陳 紅，朱 蓉（成都市食品藥品檢測中心，成都 610045）

HPLC法測定異丙托溴銨原料藥中的有關物質(zhì)

陳 紅＊，朱 蓉（成都市食品藥品檢測中心，成都 610045）

目的：建立測定異丙托溴銨原料藥中有關物質(zhì)的方法。方法：采用高效液相色譜法。色譜柱為SHISEIDO C18，流動相為磷酸鹽溶液（含0.1mol/L磷酸二氫鈉和0.01mol/L四丙基氯化銨，pH 5.5）-甲醇（87∶13，V/V），流速為1m l/min，檢測波長為220 nm，柱溫為40℃，進樣量為5μl。結(jié)果：異丙托溴銨和雜質(zhì)B、C、D、E檢測質(zhì)量濃度分別在6.24～62.4、4.25～53.1、4.59～57.4、10.35～129.4、4.00～50.01μg/m l范圍內(nèi)與各自峰面積積分值呈良好的線性關系（r＝0.999 6、0.999 0、0.999 8、0.999 7、0.999 7）；精密度、穩(wěn)定性、重復性試驗的RSD＜10%；雜質(zhì)B、C、D、E平均加樣加收率分別為103.8%、104.3%、101.6%、104.4%，RSD分別為3.8%、2.2%、1.8%、3.5%（n＝9）。結(jié)論：該方法準確、簡便、快速，可用于異丙托溴銨原料藥中有關物質(zhì)的測定。

異丙托溴銨；有關物質(zhì)；高效液相色譜法

支氣管哮喘是呼吸系統(tǒng)常見病、多發(fā)病，其發(fā)病與多種細胞因子和炎性介質(zhì)的表達異常有關[1]。異丙托溴銨是一種具有抗膽堿能（副交感）特性的四價銨化合物，可競爭性抑制乙酰膽堿對氣道平滑肌的收縮作用，通過抑制細胞內(nèi)環(huán)磷酸鳥苷（cGMP）生成，減少cAMP降解，降低細胞內(nèi)鈣離子濃度，使氣道平滑肌松弛、肥大細胞釋放炎性介質(zhì)減少，終止氣道擴張，呼吸阻力減小[2]。異丙托溴銨可聯(lián)合布地奈德、沙丁胺醇、氨溴索治療小兒毛細支氣管炎和哮喘，能迅速改善癥狀，縮短病程，療效顯著[2-4]。有研究以乙腈-0.25%庚烷磺酸鈉溶液（pH 3.2）為流動相測定了吸入用異丙托溴銨溶液的有關物質(zhì)[5]，但并未對其原料藥中的有關物質(zhì)進行定量檢測。因此，筆者采用高效液相色譜（HPLC）法對異丙托溴銨原料藥中的有關物質(zhì)進行測定，以為其質(zhì)量控制提供參考。

1 材料

2695型HPLC儀，含2988型二極管陣列檢測器（美國Waters公司）；BP211D型電子天平（德國Sartorius公司）。

異丙托溴銨及其雜質(zhì)A、B、C、D、E對照品（四川大冢制藥有限公司，批號：WS/IPRA-BP/05、NPRS/IPTBR IMPA/12/01、1025862、NPRS/IPTBR IMAC/12/01、09080337、PID/IB-VI/ 100。雜質(zhì)A：（1R，3r，5S，8r）-3-羥基-8-甲基-8-（1-甲基乙基）-8-氮雜雙環(huán)[3.2.1]辛烷；雜質(zhì)B：（1R，3r，5S，8s）-3-{[（2RS）-3-羥基-2-苯丙酰]氧代}-8-甲基-8-（1-甲基乙基）-8-氮雜雙環(huán)[3.2.1]辛烷；雜質(zhì)C：（2RS）-3-羥基-2-苯丙酸（DL-托品酸）；雜質(zhì)D：2-苯基丙烯酸（阿托酸）；雜質(zhì)E：（1R，3r，5S）-8-氮雜雙環(huán)[3.2.1]辛烷基（2RS）-3-羥基-2-苯基丙酸乙酯）；異丙托溴銨原料藥（四川大冢制藥有限公司，批號：IB-10002、IB-11001、IB-11002）；四丙基氯化銨、甲醇為色譜純，其余試劑為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：SHISEIDO C18（4.6mm×150mm，5μm）；流動相：磷酸鹽溶液（含0.1mol/L磷酸二氫鈉和0.01mol/L四丙基氯化銨，pH 5.5）-甲醇（87∶13，V/V）；檢測波長：220 nm；柱溫：40℃；進樣量：5μl；流速：1m l/min。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液 稱取異丙托溴銨對照品適量，用流動相溶解并稀釋，制成每1m l含0.02 mg的溶液，搖勻，作為對照品溶液。

