宓 林 于曉峰 鄒 健

(復旦大學附屬華東醫(yī)院消化內(nèi)科，上海 200040)

衰老(aging)是每一個有機體都必須經(jīng)歷的復雜過程，隨著時間的推移，眾多器官功能逐漸衰退。即使是在組織中具有替換損傷細胞功能的干細胞(stem cells)，長時間暴露于有害的環(huán)境或內(nèi)源性毒素中，也將導致細胞不斷損傷或衰退。一旦替換與損失之間的平衡被打破，機體就會出現(xiàn)功能紊亂從而導致疾病的發(fā)生。隨著衰老的進一步發(fā)展，機體內(nèi)的慢性環(huán)境容易導致神經(jīng)退行性變、糖尿病、骨關(guān)節(jié)退行性變及甚至腫瘤的發(fā)生。因此，深入認識并了解衰老機制將有助于削弱甚至攻克這一普遍存在的現(xiàn)象給人類帶來的巨大影響。

1 研究背景

基因表達水平的改變決定生長發(fā)育中的組織分化，并與衰老中的機體器官、組織、細胞等功能下降有關(guān)。有機體的生長過程是被緊密調(diào)控的，而我們對生長發(fā)育與衰老之間的轉(zhuǎn)變以及機體發(fā)育后改變的調(diào)控，同樣都不甚了解。通過測定人和恒河猴生存期中額葉前皮質(zhì)mRNA、miRNA及蛋白表達，發(fā)現(xiàn)僅少數(shù)基因表達的改變對衰老具有特異性，而衰老過程中多數(shù)miRNA和基因表達改變表現(xiàn)為發(fā)育模式的反轉(zhuǎn)或延續(xù)。研究顯示miRNA及轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控了整個生存期中多數(shù)可調(diào)控進程的發(fā)育及發(fā)育后的表達改變。相應基因組區(qū)的差異性進化守恒提示這些調(diào)控進程對于發(fā)育而言也許是有利的，而對于衰老而言則可能是相對不利的。實驗結(jié)果顯示衰老過程中生長發(fā)育的調(diào)控及表達改變是有直接關(guān)系的〔1〕。與細胞增殖、靜止、凋亡及分化等相類似，細胞的衰老是由特定的基因表達程序所緊密調(diào)控的。基因調(diào)控的衰老中含有重要的轉(zhuǎn)錄成分，包括p53、AP-1、E2F、Id及Ets在內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子。近年來還發(fā)現(xiàn)了兩組關(guān)于衰老的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的重要作用因子，第一組含與靶mRNAs相關(guān)的編碼衰老的因子及影響細胞衰老的RNA結(jié)合蛋白(PBP)，如人抗原R(HuR)、AU結(jié)合因子(AUF1)、TTP。第二組含微小RNA(MicroRNA，miRNA)，這是一類廣泛存在的非蛋白編碼的小分子RNA，長度約為19-25nt，主要通過與靶mRNA的3'端非翻譯區(qū)(3'UTR)完全或部分互補結(jié)合，導致靶mRNA降解或抑制蛋白質(zhì)合成從而調(diào)控基因的表達。在細胞核內(nèi)，miRNA的編碼基因在RNA轉(zhuǎn)錄酶的作用下生成初級轉(zhuǎn)錄體pri-miRNA，然后pri-miRNA 在RNase III，Drosha的作用下，剪切為具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的miRNA 前體(pre-miRNA)，接著由依賴Ran 和轉(zhuǎn)運受體家族成員輸出蛋白-5(Exportin-5)將pre-miRNA 從細胞核轉(zhuǎn)運至胞質(zhì)。pre-miRNA 在細胞質(zhì)中由RNA 酶III(Dicer)進一步切割而產(chǎn)生成熟的miRNA。MiRNAs通過轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因的表達進而參與調(diào)控一系列的生命活動，包括細胞增殖、生長發(fā)育、器官形成、造血、凋亡、腫瘤的發(fā)生?，F(xiàn)在人們越來越深刻地認識到miRNA對基因表達調(diào)控的有力作用，在識別衰老調(diào)控相關(guān)的miRNAs方面具有積極的作用。自2007年以來，全球掀起了一陣關(guān)于研究在衰老過程中具有差異表達的miRNAs的熱潮，并進一步開展其在衰老表型方面作用的深入研究，證實miRNAs能通過多種途徑影響特定的衰老過程。

