陳 岑，王曉可，毋福海（廣東藥學院，廣州 510224）

毛細管電泳法同時測定清肺抑火丸中5種蒽醌類成分的含量Δ

陳 岑＊，王曉可，毋福海#（廣東藥學院，廣州 510224）

目的：建立同時測定清肺抑火丸中5種蒽醌類成分大黃素、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃酚、大黃素甲醚含量的方法。方法：采用毛細管電泳法，以對乙酰氨基酚為內標。毛細管柱為未涂層彈性融硅石英毛細管柱，運行緩沖液為25mmol/L硼砂溶液+20 mmol/L十二烷基磺酸鈉+4mmol/L磺丁基醚-β-環(huán)糊精+2%甲醇（pH 10.01），分離電壓為18 kV，進樣方式為重力進樣10 s（高度15 cm），檢測波長為254 nm，溫度為25℃，濕度為＜70%。結果：大黃素、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃酚、大黃素甲醚檢測質量濃度分別在5.0～40.0、2.4～19.2、3.6～28.8、11.2～89.9、2.5～20.0μg/m l范圍內同各自峰面積與內標峰面積比值呈良好的線性關系（r＝0.998 0、0.997 1、0.996 9、0.998 5、0.998 3）；精密度、穩(wěn)定性、重復性試驗的RSD≤2.40%；平均加樣回收率分別為96.6%、99.6%、99.2%、98.2%、98.6%，RSD分別為0.80%、1.32%、2.21%、1.63%、2.02%（n＝6）。結論：該方法專屬性強，結果準確、可靠，重復性好，可用于清肺抑火丸的質量控制。

毛細管電泳法；清肺抑火丸；大黃素；蘆薈大黃素；大黃酸；大黃酚；大黃素甲醚；含量測定

＊碩士研究生。研究方向：現代分析方法在中藥質量控制中的應用。E-mail：chencen30603086@163.com

#通信作者：教授，博士。研究方向：現代分析方法在中藥質量控制中的應用。E-mail：fuhaiwu@163.com

清肺抑火丸是由大黃、黃芩、黃柏、梔子、知母、浙貝母、桔梗、苦參、前胡和天花粉10味中藥制成的中藥成方制劑，具有清肺止咳、化痰通便之功效，臨床用于治療痰熱阻肺所致的咳嗽、痰黃稠黏、口干咽痛、大便干燥，以及急性上呼吸道感染、支氣管炎、咽炎、肺炎等。該藥現行標準采用高效液相色譜（HPLC）法測定黃芩苷含量[1]。曾有文獻報道采用薄層掃描法測定該藥中鹽酸小檗堿和菝葜皂苷元的含量[2]；采用HPLC法測定該藥中白花前胡甲素、鹽酸小檗堿、芒果苷和大黃酸、大黃素等4種蒽醌類成分含量[3-5]，以及黃芩苷等3種苷類成分含量[6]。而采用毛細管電泳法進行含量測定的研究較少見文獻報道。大黃為清肺抑火丸方中主藥，其化學成分主要有蒽醌類、大黃蒽類衍生物與葡萄糖結合成的苷類和蒽酮類如番瀉苷A、B、C、D等，以及其他苷類、鞣質、多糖化合物、有機化合物和無機化合物等。其中，蒽類衍生物是大黃中主要的活性成分，而蒽醌類成分大黃素、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃酚、大黃素甲醚一般作為大黃藥材及其制劑質量控制的指標性成分。本研究建立了同時測定清肺抑火丸中大黃素、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃酚、大黃素甲醚含量的毛細管電泳法，為清肺抑火丸的質量控制提供了新的依據。

1 材料

1.1 儀器

CL1030型高效毛細管電泳儀（北京彩陸科學儀器有限公司），配備K-2501型紫外-可見檢測器（德國Knauer公司）、HW-2000型色譜工作站2.17版（南京千譜軟件有限公司）；ORION MODEL 828型pH計（美國Orion公司）；KQ-400KDB型高功率數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；HA-202M型電子天平（日本AND公司）。

