雜質(zhì)主要為硝酸咪康唑及硝酸益康唑雜質(zhì)A、B、C（即單個未知雜質(zhì)1、2、3），且225 nm波長為其最大吸收波長，因此本研究選擇225 nm波長為有關(guān)物質(zhì)的檢測波長。

3.4 雜質(zhì)限度的確定

《中國藥典》2010年版（二部）硝酸益康唑有關(guān)物質(zhì)檢測項下提及的唯一雜質(zhì)為硝酸咪康唑，要求其與主峰的分離度大于8.0（本方法的實測分離度為15.2），要求單個雜質(zhì)不得過0.2%，總雜質(zhì)不得過0.5%；曲安奈德有關(guān)物質(zhì)檢測項下提及曲安奈德引入的主要雜質(zhì)為曲安西龍，規(guī)定單個雜質(zhì)不得過0.3%，總雜質(zhì)不得過0.8%，但未對曲安西龍與曲安奈德的分離度進(jìn)行規(guī)定。本研究3批樣品有關(guān)物質(zhì)測定結(jié)果顯示，單個雜質(zhì)均小于0.3%，總雜質(zhì)均小于1.0%，故擬定本品有關(guān)物質(zhì)限度為：單個雜質(zhì)不得大于0.5%，總雜質(zhì)不得過1.5%。

綜上所述，本方法靈敏、準(zhǔn)確、專屬性強(qiáng)、重復(fù)性好，可用于曲安奈德益康唑乳膏的質(zhì)量控制。

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Determ ination of Related Substance in Triam cinolone Acetonide and Econazole Nitrate Cream by HPLC

GUO Xu-guang1，ZHENG Zi-dong1，GUO Hai-bo2（1.Henan Provincial Institute for Food and Drug Control，Zhengzhou 450003，China；2.Henan Center for Drug Evaluation and Certification，Zhengzhou 450004，China）

OBJECTIVE：To establish amethod for the content determination of related substances in Triamcinolone acetonide and econazole nitrate cream.METHODS：HPLC method was adopted.The determination was performed on Venusil ASB C18column w ith mobile phase A composed of methanol-0.077%ammonium acetate（20∶80，V/V，pH value adjusted to 4.5 using phosphoric acid）and methanol-acetonitrile（40∶60，V/V）asmobile phase B（gradient elution）at the flow rate of 1.0 m l/m in.The detection wavelength was 225 nm，and the column temperature was 35℃.The sample size was 10μl.RESULTS：Fluoxyprednisolone and m iconazole nitrate and unknown impurity were completely separated from main components of Triamcinolone acetonide and econazole nitrate cream.The linear range of 2 kinds of known impurities were 1.071-8.568μg/m l（r＝0.999 8）and 1.039-8.312 μg/m l（r＝0.999 6）.The detection lim its were 5.15 ng and 7.31 ng，and quantitative lim its were 15.69 ng and 21.97 ng.CONCLUSIONS：Themethod is sensitive，accurate specific and reproducible，which can be used for the quality control of related substance in Triamcinolone acetonide and econazole nitrate cream.

HPLC；Gradient elution；Triamcinolone acetonide and econazole nitrate cream；Related substances

R917

A

1001-0408（2014）12-1134-03

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2014.12.27

＊主管藥師，碩士。研究方向：食品藥品質(zhì)量控制。電話：0371-63388290。E-mail：gxg0371@126.com

2013-09-30

2014-01-25）