2 MiRNAs在衰老中的主要作用機制

2.1MiRNAs與p53/p21衰老通路 P53在衰老及老化過程中起核心作用，其在控制衰老調(diào)控的miRNA表達中也具有一定影響。2007年有研究發(fā)現(xiàn)miR-34能觸發(fā)結(jié)腸癌細胞及人二倍體成纖維細胞(HDFs)的衰老〔2,3〕。在復制衰老的纖維母細胞中，miR-34a的表達隨著p53的改變而增多，miR-34家族可以從生長停滯及凋亡等方面影響p53的活性。目前有越來越多的經(jīng)miR-34a作用而抑制的mRNAs已被識別，如編碼E2F、c-Myc、SIRT1、Cdk4、Cdk6、Bcl-2、肝細胞生長因子受體(Met)及cyclins D1和E2的mRNAs，從而得出結(jié)論：miR-34a是一個已明確的抑癌因子并具有觸發(fā)衰老的作用。MiR-34a在p53非依賴方式中呈現(xiàn)上調(diào)態(tài)勢，在由Braf所觸發(fā)的HDF衰老中miR-34a通過轉(zhuǎn)錄因子Elk1作用而上調(diào)，在粒細胞衰老過程中主要是經(jīng)轉(zhuǎn)錄因子CCAAT增強結(jié)合蛋白(C/EBP)a作用而上調(diào)，在過氧化氫誘導的早衰過程中同樣觀察到miR-34水平的上調(diào)。MiR-34抑制腫瘤的作用與其啟動衰老的機制是相一致的，過甲基化的miR-34a在許多不同腫瘤細胞類型中呈現(xiàn)出致癌性的改變，如肺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌及腎癌〔4〕。提高miR-34a的水平不僅能夠抑制腫瘤的發(fā)生，并且與SIRT1的表達下降以及可能導致動脈粥樣硬化的抑制細胞增殖相關(guān)的內(nèi)皮細胞衰老有關(guān)。在衰老的內(nèi)皮祖細胞(EPCs)中miR-34a表達水平的升高能減少SIRT1的產(chǎn)物及EPC介導的血管生成。有研究分析了非人靈長類動物恒河猴大腦皮層神經(jīng)元及大鼠原代培養(yǎng)神經(jīng)元中特定miRNA分子- miR34a的表達特性及作用，發(fā)現(xiàn)其隨著年齡梯度增長而呈現(xiàn)表達增加的規(guī)律：在過表達miR-34a的情況下，它可能通過抑制BCL-2而引起神經(jīng)元的凋亡，提示miR-34a可能參與神經(jīng)元的發(fā)育與衰老過程〔5〕。在人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞(HUVEC)、動脈內(nèi)皮細胞及人冠狀動脈內(nèi)皮細胞中，miR-217同樣能降低SIRT1的表達，從而引起早衰和血管損傷的發(fā)生。最近發(fā)現(xiàn)miR-885-5p在神經(jīng)母細胞瘤中的過表達可以觸發(fā)細胞衰老，盡管其中CDK2及MCM5的mRNAs是直接作用靶點，但miR-885-5p能同時有力的激活p53通路并誘導p53調(diào)控基因〔6〕。

P21在應激及癌基因誘導的細胞衰老模型中是多個miRNAs的作用靶點。P21是廣譜的cdk抑制因子，其表達受miRNAs中的miR-106家族及其他人乳腺上皮細胞中具有相似種子序列的如miR-130b,miR-302a-d,miR-512-3p及miR-515-3p所抑制。在該模型系統(tǒng)中，p21是誘導衰老過程所必須的，而降低p21的表達則可以從RasV12誘導的衰老過程中拯救細胞，衰老的HDFs及HTM細胞中高水平表達的p21可以降低miR-106b的水平。較少量的miR-15家族成員可以促進Bcl-2的積聚，與衰老細胞增強的抗凋亡能力相一致。

