王曉梅

肇源縣人民醫(yī)院，黑龍江 肇源 166500

免疫組化染色基本方法分析

王曉梅

肇源縣人民醫(yī)院，黑龍江 肇源 166500

免疫組化染色主要原理是用標(biāo)記的抗體對(duì)細(xì)胞或組織內(nèi)的相應(yīng)的抗原進(jìn)行定性，定位或定量檢測(cè)。經(jīng)過組織化學(xué)的呈色反應(yīng)而呈現(xiàn)醒目的陽性色彩，用顯微鏡，熒光顯微鏡或電子顯微鏡觀察。凡是能作為抗原、半抗原的物質(zhì)，都可用相應(yīng)的特異性抗體在組織、細(xì)胞內(nèi)應(yīng)用免疫組化方法可準(zhǔn)確的定位。熟練掌握一種免疫組化技術(shù)操作方法步驟，則其它的方法和步驟也基本上掌握了。

免疫組化染色；基本方法

免疫組化染色是一種綜合性的技術(shù)，在現(xiàn)代生物學(xué)領(lǐng)域中廣泛應(yīng)用，尤其是醫(yī)院病理科應(yīng)用。免疫組化染色對(duì)疾病特別是對(duì)腫瘤的診斷、鑒別診斷中提供了可靠的診斷依據(jù)。

1 免疫組化染色基本方法

免疫組化染色方法繁多，對(duì)不同的染色方法的認(rèn)識(shí)和選擇，對(duì)免疫組化技術(shù)的普及提高和長期開展至關(guān)重要。以石蠟切片，室溫下操作，辣根過氧化物酶（HRP）系統(tǒng)和用DAB顯色為例，并根據(jù)免疫組化染色步驟將免疫組化染色方法分為以下幾種常用的基本方法：

1.1 直接法（酶標(biāo)法）

將酶標(biāo)記在特異抗體上，然后用酶標(biāo)抗體直接與相應(yīng)抗原特異地結(jié)合。形成抗原-抗體-酶復(fù)合物，最后用底物顯示劑顯色［1］。

1.2 間接法

將酶標(biāo)記在第二抗體上，先將第一抗體（特異性抗體）與相應(yīng)的組織抗原結(jié)合，形成抗體復(fù)合物，再用第二抗體（酶標(biāo)記的抗體）與復(fù)合物中的特異抗體結(jié)合，形成抗原-抗體-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，最后用底物顯色劑顯色。

1.3 IGS法（免疫金法）

將膠體金顆粒（直徑＞20 mm）標(biāo)記在第二抗體或SPA蛋白上，反應(yīng)過程同間接法，只是最后不需顯色過程，一般要求用高濃度的免疫金溶液，否則在光鏡下不易顯示出抗原抗體反應(yīng)部位所呈現(xiàn)的紅色。

1.4 IGSS法（免疫金銀法）

基本原理是通過免疫反應(yīng)沉積在抗原位置的膠體金顆粒起著一種催化作用，用對(duì)苯二酚還原劑將銀離子（Ag+）還原成銀原子（Ag）被還原的銀原子沉積在金顆粒周圍形成“銀殼”，“銀殼”一旦形成，本身亦有催化作用，從而使更多的銀離子還原并促使“銀殼”越長越大，最終在光鏡下看到被放大的抗原位置呈現(xiàn)黑色或黑褐色［2］。還有：SP二步法；PAP法；ABC法；SP法等。

2 具體方法

醫(yī)院病理科主要目的是用于病理診斷，ABC法和SP法最適于病理診斷應(yīng)用。

2.1 ABC法（卵白素-生物素-過氧化物酶連結(jié)法）

2.2.1 試劑配制 0.01 mol磷酸鹽緩沖液（PBS）PH7.2；0.05 molTris-HCl緩沖液（TBS）pH 7.6；3.3%過氧化氫甲醇液；DAB顯色液；0.9%NaCl；SP試劑盒配制。

