劉敏躍，李 鵬，龍 淼＊

（1.遼寧省農(nóng)牧業(yè)機(jī)械研究所有限公司，遼寧沈陽 110036；2.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，遼寧沈陽 110161）

原生質(zhì)體融合是20世紀(jì)70年代發(fā)展起來的基因重組技術(shù)，具有許多常規(guī)雜交方法無法比擬的獨(dú)到優(yōu)點(diǎn)：（1）克服種屬間雜交的“不育性”，可以進(jìn)行遠(yuǎn)緣雜交。（2）基因重組頻率高，重組類型多。（3）可將由其他育種方法獲得的優(yōu)良性狀，經(jīng)原生質(zhì)體融合而組合到一個菌株中。（4）存在著兩個以上親株同時參與的融合，可形成多種性狀的融合子。同基因工程方法相比，這一技術(shù)不需對試驗(yàn)菌株進(jìn)行詳細(xì)的遺傳學(xué)研究，避免了分離提純、剪切、拼接等基因操作，也不需高精尖的儀器設(shè)備和昂貴的材料費(fèi)用等（羅雯和陳志勤，2003）。隨著生物學(xué)研究手段的不斷創(chuàng)新，原生質(zhì)體融合技術(shù)的基本實(shí)驗(yàn)方法逐步完善。經(jīng)過多年的實(shí)際應(yīng)用證明，微生物原生質(zhì)體融合是一項(xiàng)十分有用的育種技術(shù)（Kim 等，2000）。

1 原生質(zhì)體融合方法

1.1 化學(xué)法——PEG結(jié)合高Ca2+法 親本原生質(zhì)體制備好后，即可進(jìn)行融合，但在自然條件下雖然也可融合，但融合率極低。自從1974年Kao和Michayluk用聚乙二醇（PEG）誘導(dǎo)大麥、大豆等植物原生質(zhì)體融合后，PEG很快用于微生物細(xì)胞的原生質(zhì)體融合。其融合效率高，適用范圍廣，在各類微生物細(xì)胞原生質(zhì)體的融合中廣泛使用。

1.2 電融合 原生質(zhì)體電融合是始于20世紀(jì)80年代的細(xì)胞改良技術(shù)。這一技術(shù)將電學(xué)與生物化學(xué)相結(jié)合，產(chǎn)生了緩和而高頻率的原生質(zhì)體融合效果。實(shí)踐證明，該技術(shù)不但廣泛用于動物和植物的細(xì)胞融合，而且在各類微生物細(xì)胞的改良中也十分有效。如原核微生物克氏固氮菌與枯草芽孢桿菌的原生質(zhì)體融合；真核微生物中的酵母菌、霉菌中的黑曲霉以及食用真菌中的蘑菇等均有原生質(zhì)體電融合的報(bào)道。

1.3 激光誘導(dǎo)融合 1987年利用激光誘導(dǎo)融合的技術(shù)迅速發(fā)展起來，并很快被應(yīng)用在動物細(xì)胞及植物原生質(zhì)體融合中，后來又被用于微生物原生質(zhì)體融合中。激光融合的優(yōu)點(diǎn)是毒性小、損傷小，但由于其所需設(shè)備昂貴復(fù)雜，操作技術(shù)難度大，很難推廣應(yīng)用。在微生物原生質(zhì)體融合中應(yīng)用激光微束技術(shù)，融合效率低，且喪失了高度選擇性的優(yōu)點(diǎn)，有賴于后續(xù)步驟檢出融合子。因此，激光誘導(dǎo)融合技術(shù)仍處于發(fā)展初期，還有待于進(jìn)一步完善。

2 原生質(zhì)體融合子篩選方法

融合體中除重組體外，還有異核體或部分結(jié)合子、雜合二倍體或雜合系，這些都會在平板上形成菌落，檢出融合體的方法有多種，在育種工作中可根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮臀⑸锊煌右赃x擇。

2.1 利用營養(yǎng)缺陷型標(biāo)記篩選融合子 這是常見而有效的傳統(tǒng)選擇標(biāo)記方法，其檢出設(shè)計(jì)原則是將親本菌株誘變處理后產(chǎn)生對某些營養(yǎng)物質(zhì)合成途徑受阻的突變株，在分離的培養(yǎng)基上只有融合子生長而不能讓突變的雙親本原生質(zhì)體形成菌落。融合的雙親帶有不同營養(yǎng)缺陷型標(biāo)記，原生質(zhì)體融合處理后的混合物直接分離到基本培養(yǎng)基上就可以檢出融合子。