2.2MiRNAs調(diào)節(jié)p16/RB通路 另一組日漸受到關(guān)注的調(diào)控衰老的miRNA主要作用于細胞分裂周期，尤其是經(jīng)RB通路。RB通路與p53通路是緊密相關(guān)的，其功能明顯受cdk活性所控制。P16與p21相同，是細胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子(CDKI)，p16是Cdk4及Cdk6的抑制因子，繼而抑制pRb的磷酸化而維持其活性形式，在增殖所需的轉(zhuǎn)錄基因中阻斷E2F。p16的翻譯過程受HDFs中的miR-24所抑制。盡管增殖期的HDFs表達高水平的miR-24從而導致p16的低表達，晚期HDFs表達低水平的miR-24而產(chǎn)生高水平表達的p16，而單純的miR-24異常過表達并不能阻止衰老的發(fā)展，同樣，單純的異?？筸iR-24表達也并不能加速衰老發(fā)展，可能是因為miR-24同時也能降低許多增殖蛋白的表達。有研究顯示E2F1負反饋回路下游的miR-449a及miR-449b能直接相互激活miR-449a/b的轉(zhuǎn)錄，從而定位并抑制CDK6及CDC25A，并進一步導致pRb過甲基化使細胞停滯于G1期〔7〕，MiR-24只有在和其他miRNAs(miR-15b,miR-25,miR-141)相聯(lián)合的情況下才能起強化衰老的作用。而MiR-34能抑制cyclin D1及Cdk6的表達。

2.3MiRNAs與胰島素/胰島素樣生長因子(IGF)通路 已明確IGF通路是調(diào)控信號通路，在蛋白質(zhì)合成和血糖穩(wěn)定中起重要作用。損傷IGF通路功能或引起其表達下降的突變能夠延長C. elegans、果蠅、FIRCO鼠甚至人類的壽命。這些從低等生物體中實驗得出的證據(jù)顯示出miRNA在調(diào)節(jié)IGF通路中的重要性。Lin-4基因及其靶點lin-14共同調(diào)控C. elegans的壽命，由lin-14下降所引起的壽命延長需依賴2個轉(zhuǎn)錄因子：DAF-16和HSF-1。DAF-16是DAF-2下游的作用靶點，是C. elegans內(nèi)一些胰島素樣多肽的一般受體，由此提示lin-4和lin-14參與調(diào)控IGF-1信號通路。一些研究報道有很多miRNAs共同參與調(diào)控IGF信號通路，尤其是miR-1可以與IGF-1的3'UTR部分結(jié)合而參與調(diào)控過程〔8,9〕。MiR-1在骨骼肌及心肌中呈特異性表達，并參與心臟的發(fā)育、心肌梗死、心臟干細胞分化及心律失常，并同時研究了其在心肌中的作用。與miR-1相同，miR-320和miR-206在心肌細胞中也能靶向結(jié)合IGF-1。MiR-145可以靶向結(jié)合1型胰島素樣生長因子受體(IGF-1R)及胰島素受體底物-1(IRS-1)，IRS-1是IGF-1R的對接蛋白。胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白-5(IGFBP-5)是miR-140的直接靶點，通過p53依賴機制與細胞衰老相關(guān)聯(lián)。而let-7a3與IGF2及IGFBP3蛋白水平反相關(guān)。脂代謝和胰島素分泌也可分別被miR-122及miR-375所調(diào)控，IGF-1信號同樣與SIRT1、白藜蘆醇通路調(diào)控機體壽命相關(guān)，有趣的是miR-217在衰老的內(nèi)皮細胞中的抑制可以通過增加SIRT1的活性而減少衰老細胞的比率。

2.4MiRNAs與TOR通路 TOR是一種絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶，雖然2種TOR蛋白(TOR1和TOR2)在酵母體內(nèi)具有相似的控制細胞生長的功能，而哺乳動物體內(nèi)的mTOR則有2個功能不同的復合物(TORC1和TORC2)。TORC1磷酸化S6K及4E-BP1從而促進翻譯過程，而TORC2則控制細胞骨架的肌動蛋白。TOR通路集中作用于3方面控制細胞生長：分別為營養(yǎng)的有效性、能量狀態(tài)及生長因子。TOR信號通路作為營養(yǎng)感受器與胰島素/IGF信號通路相關(guān)聯(lián)是合理的。由生長因子(胰島素或IGF)觸發(fā)后，信號轉(zhuǎn)換至AKT/PKB(蛋白激酶B)從而抑制結(jié)節(jié)性硬化蛋白1/2(TSC1/TSC2)的功能，轉(zhuǎn)而促進TORC1和TORC2的激活。在許多有機體中限制卡路里攝入可以延長壽命，由此進一步了解關(guān)于調(diào)控營養(yǎng)感受及生理反應的通路之間的復雜網(wǎng)絡。TOR通路與胰島素/IGF信號相互作用，功能缺失的猛禽突變C. elegans及TOR同源序列，daf-15、let-363的研究發(fā)現(xiàn)其與衰老相關(guān)，并能明顯延長壽命〔10〕。TOR通路可能是由于其負性調(diào)控自體吞噬的作用而對延長壽命方面產(chǎn)生影響。有研究報道m(xù)iR-100的過表達會抑制mTOR的mRNA及蛋白水平，但仍缺乏直接相關(guān)的證據(jù)〔11〕。MiR-21是由TOR和NFκB調(diào)控的，miR-30a靶向結(jié)合beclin-1并進而抑制自體吞噬，從而提示其可能與TOR通路具有相關(guān)性。

