濮孟輝 金東嶺 王 蕾 鄭發(fā)著 時志民

(邯鄲市人民醫(yī)院外科，河北 邯鄲 056001)

已有研究表明〔1〕正常甲狀腺和甲狀腺癌的細(xì)胞內(nèi)有雌激素受體(ER)α表達(dá)，而且對甲狀腺癌的發(fā)生和發(fā)展有促進(jìn)作用。但對ERβ在腫瘤發(fā)展中的作用近來卻出現(xiàn)了一些有爭議的研究和報道〔2〕。最近發(fā)現(xiàn)〔3〕ERβ除了野生型之外有6種剪切變體：ERβ1～ERβ6，他們在某些腫瘤中的表達(dá)顯示了不同的生物學(xué)意義。除了ERβ1系野生型ERβ有較多的報道之外，一般認(rèn)為ERβ2在腫瘤的發(fā)展過程中也有重要影響。前期研究〔4〕表明：在甲狀腺組織中ERβ2的表達(dá)較之ERβ1對甲狀腺濾泡上皮可能具有更為突出的保護(hù)作用。本研究旨在探討甲狀腺乳頭狀腺癌(PTC)組織中ERβ1、ERβ2以及ERα的mRNA表達(dá)及其與表皮生長因子受體(HER)-2的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1研究材料 選取邯鄲市中心醫(yī)院、邯鄲市人民醫(yī)院等2010年3月至2011年2月間手術(shù)切除的PTC患者20例，均為女性，年齡(42.4±16.3)歲。術(shù)前均未行化療、放療及免疫治療。同時選取癌旁正常甲狀腺組織10例，年齡(38.1±8.4)歲。所有病例術(shù)后均經(jīng)病理檢查證實診斷。每例標(biāo)本取材后的標(biāo)本迅速投入液氮中速凍，然后轉(zhuǎn)存于-70℃的冰箱。

1.2半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)技術(shù)檢測ERβ1、 ERβ2和ERαmRNA的表達(dá) 兩步法RT-PCR 試劑盒和PCR 試劑購自Promega 公司;實驗中所有引物均由上海Sangon公司合成。RT-PCR按Trizolrna(Gibco公司)提取說明書對冰凍保存的甲狀腺標(biāo)本進(jìn)行總RNA抽提后，1 μg總RNA 用于逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，具體操作參照試劑盒說明進(jìn)行。ERβ1和ERβ2引物序列參照文獻(xiàn)〔3，4〕，ERβ1：上游引物為：5′-CGA TGCTTTGGTTTGGGTGAT-3′， 下游引物為：5′-GCCCTCTTTGCTTTTACTGTC-3′；ERβ2：上游引物為：5′-TATTGACT GTTTGCGGCGACT-3′，下游引物為：5′-GGATGTTGATGTTTGACTGCT-3′；ERα上游引物：5′-TGCCAAGGAGACTCGCTA-3′ ，下游引物：5′-TCAACA，ITrCTCCCTCCTC-3′。內(nèi)參照β-actin正向：5′-CACTGTGTTGGCGTACAGGT-3′，反向：5′-TCATCACCA1vrGGCAATGAG-3′。各取cDNA 3 μl 、ERβ1和ERβ2上下游引物各1 μl 、AMV逆轉(zhuǎn)錄酶(20 U/L)1 μl、1.5 mmol/ L MgCl2、1 ×PCR 反應(yīng)緩沖液、0.2 mmol/L dNTPs 和滅菌水共同組成50 μl 的PCR 反應(yīng)體系。94℃變性2 min后，按下述循環(huán)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，ERα和β-actin，94℃變性45 s，55～C退火45 s，72～C延伸45 s；ERβ1、ERβ2反應(yīng)條件:94 ℃45 s、58 ℃30 s、72 ℃1 min，共40 個循環(huán)。取10 μl PCR 反應(yīng)產(chǎn)物行瓊脂糖凝膠電泳,結(jié)果進(jìn)行光密度測定：用密度掃描儀(ZEISS全自動圖像分析儀，VIDAS數(shù)據(jù)分析)測定條帶的光密度值(A值)，分別用目的基因擴(kuò)增產(chǎn)物與內(nèi)參照基因擴(kuò)增產(chǎn)物光密度比值表示每個樣品目的基因的表達(dá)水平。

1.3免疫組織化學(xué)染色 S-P試劑盒、DAB顯色試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。甲狀腺組織石蠟包埋標(biāo)本中HER-2表達(dá)采用S-P免疫組織化學(xué)染色，按試劑盒說明操作，用已知HER-2陽性的人乳腺導(dǎo)管浸潤癌標(biāo)本作陽性對照；用PBS代替一抗作陰性對照。

1.4免疫組織化學(xué)染色結(jié)果判斷 細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核存在棕黃色顆粒即定義為HER-2陽性細(xì)胞。表達(dá)水平判定：在光鏡下觀察，將每一張切片中棕黃色陽性細(xì)胞數(shù)>10%定義為HER-2表達(dá)陽性，陽性細(xì)胞數(shù)≤10%定義HER-2表達(dá)陰性。