2.2 利用抗藥性標(biāo)記篩選融合子 微生物抗藥性是菌種的重要特性，是由遺傳物質(zhì)決定的，不同種的微生物對某一種藥物的抗性存在差異，利用這種差異即可對融合子進(jìn)行選擇。Bradshaw Perdy首先用這種方法檢出了融合子。他們以Apergillusrugulosus（營養(yǎng)缺陷型，吖啶黃抗性）和Apergillusrugulosus（原養(yǎng)型，吖啶黃敏感）為雙親本，經(jīng)原生質(zhì)體融合處理后在含有25 μg/mL或50 μg/mL吖啶黃的基本培養(yǎng)基上檢出融合子。但應(yīng)用此法須注意藥物濃度，過高會使融合頻率降低，過低則會使親本生長，影響融合子的檢出。

2.3 利用熒光染色法篩選融合子 熒光染色法是事先將雙親染色而攜帶不同熒光色素（DAPI，F(xiàn)TTC）標(biāo)記，然后在顯微操作器和熒光顯微鏡下，挑取同時帶有雙親原生質(zhì)體熒光標(biāo)記的融合子，直接分離到再生培養(yǎng)基上再生，最后得到融合子。本法簡便易行，保持了親本的優(yōu)良遺傳特性，是融合子選擇法的發(fā)展趨勢，但對儀器設(shè)備要求高，且費(fèi)用高，有條件的實(shí)驗(yàn)室采用此法能提高融合效率。

2.4 利用滅活原生質(zhì)體標(biāo)記篩選融合子 利用滅活原生質(zhì)體標(biāo)記篩選融合子的原理是在原生質(zhì)體融合之前，對單親或雙親原生質(zhì)體進(jìn)行滅活，使其喪失再生的能力，當(dāng)與另一親株融合后，代謝上得到互補(bǔ)，能夠存活。滅活的方法很多，主要有熱滅活法和紫外滅活法，某些化學(xué)藥劑（如碘乙酸）滅活法等。將融合親本之一原生質(zhì)體滅活，即可根據(jù)另一親本的特性設(shè)計(jì)選擇條件篩選融合子。由于滅活原生質(zhì)體融合減少了尋找穩(wěn)定遺傳標(biāo)記的繁瑣工作及由此可能帶來的親株優(yōu)良性狀的丟失，因此是獲得遺傳重組的一條有利途徑；而且在不利用選擇培養(yǎng)基的情況下即可減少親株的生長，從而提高了篩選效率，因而在融合子篩選上的應(yīng)用也較為廣泛（王燕，2007；高玉榮等，2006），但滅活法的不足之處是融合頻率下降。

2.5 雙親對碳源利用不同而檢出融合子 利用親株對各種碳源利用差異，結(jié)合其他特性分離篩選出融合子。如釀酒酵母89-1為呼吸完整，不能利用木糖，對放線菌酮敏感的一株酵母菌。另一株親株是經(jīng)誘變劑處理后的呼吸缺陷型菌株，但能夠抗20 μg/mL放線菌酮。當(dāng)這兩親本融合后，融合子能在含有木糖和20 μg/mL放線菌酮的選擇培養(yǎng)基上生長。通過此方法可將融合子篩選出來，但此法適應(yīng)的菌種范圍相對較小。

2.6 融合子的其他篩選方法 以上幾種方法可以較準(zhǔn)確地選出融合子，還有一些輔助性方法可用于融合子的檢測。雖然用這些方法單獨(dú)定論是否為融合子證據(jù)不充分，但他們各自都從不同方面證實(shí)融合發(fā)生，因而常被用作非人工標(biāo)記鑒別融合子的輔助性方法，主要用于：（1）對昆蟲的毒力測定進(jìn)行融合子的選擇；（2）利用形態(tài)差異選擇融合子，這一方法首先要求所采用的菌株具有可供肉眼直接觀察的形態(tài)學(xué)差異，目前只有在青霉的育種過程中采用這種方法；（3）生化測定指標(biāo)選擇融合子，通常測定的生化項(xiàng)目有DNA含量、氨基酸含量、酸性磷酸酶、同工酶和電泳等。一般來說，融合子的DNA含量高于任何一個親本的DNA含量，但卻少于雙親DNA含量之和。融合子與雙親氨基酸含量百分比不同，融合子和親本的酸性磷酸酶同工酶和酯酶同工酶酶譜電泳結(jié)果也不同。