1.2 藥品與試劑

大黃素、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃酚、大黃素甲醚、對乙酰氨基酚對照品（中國食品藥品檢定研究院，供含量測定用，批號：110756-200110、110795-200806、110757-200206、110796-201017、110758-200912、100018-200408）；清肺抑火丸（甘肅佛仁制藥科技有限公司，批號：20090502、20090503、20100702，規(guī)格：6 g/袋）；磺丁基醚-β-環(huán)糊精（磺丁基醚-β-CD，山東新大精細化工有限公司，批號：080101，質量分數：99%）；十二烷基磺酸鈉（SDS）等試劑均為分析純，水為雙蒸水。

2 方法與結果

2.1 電泳條件

毛細管柱：未涂層彈性融硅石英毛細管柱（67 cm×75μm ID，有效長度60 cm）；運行緩沖液：25mmol/L硼砂溶液+20 mmol/L SDS+4mmol/L磺丁基醚-β-CD+2%甲醇（pH 10.01）；分離電壓：18 kV；進樣方式：重力進樣10 s（高度15 cm）；檢測波長：254 nm；溫度：25℃；濕度：＜70%。毛細管柱在使用前依次用0.1mol/L氫氧化鈉溶液、水、運行緩沖液各沖洗約5min。

2.2 溶液的制備

2.2.1 內標貯備液 精密稱取對乙酰氨基酚對照品適量，加甲醇溶解稀釋制成250μg/m l的內標貯備液。

2.2.2 對照品溶液 精密稱取大黃素、大黃酚對照品12.5、21.8mg，各置于50m l量瓶中，加甲醇溶解并定容，搖勻，得質量濃度分別為250、562μg/m l的大黃素、大黃酚對照品溶液；精密稱取蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素甲醚對照品12.1、18.1、12.6mg，分別置于100m l量瓶中，加甲醇溶解并定容，搖勻，得質量濃度分別為121、181、126μg/m l的蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素甲醚對照品溶液。

2.2.3 供試品溶液 取樣品適量，研碎，取約4.0 g，精密稱定，置100m l錐形瓶中，加2.5mol/L硫酸10m l，超聲處理（功率：250W，頻率：40 kHz）5m in，再加入三氯甲烷30m l，于70℃水浴回流1 h，冷卻，移至分液漏斗中，分取三氯甲烷層，揮干三氯甲烷，殘渣加乙醇20m l溶解，超聲處理（功率：250W，頻率：40 kHz）30min，濾過，水浴揮干乙醇，殘渣加甲醇溶解至25m l量瓶中，加入2.5m l內標貯備液，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，0.45μm微孔濾膜濾過，作為供試品溶液。

2.2.4 陰性對照溶液 取處方組成中除大黃外的其他藥材，制成不含大黃的陰性樣品，按“2.2.3”項下方法處理制成陰性對照溶液。

2.2.5 運行緩沖液 精密稱取硼砂3.81 g、磺丁基醚-β-CD 9.07 g、SDS 1.44 g，各置于100m l量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為貯備液。精密移取硼砂貯備液12.5m l、磺丁基醚-β-CD貯備液4m l、SDS貯備液20m l、甲醇1m l，置于50 m l量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，0.45μm微孔濾膜濾過，作為運行緩沖液。

2.3 專屬性試驗

分別吸取“2.2”項下對照品溶液（混合后加入內標貯備液）、供試品溶液、陰性對照溶液適量，按“2.1”項下電泳條件進樣測定，記錄色譜，詳見圖1。結果，在對照品色譜峰保留時間對應的位置上，供試品有色譜峰出現，且分離效果好，峰形對稱，而陰性對照無干擾。