2.1.2 操作方法 石蠟切片脫蠟至蒸餾水。PBS洗5 min/2次。3%過氧化氫甲醇液20 min。（目的是消除內(nèi)源性過氧化氫酶的活性），蒸餾水洗，PBS浸泡5 min。滴加封閉用血清室溫20～30 min。傾去血清，滴加第一抗體，4℃冰箱過夜或37℃溫箱孵育60 min。PBS沖洗，5 min/2次。滴加生物素標(biāo)記二抗，室溫1 h或37℃溫箱30 min。PBS沖洗，5 min/2次。滴加ABC復(fù)合物，室溫1 h或37℃溫箱30 min。PBS沖洗，5 min/2次。用新鮮配制的DAB-H2O2液顯色，5～20 min。自來水充分水洗，蒸餾水洗5～10 s。用淡蘇木素液復(fù)染細(xì)胞核，半分鐘左右（Harris蘇木素液1份加4份蒸餾水混合即成）。自來水洗5～10 min。（主要目的是藍(lán)化細(xì)胞核）80%、95%、無水酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。

2.1.3 結(jié)果 陽性反應(yīng)部位呈棕黃色；細(xì)胞核呈淡藍(lán)色。

2.2 SP法（鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結(jié)法）

2.2.1 試劑配制 0.01 mol磷酸鹽緩沖液（PBS）PH7.2；2.0.05 molTris-HCl緩沖液（TBS）pH 7.6；3.3%過氧化氫甲醇液；DAB-H2O2液（顯色液）；0.9%NaCl；SP試劑盒配制。

2.2.2 操作方法 石蠟切片脫蠟至蒸餾水。PBS沖洗5 min/2次。3%過氧化氫甲醇室溫5～10 min（以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性）。蒸餾水洗，PBS浸泡5 min（如需采用抗原修復(fù)或酶消化在此步驟后進(jìn)行）。每張切片滴加1滴或50 μl封閉用血清，室溫10 min。每傾去血清，每張切片滴加1滴或50 μl第一抗體或即用型一抗，4℃冰箱過夜或37℃溫箱孵育60 min。PBS沖洗，5 min/2次。每張切片滴加1滴或5 μl生物素標(biāo)記第二抗體或即用型生物素二抗。室溫1 h，或37℃溫箱30 min。PBS沖洗，5 min/2次。每張切片滴加1滴或50 μl辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素（第三抗體）或即用型三抗工作液。室溫1 h或37℃溫箱30 min。PBS沖洗，5 min/2次。用新鮮配制的DAB-H2O2液顯色5～10 min。自來水充分水洗，蒸餾水洗5～10 s。用淡蘇木素復(fù)染細(xì)胞核，半分鐘左右［3］。自來水洗5～10 min。80%、90%，無水酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。

2.2.3 結(jié)果 陽性反應(yīng)部位呈棕黃色；細(xì)胞核呈淡藍(lán)色。

3 討論

免疫組化染色定性，定位或定量檢測(cè)。最大限度保存組織或細(xì)胞內(nèi)待檢物質(zhì)的抗原性，以保證檢出的細(xì)胞內(nèi)超微量的抗原成分。免疫組織化學(xué)染色為病理外檢中應(yīng)用最為廣泛的技術(shù)手段之一。

［1］朱淑玲，楊清緒.免疫組化染色結(jié)果分析［J］.中國現(xiàn)代醫(yī)生，2007，45（16）：120-121.

［2］李捷艷，黃春鑫.免疫組化染色常見問題的探討［J］.贛南醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2007，27（1）：131-131.

［3］漆楚波，朱潤慶，夏和順，等.組織芯片簡(jiǎn)易制作方法及免疫組化有效性分析［J］.腫瘤防治研究，2007，34（8）：629-632.

The Basic Method Analysis of Immunohis to Chemical Staining

WANG Xiaomei People’s Hospital in Zhaoyuan County，Zhaoyuan HeiLongjiang 166500，China

The principle of immunohistochemical staining is to utilize marked antibodies to qualitative，position or quantitative corresponding antigen in cells or tissues.With histochemitry，color reaction shows striking positive colors，which can be observed by microscope，fluorescence microscope or an electron microscope.Any substance that can be used as antigens or haptens is able to be precisely positioned within tissues and cells by immunohistochemical method with the aid of corresponding specific antibodies.Having a good mastery of immunohistochemical technique operation method and procedure，the other methods and procedures are acquired basically.

Immunohistochemical staining，Basic method

R446.6

B

1674-9316（2014）21-0132-02

10.3969/J.ISSN.1674-9316.2014.21.081