馬廣友 李俊杰 邵珠福

(遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院普外科，遼寧 錦州 121001)

大腸癌是最常見的消化道腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率在全球范圍內(nèi)呈逐年上升趨勢〔1〕。在我國，隨著人們生活水平的提高和飲食結(jié)構(gòu)的改變，大腸癌尤其是結(jié)腸癌的發(fā)病率迅速上升，僅次于胃癌和食管癌，發(fā)病年齡趨于老齡化〔2〕。近年來，化療在大腸癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移及晚期轉(zhuǎn)移性大腸癌等患者的治療中收到較好的治療效果〔3〕，可以明顯延長患者的生存期，提高患者的生活質(zhì)量，改善預(yù)后，其中奧沙利鉑在大腸癌的化療中有較大優(yōu)勢。然而，腫瘤耐藥常使患者術(shù)后化療失敗。大腸癌的化療耐藥涉及多個方面，其中細(xì)胞對藥物誘導(dǎo)凋亡耐受及凋亡閾值增高是大腸癌耐藥的主要機(jī)制之一〔4〕。因此，如何恢復(fù)大腸癌對化療藥物誘導(dǎo)的凋亡途徑的敏感性成為大腸癌耐藥研究的焦點(diǎn)問題。本研究旨在通過檢測凋亡抑制蛋白Survivin、Livin、p53及Bcl-2在大腸癌組織中的表達(dá)，探討其與化療藥物奧沙利鉑化療敏感性的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2011年4月至2012年3月遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院經(jīng)手術(shù)病理證實(shí)的74例大腸癌患者，其中男性49例，女性25例；年齡35～81歲，平均(62.2±3.7)歲；結(jié)腸癌31例，直腸癌43例。所有患者術(shù)前均未行任何治療。術(shù)中取約1.0 cm×0.5 cm×0.5 cm大小的新鮮腫瘤組織，放入含100 U/ml青霉素+200 μg/ml鏈霉素的培養(yǎng)液中培養(yǎng)。同時取20例經(jīng)病理證實(shí)無腫瘤殘留的組織切緣作為正常對照組。

1.2免疫組化檢查凋亡相關(guān)蛋白Survivin、Livin、p53、Bcl-2的表達(dá) 每例患者術(shù)中切除的腫瘤標(biāo)本用10%甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋后行4 μm連續(xù)切片，行免疫組化SP法檢測病灶Survivin、Livin、p53、Bcl-2蛋白表達(dá)情況。采用鼠抗人Survivin、Livin、p53、Bcl-2單克隆抗體，購自Imgenex公司(Livin)及Santa Cruz公司(Survivin、p53、Bcl-2)，DAB顯色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)公司，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。以PBS代替一抗作為陰性對照、已知陽性切片作為陽性對照。

所有病理切片由2名病理科醫(yī)師在未知患者情況的前提下閱片，每張切片取5個400倍視野觀察，每個視野計(jì)數(shù)100個細(xì)胞，記錄陽性細(xì)胞數(shù)。Survivin、Bcl-2以細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)染色為陽性，Livin以細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核染色為陽性，p53以細(xì)胞核染色為陽性，并按照細(xì)胞著色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞率進(jìn)行計(jì)分：無著色、淺黃色、棕黃色、棕褐色分別記為0、1、2、3分；陽性細(xì)胞≤5%、6%～25%、26%～50%、51%～75%、≥76%分別記為0、1、2、3、4分。以兩者評分相加判斷蛋白表達(dá)強(qiáng)度：0～1分(-)，2～3分(+)，4～5分()，6分以上()；≤3分為弱表達(dá)，≥4分為強(qiáng)表達(dá)〔5〕。

1.3腫瘤細(xì)胞對奧沙利鉑化療的敏感性檢測 將腫瘤組織研磨分散，用0.25%胰酶消化后，置于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中，以細(xì)胞分離器調(diào)整細(xì)胞濃度至5×105個/ml，將奧沙利鉑(江蘇恒瑞醫(yī)藥公司)以無菌生理鹽水配成血藥峰值濃度142 μg/ml〔6〕。給藥組設(shè)6個復(fù)孔，同時以PBS溶液作為空白對照。以96孔板接種腫瘤細(xì)胞200 μl/孔，振蕩混勻后放入37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育48 h，然后加入5 mg/ml MTT繼續(xù)培養(yǎng)4 h，再加入DMSO 100 μl/孔振蕩混勻溶解結(jié)晶，在酶標(biāo)儀上于570 nm波長處測定各空的光密度值，并計(jì)算腫瘤細(xì)胞抑制率：腫瘤細(xì)胞抑制率=(1-藥物組OD值/對照組OD值)×100%。

2 結(jié) 果

2.1大腸癌組織Survivin、Livin、p53、Bcl-2蛋白表達(dá)情況 大腸癌組Survivin、Livin、p53及Bcl-2蛋白強(qiáng)陽性表達(dá)率分別有58例(78.38%)、57例(77.03%)、41例(55.41%)、26例(35.14%)。而正常對照組織中僅1例表達(dá)Survivin、2例表達(dá)Livin、1例表達(dá)Bcl-2，且均為弱陽性表達(dá)。大腸癌組織與正常對照組織Survivin、Livin、p53及Bcl-2蛋白表達(dá)率比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.53、3.81、3.62、2.55，P<0.01)。