圖1 毛細管電泳色譜圖A.混合對照品+內標；B.供試品；C.陰性對照；1.大黃素；2.蘆薈大黃素；3.大黃酸；4.大黃酚；5.大黃素甲醚；6.對乙酰氨基酚Fig 1 CE chromatogram sA.substance control+internal standard；B.test sample；C.negative control；1.emodin；2.aloe-emodin；3.rhein；4.chrysophanol；5.physcion；6.paracetamol

2.4 線性關系考察

分別吸取一定量的各對照品溶液，加甲醇稀釋成大黃素、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃酚、大黃素甲醚質量濃度分別為5.0、10.0、20.0、25.0、30.0、35.0、40.0μg/m l，2.4、4.8、9.6、12.1、14.4、16.8、19.6μg/m l，3.6、7.2、14.4、18.1、21.6、25.2、28.8μg/m l，11.2、22.5、45.0、56.2、67.4、78.7、89.9μg/m l，2.5、5.0、10.0、12.6、15.0、17.5、20.0μg/m l的系列溶液，加入適量內標貯備液使對乙酰氨基酚質量濃度為25μg/m l，分別進樣。以各成分峰與內標峰面積的比值（y）為縱坐標，對照品溶液質量濃度（x）為橫坐標，進行線性回歸，分別得大黃素的回歸方程y＝0.045 4x+ 0.172 1（r＝0.998 0）、蘆薈大黃素的回歸方程y＝0.099 3x+ 0.019 5（r＝0.997 1）、大黃酸的回歸方程y＝0.054 9x+0.060 6（r＝0.996 9）、大黃酚的回歸方程y＝0.148 6x－0.293 3（r＝0.998 5）、大黃素甲醚的回歸方程y＝0.092 0x+0.006 1（r＝0.998 3）。結果表明，大黃素、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃酚、大黃素甲醚檢測質量濃度分別在5.0～40.0、2.4～19.2、3.6～28.8、11.2～89.9、2.5～20.0μg/m l范圍內同各自峰面積與內標峰面積比值呈良好的線性關系。

2.5 精密度試驗

制備質量濃度分別為25.0、12.1、18.1、56.2、12.6μg/m l的大黃素、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃酚、大黃素甲醚對照品溶液，加入適量內標貯備液，分別進樣，連續(xù)測定5次，記錄峰面積并計算RSD。結果，5種成分峰面積與內標峰面積比值的RSD分別為1.08%、1.33%、2.40%、0.47%、1.05%，表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗

取供試品溶液（批號：20100702）適量，在放置0、2、4、6、8、 10、12 h時分別進樣，記錄大黃素、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃酚、大黃素甲醚的峰面積并計算RSD。結果，5種成分峰面積與內標峰面積比值的RSD分別為1.28%、2.13%、1.41%、0.99%、2.22%，表明供試品溶液在12 h內質量穩(wěn)定。

2.7 重復性試驗

取樣品（批號：20100702）適量，共6份，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，并按“2.1”項下電泳條件進樣，測定并計算大黃素、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃酚、大黃素甲醚的含量及RSD。結果，含5種成分的量平均分別為0.146、0.073、0.112、0.330、0.081mg/g，RSD分別為1.33%、0.72%、2.12%、2.26%、1.11%，表明本法重復性好。

2.8 加樣回收率試驗

精密稱取同一批號樣品（批號：20100702）適量，共6份，加入相應量的大黃素、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃酚、大黃素甲醚對照品，按“2.2.3”項下方法處理并按“2.1”項下電泳條件進樣測定，計算加樣回收率及RSD，結果見表1。

表1 加樣回收率試驗結果（n＝6）Tab 1 Results of recovery tests（n＝6）

2.9 樣品含量測定

取樣品3批，按“2.2.3”項下方法處理后，按“2.1”項下電泳條件進樣測定，記錄峰面積，代入回歸方程計算其中大黃素、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃酚、大黃素甲醚的含量及RSD，結果見表2。