以上是一些常見的融合子篩選方法，實(shí)際應(yīng)用中往往是將上述這些方法進(jìn)行結(jié)合使用。如將營養(yǎng)缺陷型與抗藥性、抗藥性與原生質(zhì)體滅活等相結(jié)合選擇融合子。

3 原生質(zhì)體的鑒定方法

原生質(zhì)體融合過程中，先是細(xì)胞質(zhì)融合然后才是細(xì)胞核融合，所以融合產(chǎn)物可能有兩種：合核體（細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核產(chǎn)物）和異核體（細(xì)胞質(zhì)融合產(chǎn)物），前者遺傳穩(wěn)定，為真正的融合子，后者不穩(wěn)定，容易發(fā)生性狀分離。因此，要得到真正的融合子，必須進(jìn)行數(shù)代的自然分離和選擇鑒定（陳代杰和朱寶泉，1994）。融合子的鑒定一般從形態(tài)學(xué)、生理生化特性、生長速度、生物量、遺傳學(xué)（基因型、核型、DNA含量、GC比等）和同工酶等分析實(shí)現(xiàn)。近年來，也有人通過DNA限制內(nèi)切酶酶切片段圖譜比較、核苷酸序列分析、分子雜交、RAPD技術(shù)等分子生物學(xué)方法來鑒定融合子（孫劍秋和周東坡，2002）。

菌落形態(tài)觀察：采用巨大菌落法。融合產(chǎn)物在平板上長出的菌落形態(tài)一般有兩種：兩親本類型和非親本類型，后者很可能就是融合子。

菌體形態(tài)觀察：融合子在傳代初期，細(xì)胞形態(tài)差異很大，隨著傳代次數(shù)的增加，細(xì)胞形態(tài)趨于穩(wěn)定。

菌體細(xì)胞大?。阂话阌蔑@微測微尺分別測量親株和融合子的長軸、短軸，按公式：V=4/3·π·a/2·（b/2）2計(jì)算。研究表明，融合子細(xì)胞體積并非為兩親株細(xì)胞體積之和，而是略大于或介于兩親株之間。有研究發(fā)現(xiàn)，融合子的細(xì)胞體積在傳代過程中有逐漸縮小的趨勢，一般恢復(fù)到與親本大小相近的程度，但軸比及體積仍與同親本有一定差別。

DNA含量：有的融合子DNA含量接近兩親株DNA含量之和，有的介于兩親株之間。這種現(xiàn)象一般認(rèn)為是由于融合子在傳代穩(wěn)定過程中部分親本染色體丟失引起的。

生理生化特性：優(yōu)良的融合子應(yīng)兼具雙親的優(yōu)良特性。對融合子生理生化特性的分析一般針對兩親株生理特性的差異進(jìn)行，包括生長溫度、耐酒精濃度、碳源/氮源底物分解利用情況、營養(yǎng)需求等。

核染色：融合過程中，兩親株原生質(zhì)體在促融因子作用下先發(fā)生凝集、接觸，再進(jìn)行細(xì)胞質(zhì)融合，進(jìn)而可能發(fā)生核融合。所以在選擇培養(yǎng)基上長出的融合產(chǎn)物有兩種：真正的融合子（細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核都發(fā)生了融合）和異核體（只有細(xì)胞質(zhì)發(fā)生了融合）。Gimsa染色、Feulgen染色、蘇木精染色或 4，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）熒光染色都能清楚地看到核相，從而使異核體得到排除（焦瑞身，1989）。