1.5統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS10.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行方差分析和獨(dú)立樣本t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1PTC組織中HER-2表達(dá)及ERα表達(dá)情況 PTC組HER-2陽性表達(dá)患者的ERα平均表達(dá)水平(n=14，0.582±0.371)明顯高于HER-2陰性表達(dá)患者(n=6，0.154±0.120)(t=2.728，P=0.013 8)。

2.2PTC組織中ERβ1與HER-2表達(dá)的關(guān)系 HER-2陽性表達(dá)患者的ERβ1平均表達(dá)水平(0.192±0.201)低于HER-2陰性表達(dá)患者(0.313±0.190)，但無統(tǒng)計學(xué)意義(t=1.252，P=0.226 5)。

2.3PTC組織中ERβ2與HER-2 表達(dá)的關(guān)系 HER-2陽性表達(dá)患者的ERβ2平均表達(dá)水平(0.118±0.091)明顯低于HER-2陰性表達(dá)患者(0.371±0.211)(t=3.828，P=0.001 2) 。

3 討 論

ERα和β亞型在雌激素敏感器官可對惡性腫瘤細(xì)胞的增殖發(fā)揮不同作用。前期研究〔5〕也曾對ERα在甲狀腺不同組織中的表達(dá)有初步探討。有關(guān)ERβ的生理病理作用，無論是在經(jīng)典的雌激素靶組織還是在雌激素非依賴性組織，都存在著一些有爭議的問題〔2，3〕。Helguero等〔6〕對乳腺上皮細(xì)胞的研究表明，ERα可誘導(dǎo)17-β雌二醇導(dǎo)致的增殖，而ERβ對生長發(fā)揮抑制作用。近年來對ERβ在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用尚存爭議，因為目前發(fā)現(xiàn)ERβ至少存在5種亞型(剪切變體)ERβ1～5，它們在腫瘤中的表達(dá)顯示不同的生物學(xué)意義。前期研究〔4，5〕表明ERα對甲狀腺濾泡上皮的增生和分化有促進(jìn)作用，其過度表達(dá)與甲狀腺癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)系,而ERβ可能對甲狀腺濾泡上皮具有保護(hù)作用。ERβ1和ERβ2的表達(dá)缺失，尤其是ERβ2剪切變體的表達(dá)缺失可能使甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞易受女性激素的影響，導(dǎo)致甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞的增生致癌變。生長因子激活的受體酪氨酸激酶傳導(dǎo)通路與細(xì)胞的增殖關(guān)系密切〔7〕，在激素依賴性腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。本實驗提示PTC患者中ER亞型的表達(dá)可能受HER-2 調(diào)節(jié)。即HER-2，上調(diào)ERα和(或)下調(diào)ERβ1和ERβ2，促進(jìn)腫瘤進(jìn)展。進(jìn)一步說明在甲狀腺組織中保持正常的ERβ2表達(dá)水平較之ERβ1對甲狀腺濾泡上皮可能具有更突出的保護(hù)作用，其表達(dá)下調(diào)與甲狀腺腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系，并且是一個強(qiáng)有力的預(yù)后評估指標(biāo)，可以為早期診斷、判斷預(yù)后及指導(dǎo)治療提供理論依據(jù)。

4 參考文獻(xiàn)

1Lewy-Trenda I. Estrogen and progesterone receptors in neoplastic and non-neoplastic thyroid lesions〔J〕.Pol J Pathol，2002；53(2):67-72.

2Skliris GP，Munot K，Bell SM,etal.Reduced expression of estrogen receptor beta in invasive breast cancer and its re-expression using DNA methyl transferase inhibitors in a cell line model〔J〕.J Pathol，2003；201(2)：213-20.

3Green CA，Peter MB，Speirs V，etal.The potential role of ER beta isoforms in the clinical management of breast cancer〔J〕.Histopathology，2008；53(4)：374-80.

4金東嶺，王 蕾，席 豐，等.甲狀腺腫瘤組織中雌激素受體β1和β2的表達(dá)及其意義〔J〕.中華內(nèi)分泌代謝雜志，2011；27(11)：932-4.

5金東嶺，李聯(lián)祥，劉現(xiàn)軍，等.雌激素受體亞型ERα、ERβ和Ki-67在不同甲狀腺疾病組織的表達(dá)及意義〔J〕.解放軍醫(yī)學(xué)雜志，2008；33(9):1109-12.

6Helguero LA，F(xiàn)aulds MH,Gustafsson JA，etal.Estrogen receptors alfa (ERa) and beta (ERβ)differentially regulate proliferation and apoptosis of the normal murine mammary epithelial cell line HC11〔J〕.Oncogene，2005；24(44)：6605-16.

7Rony S，Edwin GK.The MAPK signaling cascade〔J〕.FASEB J，1995；9(9):726-35.