表2 樣品含量測定結果（n＝3）Tab 2 Results of content determ ination of sam p les（n＝3）

3 討論

3.1 供試品提取條件的選擇

大黃中的蒽醌類成分大部分與糖結合，以蒽醌苷的形式存在于植物組織中，總量約3%～5%，少部分以游離形式存在。故可先用稀硫酸把蒽醌苷水解成苷元，此步驟采用超聲提取可以提高效率和使水解更加充分完全，然后利用游離蒽醌可溶于熱三氯甲烷的性質，用三氯甲烷加熱回流將其提取出來，最后分取三氯甲烷層揮干后加乙醇超聲進行結合蒽醌的提取。這樣，就可以把大黃中的總蒽醌類成分全部提取出來。此外，本試驗還考察了提取方法對樣品中蒽醌類成分含量的影響。結果發(fā)現，單一的超聲提取既無法完全提取總蒽醌，又有很多雜質影響目標峰，故選擇超聲提取法結合加熱回流提取法。

3.2 檢測波長的選擇

大黃中重要的活性成分是蒽醌類化合物及其衍生物，根據化學結構可以推測其在230 nm、240～260 nm波長處有較大的吸收。本試驗測定了5種成分在甲醇中的紫外吸收光譜，確定5種成分在254 nm波長處均有最大吸收，故選擇254 nm為檢測波長。

3.3 內標物的選擇

為克服毛細管電泳法重復性差的缺點，本試驗采用內標法定量。因所測物質為蒽醌類成分，蒽醌類化合物中多具有酚羥基，具有一定酸性，在緩沖體系中電離為陰離子，因此內標物也應選擇能電離為陰離子的物質。筆者曾選擇苯甲酸、對硝基苯甲酸、對氨基苯甲酸為內標物，但都因為與被測物質出峰時間太接近，達不到很好的分離效果。對乙酰氨基酚具有酚羥基，其結構與被測5種物質相近，在體系中能與其他物質分離，且無干擾，從而確定對乙酰氨基酚為本試驗測定的內標物。

3.4 電泳條件的選擇

3.4.1 硼砂濃度的影響 鑒于5種化合物均具有酚羥基，具有一定的弱酸性，為了這5種化合物更好地離子化，應選擇堿性緩沖體系。本試驗考察了磷酸鹽、磷酸鹽-硼酸、Tris、硼砂體系。發(fā)現磷酸鹽體系電導率大，電流值也大，焦耳熱大，難以形成平穩(wěn)的基線。而Tris緩沖液的pH值受溶液濃度影響較大，且其在高濃度時的pH值不高，不能使待測物最大離子化，也易吸收空氣中CO2，影響緩沖體系的質量。而硼砂緩沖液，其硼酸根能與多羥基化合物形成配位鍵，增加負電性，適用于其他含鄰位羥基或多羥基化合物的分離，所以選擇硼砂為緩沖試劑。參考文獻[7-8]試驗條件，在25mmol/L SDS+4mmol/L磺丁基醚-β-CD+8%甲醇基礎上，本試驗考察了硼砂溶液濃度分別為20、25、30mmol/L時對樣品和對照品的分離情況。結果表明，硼砂溶液濃度越高，樣品峰的拖尾因子越大，且一些目標峰的出現合并粘連現象，而濃度太低也會出現同樣的情況，當硼砂溶液濃度為25mmol/L時的分離情況較好，故最后確定了此濃度。