2.2.2 雜質(zhì)混合對照品溶液 精密稱取雜質(zhì)B、C、D、E對照品約5mg，置于25m l量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取1m l置于10m l量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，作為雜質(zhì)混合對照品溶液。

2.2.3供試品溶液 稱取樣品約100mg，分別置于10m l量瓶中，加流動相溶解并稀釋制成每1m l中約含10mg的溶液，作為供試品溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗

取“2.2”項下對照品溶液（與雜質(zhì)混合對照品溶液混合）和供試品溶液各5μl，分別注入HPLC儀，記錄色譜，詳見圖1。結(jié)果，雜質(zhì)C、異丙托溴銨和雜質(zhì)B、D、E之間的分離度依次為8.9、4.4、5.6、3.8；異丙托溴銨和雜質(zhì)B、C、D、E理論板數(shù)分別為6 748、7 591、8 189、8 914、8 047。

圖1 高效液相色譜圖A.對照品+雜質(zhì)混合對照品；B.供試品Fig 1 HPLC chrom atogram sA.substance control+impurity and m ixed control；B.test samples

2.4 專屬性試驗

為了考察該方法能否有效檢測出異丙托溴銨在生產(chǎn)及貯存過程中可能產(chǎn)生的降解產(chǎn)物，根據(jù)藥物結(jié)構(gòu)特點、合成工藝及貯存條件等，進行了以下強制降解試驗，以驗證分析方法對相關降解產(chǎn)物檢查的專屬性。

2.4.1強堿破壞試驗 取樣品100mg，置于10m l量瓶中，加0.1mol/L氫氧化鈉溶液1m l，放置1 h后，用0.1mol/L鹽酸溶液中和至中性，加流動相稀釋至刻度，搖勻。取此溶液適量，注入HPLC儀，記錄色譜，詳見圖2A。由圖2A可見，雜質(zhì)C面積明顯增加，在相對保留時間4.6處有一明顯雜質(zhì)峰，記為雜質(zhì)F。

2.4.2高溫破壞試驗 取樣品100mg，置于10m l量瓶中，于60℃加熱1.5 h，精密取此樣品1m l，置于10m l量瓶中，加流動相溶解稀釋至刻度，搖勻。取此溶液適量，注入HPLC儀，記錄色譜，詳見圖2 B。由圖2B可見，雜質(zhì)C峰面積略有增加。

2.4.3強酸、強氧化劑、強光照射破壞試驗 （1）取樣品100 mg，置于10m l量瓶中，加0.1mol/L鹽酸溶液1m l，放置0.5 h后，用0.1mol/L氫氧化鈉溶液中和至中性，加流動相稀釋至刻度，搖勻，備用；（2）取樣品100mg，置于10m l量瓶中，加0.3%過氧化氫溶液1m l，放置0.5 h后，加流動相稀釋至刻度，搖勻，備用；（3）取樣品100mg，置于10m l量瓶中，置于4 000 lx條件下強光照射48 h后，取此溶液適量，置于10m l量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，備用。取上述3種溶液適量，分別注入HPLC儀，記錄色譜圖，詳見圖2 C、D、E。由圖2 C、D、E可見，未見有明顯的雜質(zhì)峰出現(xiàn)。

圖2 破壞試驗高效液相色譜圖A.堿破壞樣品；B.高溫破壞樣品；C.酸破壞樣品；D.氧化破壞樣品；E.光照破壞樣品Fig 1 HPLC chromatogram s of treated testA.treated w ith alkali；B.treated w ith high temperature；C.treated w ith acid；D.treated w ith oxidation；E.treated w ith light

上述破壞試驗證明在此色譜條件下能有效考察各雜質(zhì)，且與主峰完全分離。本品為溴化物，采用0.2%的溴化鉀溶液進樣，溶劑峰處出現(xiàn)的大雜質(zhì)峰為溴離子峰，在結(jié)果計算中應扣除。上述試驗結(jié)果表明，本方法具有良好的專屬性，適用于本品在生產(chǎn)及貯存過程中因各種影響所產(chǎn)生的有關物質(zhì)檢查。