2.5MiRNAs調(diào)節(jié)SASP相關(guān)通路 SASP具有分泌多種生長因子、ECM降解酶及細胞因子的特點，后者中包括2種關(guān)鍵的炎癥介質(zhì)，IL-6和IL-8。有研究報道在HDFs中，miR-146a/b降低IL-1受體相關(guān)激酶1(IRAK1)的表達，IRAK1是IL-1信號轉(zhuǎn)導通路的關(guān)鍵組成部分。通過IRAK阻斷IL-6和IL-8的分泌而降低信號可以避開SASP〔12〕。長期培養(yǎng)的BJ纖維母細胞異常過表達端粒酶活性，且miR-146a的表達水平升高，提示SASP的調(diào)控可能與衰老有關(guān)〔13〕。整合蛋白β1是一種細胞表面蛋白，與ECM相互作用并影響HDF的衰老，miR-183在H2O2觸發(fā)的衰老中能減少其表達。Let-7靶向結(jié)合蠕蟲的細胞核受體DAF-12，DAF-12與脊椎動物的維生素D及肝X受體相關(guān)，DAF-12通過消除生殖細胞系的類固醇而介導壽命延長過程。在C. elegans中，類固醇信號也能調(diào)節(jié)D. melanogaster的壽命，其中類固醇是蛻化素，miR-14可與蛻化素受體靶向結(jié)合，提示其調(diào)節(jié)壽命的可能性。

3 小 結(jié)

離體培養(yǎng)的細胞中miRNAs對衰老的影響已逐步為人們所了解，而miRNAs在體內(nèi)對于衰老及衰老調(diào)控的過程仍有待進一步探索。例如評估顯示，腫瘤細胞中的miR-34a的水平在原發(fā)性黑色素瘤樣本中，miR-34a的啟動子CpG發(fā)生甲基化〔4〕，與黑色素瘤中miR-34a的較低轉(zhuǎn)錄相一致，提示p53能上調(diào)體內(nèi)miR-34a的產(chǎn)物，更進一步支持miR-34a能在體內(nèi)誘導衰老的觀點，用于研究該過程的遺傳模型最近得到一定的發(fā)展。MiRNA合成酶Dicer等位基因缺失的模型鼠表現(xiàn)出胚胎致死性，由此研究出一種Dicer條件缺失鼠，消除MEFs中的Dicer能觸發(fā)生長停滯相關(guān)的早衰表型，上調(diào)Arf(通過阻斷泛素介導的p53降解而使p53增多)，高表達的p53及p21能增加SAHF和SA-βgal的活性，當Dicer條件鼠與ARF/p16-null鼠或p53-null鼠雜交后，消除Dicer使生成的MEFs不發(fā)生衰老，提示損傷的miRNA的生物轉(zhuǎn)化是通過Arf/p16和p53依賴通路從而啟動衰老過程〔14〕，HDFs中下調(diào)的Dicer同樣能誘導衰老的發(fā)生。