3.4.2 SDS濃度的影響 根據5種化合物結構式可知，其結構相似，理化性質接近，故在區(qū)帶模式下很難得到分離，此時需要考慮添加表面活性劑，常用SDS。當SDS濃度足夠大，達到或超過臨界濃度時，可形成膠束，而膠束在體系中的存在相當于固定相，溶質在膠束和水相之間進行分配，并由于其在膠束中不同的保留能力而產生差速遷移。在25mmol/L硼砂溶液+ 4mmol/L磺丁基醚-β-CD+8%甲醇條件下，本試驗分別考察了15、20、25mmol/LSDS對樣品分離情況的影響。結果發(fā)現，當SDS濃度為15mmol/L時，蘆薈大黃素峰拖尾因子達不到要求，大黃素甲醚峰形不好，基線漂移（如圖2A所示）；當SDS濃度為25mmol/L時，各峰峰形較好，但大黃素甲醚峰無法達到基線分離（如圖2 B所示）；當SDS濃度為20mmol/L時，各目標峰峰形良好，且都能達到基線分離，在30min內完成分離測定（如圖2 C所示）。故綜合分離情況、分析時間等因素考慮，確定SDS濃度為20mmol/L。

圖2 5種成分在含不同SDS濃度的運行緩沖液中的電泳色譜圖A.15mmol/L SDS+25mmol/L硼砂溶液+4mmol/L磺丁基醚-β-CD+ 8%甲醇；B.25 mmol/L SDS+25 mmol/L硼砂溶液+4 mmol/L磺丁基醚-β-CD+8%甲醇；C.20mmol/L SDS+25mmol/L硼砂溶液+4mmol/L磺丁基醚-β-CD+8%甲醇；1.大黃素；2.蘆薈大黃素；3.大黃酸；4.大黃酚；5.大黃素甲醚Fig 2 Electrophorograms of 5 components in electrolyte w ith different concentrations of SDSA.15 mmol/L SDS+25 mmol/L Na2B4O7+4 mmol/L SBE-β-CD+8% methanol solution；B.25 mmol/L SDS+25 mmol/L Na2B4O7+4 mmol/L SBE-β-CD+8%methanol solution；C.20 mmol/L SDS+25 mmol/L Na2B4O7+4 mmol/L SBE-β-CD+8%methanol solution；1.emodin；2. aloe-emodin；3.rhein；4.chrysophanol；5.physcion

3.4.3 有機添加劑的選擇 有機添加劑的加入能改變產生電流層的雙電層，使電滲流降低，擴大遷移窗口，增加峰容量，提高分離效率。目前用的最多的是甲醇和乙腈兩種有機溶劑，就降低電滲而言甲醇等醇類的作用比乙腈更大。本試驗選擇甲醇為有機添加劑，并考察了不同比例（2%、5%、8%）甲醇對分離情況的影響。結果，綜合分離效率和遷移時間，最終選擇甲醇添加比例為2%。

3.4.4 磺丁基醚-β-CD的影響 CD具有中內疏水、外親水的圓筒結構，能與多種疏水性的化合物形成包合物，其不僅是手性選擇劑，而且被廣泛用作膠束電動毛細管色譜（MECC）法的添加劑。CD在分離中的作用之一是立體空間的選擇性。較小的溶質分子可以進入CD疏水性空腔內部，較大的分子則受到限制，從而產生對溶質分子大小的選擇性[9]。本試驗發(fā)現，加入磺丁基醚-β-CD后，峰形變窄，分離效果好。進而考察了磺丁基醚-β-CD濃度對分離情況的影響。結果發(fā)現，當其濃度過大時，可能由于其包合作用使得本來響應值不高的大黃素甲醚峰消失；當其濃度太小時，樣品目標峰會受其他雜質峰干擾。綜合考慮對分離和遷移時間的影響，本試驗最終選擇磺丁基醚-β-CD的濃度為4mmol/L。

3.4.5 pH的影響 在上述條件確定的基礎上，本試驗考察了不同pH對峰分離的影響。結果發(fā)現，pH小于10.00時（9.54）大黃素甲醚峰無法分離，而pH大于10.00時（10.32）大黃素甲醚峰達到分離效果，但是大黃酚峰拖尾嚴重。綜合考慮，確定pH為10.01。