2.5 線性關系考察

將“2.2”項下對照品溶液與雜質(zhì)混合對照品溶液混合后，精密量取10、6、4、2、1m l，置于10m l量瓶中，用流動相稀釋至刻度，得系列不同濃度的溶液。以檢測質(zhì)量濃度（x，μg/m l）為橫坐標，峰面積（y）為縱坐標，進行線性回歸，線性范圍和回歸方程見表1。

表1 線性范圍和回歸方程Tab 1 Linear range and regression equation

2.6 檢測限和定量限

將“2.2”項下對照品溶液與雜質(zhì)混合對照品溶液混合后，取適量用流動相稀釋后按“2.1”項下色譜條件進樣，記錄色譜，以信噪比S/N＝3∶1計算異丙托溴銨和雜質(zhì)B、C、D、E的檢測限，以信噪比S/N＝10∶1計算異丙托溴銨和雜質(zhì)B、C、D、E的定量限，結(jié)果見表2。

表2 各雜質(zhì)檢測限和定量限結(jié)果Tab 2 Results of detection lim its and quantification lim it

2.7 精密度試驗

取“2.2.2”項下雜質(zhì)混合對照品溶液5μl，按“2.1”項下色譜條件重復進樣測定6次。結(jié)果，雜質(zhì)B、C、D、E的RSD均＜2.0%，表明儀器精密度良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗

取“2.2.2”項下雜質(zhì)混合對照品溶液適量，按“2.1”項下色譜條件，于25℃，分別放置0、2、7、10、24 h時進樣測定。結(jié)果，雜質(zhì)B、C、D、E的RSD均＜2.0%，表明雜質(zhì)混合對照品溶液在24 h內(nèi)質(zhì)量穩(wěn)定。

2.9 重復性試驗

取樣品（批號：IB-10002）適量，共6份，分別按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣測定。結(jié)果，異丙托溴銨和雜質(zhì)B、C、D、E的RSD均＜10%，表明本方法重復性良好。

2.10 加樣回收率試驗

精密稱取樣品（批號：IB-10002）約100mg，共9份，分別置于10m l量瓶中，每3份分別加入雜質(zhì)混合對照品溶液1、2.5、4 m l，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，計算加樣回收率，結(jié)果見表3。

2.11 耐用性試驗

分別選用3根不同型號色譜柱，分別以流速為1、1.5m l/ min作有關物質(zhì)的檢查，結(jié)果，雜質(zhì)B、C、D、E平均相對保留時間基本相同（偏差＜20%），雜質(zhì)之間及與主成分間均能達到較好分離（分離度＞3），結(jié)果見表4。

2.12 樣品有關物質(zhì)測定

分別取3批樣品適量，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，并按“2.1”項下色譜條件進樣測定，計算有關物質(zhì)的量，結(jié)果見表5。

3 討論

3.1 檢測波長的選擇

將含異丙托溴銨和雜質(zhì)B、C、D、E的對照品溶液在210～400 nm波長范圍內(nèi)進行二極管陣列掃描。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，異丙托溴銨和雜質(zhì)B、C、E均未見有明顯吸收，只有雜質(zhì)D在242 nm波長處有最大吸收。但是，在220 nm波長處異丙托溴銨和雜質(zhì)B、C、D、E均有較大吸收。因此，選擇220 nm波長為檢測波長。

3.2 進樣濃度和色譜記錄時間的選擇

異丙托溴銨為苯基丙酰結(jié)構(gòu)，異丙托溴銨及其雜質(zhì)共軛基團少，紫外吸收弱，因此配制約10mg/m l濃度的樣品溶液測定時色譜峰各效能參數(shù)均能達到測定要求。樣品經(jīng)強堿破壞后，雜質(zhì)明顯增加，在相對保留時間4.6處有一明顯雜質(zhì)峰。有文獻[6]報道，樣品在相當于主成分峰保留時間的5.1倍處有一雜質(zhì)峰，記為雜質(zhì)F。因此，將記錄時間定為主成分峰保留時間的6倍。

3.3 其他雜質(zhì)檢查

異丙托溴銨主要雜質(zhì)有A、B、C、D、E、F。其中，雜質(zhì)A極性強，在色譜柱中幾乎無保留，因此筆者采用薄層色譜法單獨檢查；另外，因未得到雜質(zhì)F對照品，未進行檢測。