2.2大腸癌組織Survivin、Livin、p53、Bcl-2蛋白表達(dá)的相關(guān)性 Spearman相關(guān)分析結(jié)果顯示，大腸癌組織中Survivin與Bcl-2蛋白表達(dá)強(qiáng)度呈正相關(guān)(r=0.412，P<0.05)，其他蛋白表達(dá)強(qiáng)度間均無明顯相關(guān)性(r=0.126～0.288，P>0.05)。

2.3大腸癌患者Survivin、Livin、p53、Bcl-2蛋白表達(dá)與奧沙利鉑化療敏感性的關(guān)系 Survivin蛋白強(qiáng)表達(dá)組中，奧沙利鉑對腫瘤細(xì)胞的抑制率(36.3±6.1)%顯著高于Survivin蛋白弱表達(dá)組〔(22.4±3.5)%，t=3.305，P<0.01〕。Livin蛋白強(qiáng)表達(dá)組中，奧沙利鉑對腫瘤細(xì)胞的抑制率顯著低于Livin蛋白弱表達(dá)組〔(24.6±4.7)% vs (33.5±5.4)%，t=1.900，P<0.05〕。Bcl-2蛋白強(qiáng)表達(dá)組中，奧沙利鉑對腫瘤細(xì)胞的抑制率顯著高于Bcl-2蛋白弱表達(dá)組，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義〔(34.4±3.9)% vs(27.1±3.2)%，t=2.210，P<0.05〕。p53蛋白強(qiáng)表達(dá)組與弱表達(dá)組比較，奧沙利鉑對腫瘤細(xì)胞的抑制率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義〔(31.7±5.8)% vs (30.6±5.0)%，t=0.063，P>0.05〕。

3 討 論

大腸癌的發(fā)生、發(fā)展與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，而多種凋亡相關(guān)蛋白在大腸癌的發(fā)生、發(fā)展及耐藥中發(fā)揮重要作用。因此，檢測凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)對于監(jiān)測大腸癌的治療效果、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)及耐藥尤為重要。Survivin和Livin蛋白均為凋亡抑制蛋白家族中的重要成員，兩者在肺癌、乳腺癌、宮頸癌、黑色素瘤及消化系統(tǒng)腫瘤組織中均呈高表達(dá)〔7〕，而在正常組織中呈低表達(dá)或不表達(dá)。Survivin是已知作用最強(qiáng)的凋亡抑制因子，其在組織中的高表達(dá)通過抑制Caspase-3和Caspase-7的活性〔8〕，進(jìn)一步抑制細(xì)胞程序性死亡及化療藥物誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。Livin的抗凋亡作用受到線粒體釋放的Caspase活化蛋白Smac的調(diào)節(jié)〔9〕。Livin還能抑制化療藥物介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡〔10〕，阻斷Livin的表達(dá)可以促進(jìn)白血病細(xì)胞的凋亡，并能增強(qiáng)化療藥物的抗癌作用。

本研究結(jié)果與黎軍和〔11〕的研究結(jié)果一致，提示Survivin、Livin、p53及Bcl-2蛋白的高表達(dá)可能與大腸癌的發(fā)生及發(fā)展有關(guān)。相關(guān)分析結(jié)果顯示，大腸癌組織中Survivin與Bcl-2蛋白表達(dá)強(qiáng)度呈正相關(guān)與韓杰等〔12〕報道的結(jié)果一致，其可能原因?yàn)镾urvivin在Bcl-2的下游直接抑制Caspase的活性，進(jìn)而協(xié)同阻斷細(xì)胞凋亡。而Survivin與Livin蛋白表達(dá)之間并無明顯的相關(guān)性，表明Survivin與Livin蛋白可能通過不同的作用機(jī)制來抑制腫瘤細(xì)胞凋亡。

奧沙利鉑對結(jié)直腸癌、乳腺癌、卵巢癌、非小細(xì)胞性肺癌等多種腫瘤均有較好的療效，尤其是對順鉑類耐藥的腫瘤具有顯著抑制作用，與5-FU聯(lián)合用于治療結(jié)直腸癌作為一線治療用藥顯示出較好的優(yōu)勢〔13，14〕。本研究提示Livin可能與大腸癌患者對奧沙利鉑的耐藥有關(guān)，并在大腸癌患者化療耐受中起到重要作用。抑制Livin蛋白的表達(dá)可以抑制腫瘤細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡，并可能逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥、提高圍術(shù)期化療效果，可能成為大腸癌基因治療的一個新靶點(diǎn)。

總之，凋亡抑制蛋白Survivin、Livin、p53及Bcl-2在大腸癌組織中均呈高表達(dá)，Livin蛋白在大腸癌組織中的表達(dá)可能與奧沙利鉑化療耐藥有關(guān)，可以臨床選擇化療藥物提供指導(dǎo)。

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