3.4.6 分離電壓的影響 分離電壓升高，分離時間變短，產生的焦耳熱增多，會引起區(qū)帶展寬，譜峰的基線過高且部分峰重疊；分離電壓過低，則分離時間較長，且分離不完全。在緩沖體系確定為25mmol/L硼砂溶液+20mmol/L SDS+4mmol/L磺丁基醚-β-CD+2%甲醇（pH 10.01）時，本試驗考察了在15～25 kV范圍內的最適分離電壓。綜合基線平滑度、峰展寬、柱效、分離度、保留時間、拖尾因子等考慮，最后確定分離電壓為18 kV。

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部[S].2010年版.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：1 116-1 117.

[2]衛(wèi)恒巧，李作平，崔秀彥，等.薄層掃描法測定清肺抑火丸中小檗堿和菝葜皂苷元的含量[J].河北醫(yī)科大學學報，1992，13（4）：199.

[3]黃瑞紅，楊慧文.RP-HPLC法測定清肺抑火丸中白花前胡甲素的含量[J].中國藥房，2010，21（27）：2 556.

[4]葉秀金，宋粉云.HPLC測定清肺抑火丸中鹽酸小檗堿的含量[J].中國實驗方劑學雜志，2011，17（3）：90.

[5]葉秀金，宋粉云.HPLC法測定清肺抑火丸中大黃的四種成分的含量[J].中藥新藥與臨床藥理，2010，21（6）：646.

[6]陳峻，徐華，陳小軒.HPLC同時測定清肺抑火丸中3個苷類成分[J].中國實驗方劑學雜志，2013，19（13）：134.

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[9] 徐其進，顧中偉，陳先麗.疏水條件下甾體化合物的分離及環(huán)糊精的作用[J].分析化學，1999，27（2）：193.

Simultaneous Determ ination of 5 Anthraquinones in QingfeiYihuo Pills by Capillary Electrophoresis

CHEN Cen，WANG Xiao-ke，WU Fu-hai（Guangdong Pharmaceutical University，Guangzhou 510224，China）

OBJECTIVE：To establish a method for simultaneous determ ination of 5 anthraquinones in Qingfei yihuo pills，such as emodin，aloe-emodin，rhein，chrysophanol and physcion.METHODS：Capillary electrophoresis was adopted using paracetamol as internal standard.The separation was performed on a uncoated fused silica capillary.25 mmol/L Na2B4O7+20mmol/L SDS +4 mmol/L SBE-β-CD+2%methanol solution（pH 10.01）was selected as the running buffer.The voltage applied was 18 kV.The sample was injected by gravity（10 s，15 cm）.The detection wavelength was set at 254 nm.The column temperature was 25℃and hum idity was lower than 70%.RESULTS：The linear range of emodin，aloe-emodin，rhein，chrysophanol，physcion were 5.0-40.0 μg/m l（r＝0.998 0），2.4-19.2μg/m l（r＝0.997 1），3.6-28.8μg/m l（r＝0.996 9），11.2-89.9μg/m l（r＝0.998 5），2.5-20.0μg/m l（r＝0.998 3），respectively；RSDs of precision，stability and reproducibility tests were all lower than 2.40%；average recoveries were 96.6%（RSD＝0.80%，n＝6），99.6%（RSD＝1.32%，n＝6），99.2%（RSD＝2.21%，n＝6），98.2%（RSD＝1.63%，n＝6）and 98.6%（RSD＝2.02%，n＝6）.CONCLUSIONS：The method is proved to be specific，accurate，reliable and reproducible，and can be used for quality control of Qingfei yihuo pills.

Capillary electrophoresis；Qingfei yihuo pills；Emodin；A loe-emodin；Rhein；Chrysophanol；Physcion；Content determ ination

R917

A

1001-0408（2014）12-1118-04

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2014.12.22

廣東省自然科學基金資助項目（No.5002841）

2013-10-29

2014-01-26）