3.4 樣品溶液的穩(wěn)定性

在溶液穩(wěn)定性考察中，當樣品在25℃下放置0～24 h時，測定發(fā)現(xiàn)雜質(zhì)C的峰面積增加，24 h內(nèi)雜質(zhì)C增加量＜0.02%，總雜質(zhì)量由0.04%增至0.07%。當樣品在25℃下及時進樣（0 h），雜質(zhì)C低于檢測限；當樣品在低溫（約10℃）下進樣時，均未檢出雜質(zhì)C；當樣品在室溫（25℃）放置較長時間（約5 d）時，雜質(zhì)C增加量小于0.1%。考慮到樣品在24 h內(nèi)雜質(zhì)C增加量＜0.02%，在8 h內(nèi)不影響總雜質(zhì)量結(jié)果，故本方法在常溫下測定可行。

表3 加樣回收率試驗結(jié)果（n＝9）Tab 3 Results of recovery tests（n＝9）

表4 不同色譜柱測定的平均相對保留時間Tab 4 Relative retention times of different columns

表5 樣品有關物質(zhì)測定結(jié)果（n＝3,%）Tab 5 The determ ination of related substance in sam p les（n＝3,%）

綜上所述，本方法準確、簡便、快速，可用于異丙托溴銨原料藥中有關物質(zhì)的測定。

[1] 劉莉敏，謝艷麗，王以炳，等.異丙托溴銨聯(lián)合舒利迭治療重度哮喘的療效[J].臨床肺科雜志，2013，18（1）：80.

[2] 楊嵐.復方異丙托溴銨聯(lián)合布地奈德混懸液治療兒童急性哮喘發(fā)作的療效評價[J].中國醫(yī)藥科學，2013（18）：108.

[3] 劉海平.布地奈德、沙丁胺醇、異丙托溴銨三聯(lián)吸入治療小兒毛細支氣管炎的療效觀察[J].中國醫(yī)藥指南，2013，11（19）：532.

[4] 滕箭，趙煒，王建華，等.吸入用布地奈德混懸液和吸入用異丙托溴銨溶液霧化吸入治療慢性阻塞性肺疾病的療效分析[J].中國現(xiàn)代醫(yī)藥雜志，2013，15（4）：18.

[5] 盧來春，張蓉，劉同華，等.反相高效液相色譜法測定吸入用異丙托溴銨溶液中的有關物質(zhì)[J].重慶醫(yī)學，2007，36（11）：1 067.

[6]European pharmacopeia.EP7.0[S].2012：2 277.

Determ ination of Related Substances in Ipratropium Brom ide by HPLC

CHEN Hong，ZHU Rong（Chengdu Center for Food and Drug Control，Chengdu 610045，China）

OBJECTIVE：To establish a method for the determ ination of related substances in ipratropium bromide.METHODS：HPLC method was adopted.The determination was performed on SHISEIDO C18column w ith mobile phase consisted of phosphate solution（containing 0.1mol/Lmonosodium orthophosphate and 0.01mol/L tetrapropylammonium chloride，pH 5.5）-methanol（87∶13，V/V）at the flow rate of 1 m l/min.The detection wavelength was set at 220 nm.The column temperature was 40℃and sample size was 5μl.RESULTS：The linear range of ipratropium brom ide and impurities B，C，D and E were 6.24-62.4μg/m l（r＝0.999 6），4.25-53.1μg/m l（r＝0.999 0），4.59-57.4μg/m l（r＝0.999 8），10.35-129.4μg/m l（r＝0.999 7）and 4.00-50.01μg/m l（r＝0.999 7），respectively.RSDs of precision，stability and reproducibility tests were all lower than 10%.Average recoveries of impurities B，C，D and E were 103.8%（RSD＝3.8%，n＝9），104.3%（RSD＝2.2%，n＝9），101.6%（RSD＝1.8%，n＝9）and 104.4%（RSD＝3.5%，n＝9），respectively.CONCLUSIONS：Themethod is accurate，simple and rapid，and can be used for the determ ination of related substances in ipratropium brom ide.

Ipratropium brom ide；Related substance；HPLC

R917

A

1001-0408（2014）12-1128-04

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2014.12.25

＊副主任藥師，碩士。研究方向：藥物分析與質(zhì)量控制。電話：028-85362213。E-mail：redchen333@sohu.com

2013-06-14

2013-10-06）