過去10年間人們對細胞衰老的觸發(fā)、標志及影響有了一定的認識，并深刻了解到機體內(nèi)的衰老是多種生理及病理過程的基礎(chǔ)，不僅僅是在腫瘤方面，同時也表現(xiàn)在動脈粥樣硬化、糖尿病、肌肉減少征、神經(jīng)退行性變、心血管及呼吸系統(tǒng)疾病等多方面。MiR-22在老化心臟中表達上調(diào)，可能加速成心肌細胞衰老并增加其遷移活性，與心臟纖維化等增齡相關(guān)的心臟改變相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)軟骨組織中miR-199a-3p、miR-193b的表達隨衰老而呈現(xiàn)上調(diào)，而miR-320c則隨老化而呈現(xiàn)下調(diào)，由此推測miR-199a-3p及miR-193b與軟骨細胞的衰老相關(guān)，而miR-320c則與軟骨細胞幼稚態(tài)相關(guān)〔15〕。在年輕的HUVECs中，miR-146a通過直接作用于NOX4蛋白而影響早熟老化樣表型，從而與細胞衰老與老化相關(guān)聯(lián)。通過比較人類、黑猩猩、恒河猴大腦皮層及小腦中增齡相關(guān)的miRNA表達水平差異，發(fā)現(xiàn)抑制miR-144表達會增加人體細胞中ATXN1水平〔16〕。在過去5年中證實了miRNAs是衰老過程的關(guān)鍵調(diào)控因素，在衰老的很多方面起到重要的作用，miRNAs能調(diào)節(jié)衰老相關(guān)的諸多重要過程?；罨腜53能增加miR-34a的轉(zhuǎn)錄，miR-34和p21是很多衰老調(diào)控蛋白的抑制因子，許多miRNAs在減少p21及p16表達水平的同時也減少了衰老細胞的數(shù)量，而p21和p16的增多可以抑制cdks并激活RB。衰老細胞同時表現(xiàn)出轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后因子水平的改變，其中有些能影響p53/p21及p16/RB衰老通路中的關(guān)鍵蛋白。以上三組蛋白共同作用時能夠停止細胞周期的進程并明顯改變衰老相關(guān)的基因表達程序。MiRNAs還能促進SASP而增加IL-6、IL-8的分泌，轉(zhuǎn)而促進局部及整體的炎癥反應，減少ECM的完整性。

近年來我國對miRNA在衰老中的作用也開展了一系列工作，研究發(fā)現(xiàn)使let-7a沉默可上調(diào)p66Shc蛋白表達水平，過表達let-7a則下調(diào)p66Shc蛋白表達水平，但無論let-7a的過表達或沉默均不影響P66Shc mRNA水平。let-7a對P66Shc翻譯的調(diào)控機制在于前者可影響后者在多核糖體及p-body的分布水平。在人二倍體成纖維細胞(2BS細胞)衰老過程中，let-7a隨細胞衰老而降低，P66Shc蛋白水平則隨細胞衰老而升高。然而，細胞衰老過程中P66Shc mRNA水平并無明顯改變，提示細胞衰老過程中P66Shc表達上調(diào)主要是轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的結(jié)果。沉默P66Shc可延緩細胞衰老，延長細胞壽限(life-span)，過表達let-7a也可通過下調(diào)P66Shc其到類似效果。相反，沉默let-7a則上調(diào)P66Shc、加速細胞衰老、縮短細胞壽限〔17〕。MiR-107在細胞衰老中起著重要作用，可能是通過脂代謝異常途徑導致細胞衰老〔18〕。統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)作為細胞衰老調(diào)節(jié)的關(guān)鍵因子，許多miRNA與衰老及衰老相關(guān)的疾病有關(guān)，已有明確的證據(jù)表明在衰老過程中表達上調(diào)的miRNA有miR-138、miR-152、miR-410、miR-431和miR-493等，而表達下調(diào)的miRNA有miR-15A、miR-20A、miR-25和miR-155等〔19〕。

盡管目前對于miRNAs在衰老中對基因表達影響的認識逐漸深入，但對于衰老改變miRNA水平的機制仍所知甚少。目睹了體內(nèi)衰老及miRNA控制衰老的相互作用后，一系列新挑戰(zhàn)及新問題呈現(xiàn)在我們面前：MiRNAs如何在機體內(nèi)影響衰老過程?哪些控制衰老的miRNAs在維持生理平衡狀態(tài)中是必須的?哪些miRNA調(diào)節(jié)了異常衰老過程中的病理生理?這些miRNAs是如何在轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后水平中被調(diào)控的？是否能通過增減miRNAs而調(diào)節(jié)衰老進程以達到治療的目地?要回答這些問題必須從組織、器官及機體的層面充分了解體內(nèi)衰老的過程，為達到該目標還必須識別普遍適用的，具有特異性且敏感度高的機體衰老細胞標記物。使用動物模型也有助于研究衰老細胞的細胞學、分子學、基因?qū)W及生化特性。衰老調(diào)控的miRNAs在動物模型體內(nèi)已有了一定的了解，相比較而言在人體內(nèi)的相關(guān)實驗相對較少，就目前階段而言要充分了解衰老miRNAs在生理相關(guān)情況下的影響尚有一定困難。更加全面地了解特異性miRNAs在衰老中的作用，同樣能夠使以miRNA為基礎(chǔ)而干預衰老相關(guān)病理改變的治療手段成為可能。MiRNAs是有力的分子工具及靶點，是在重建年齡相關(guān)的機體內(nèi)穩(wěn)態(tài)損傷中尤為顯著。

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