同工酶電泳：一般通過乙醇脫氫酶同工酶、酯酶同工酶電泳對融合產(chǎn)物加以鑒定。若融合物具有兩親株的譜帶，則可證明是真正的融合子。

4 原生質(zhì)體融合育種技術(shù)的應(yīng)用

4.1 在抗生素生產(chǎn)上的應(yīng)用 原生質(zhì)體融合技術(shù)不僅可用于提高抗生素的產(chǎn)量，同時還可用于融合子產(chǎn)生新的抗生素的研究。柳君科（1989）將產(chǎn)生慶大霉素的棘孢小單孢菌（Micromonospora ech inospora）與鏈霉素產(chǎn)生菌灰色鏈霉菌素（Streptomyces griceus）進(jìn)行原生質(zhì)體融合，其融合子產(chǎn)生慶大霉素的產(chǎn)量比親本菌明顯提高。賀敏霞等（1989）通過將諾卡氏菌原生質(zhì)體融合重組得到了一株簡體轉(zhuǎn)化活力明顯高于親本的融合子。林榮團(tuán)和楊毓芬（1990）以天然無抗菌活性的變青鏈霉菌1326與鏈霉菌1254營養(yǎng)缺陷型突變株進(jìn)行種間原生質(zhì)體融合，從755株融合體中篩選到5株抗菌活性較穩(wěn)定的菌株。徐京寧等（1992）將金色鏈霉菌（Streptomuces.au reofaciens）和林可鏈霉菌（Streptomycesl incolnensis）的原生質(zhì)體融合，其融合株能在孢內(nèi)積累一種新的具抗菌活性的物質(zhì)，其性質(zhì)不同于兩親株所產(chǎn)生的抗生素金霉素和林可霉素。曾洪梅和張震霖（1995）通過原生質(zhì)體融合的方法提高了農(nóng)抗武夷菌素的效價。朱昌雄和李永慧（1996）通過對中生菌素高產(chǎn)菌株采用原生質(zhì)體融合等4種育種方法，結(jié)果表明所用方法都能有效地提高中生菌素產(chǎn)生菌的效價。陳五嶺（1997）對金霉素鏈霉菌和龜裂鏈霉菌原生質(zhì)體融合，融合子產(chǎn)抗生素能力及遺傳穩(wěn)定性均優(yōu)于金霉素鏈霉菌。王金盛和李春波（1998）用電場誘導(dǎo)棘孢小單胞菌原生質(zhì)體融合，得到產(chǎn)小諾霉素（MCR）量高于親株的融合子。

4.2 在防治動物疾病上的應(yīng)用 王興龍等（1994）進(jìn)行了多殺性巴氏桿菌×73株與P1059株原生質(zhì)體融合株的構(gòu)建，融合株兼具有兩親本株的抗原性和雙抗藥性，從而為研究新型的禽多殺性巴氏菌雙價菌苗奠定了基礎(chǔ)。張?jiān)偷龋?995）進(jìn)行了痢疾桿菌P15和E弧菌8822原生質(zhì)體融合的初步研究，獲得兼有兩親株遺傳性狀的融合子。任濤等 （1998）進(jìn)行了大腸桿菌O2（Norr，Chls）、O78（Chlr，Nors）原生質(zhì)體制備和再生。蔣文泓和黃青云（1999）以耐藥標(biāo)記的禽多殺性巴氏桿菌5A弱毒菌株與禽大腸桿菌02弱毒菌株作親本進(jìn)行原生質(zhì)體融合后再生，成功地獲得3株具有雙親本耐藥性和雙菌體血清型的融合菌株，獲得具有多種疾病免疫力的疫苗生產(chǎn)菌株。吳孔興等（2002）進(jìn)行了禽巴氏桿菌、大腸桿菌融合二聯(lián)弱毒菌株的培育。鐘蕾等（2002）進(jìn)行了腸型點(diǎn)狀氣單胞菌和魚害黏球菌融合子的構(gòu)建，獲得了制備這種融合疫苗的遺傳性穩(wěn)定的融合菌株。這些都為動物疫病防治探索出了一條新的途徑。

4.3 在改良菌種及優(yōu)化菌種特性上的應(yīng)用 許多微生物能在較高的溫度下生存，有的能在45～65℃甚至更高溫度下生長。有的耐熱菌可在98℃的溫泉中生長繁殖。這種耐熱特性在工業(yè)上具有很重要的應(yīng)用價值，比如在酒精釀造中，釀酒酵母在40℃時產(chǎn)酒率明顯下降，要降低發(fā)酵液的溫度，必須消耗大量能源，因?yàn)樵诶w維素類物質(zhì)同步糖化發(fā)酵（SSF）過程中制約反應(yīng)效率的一個重要因素是纖維素酶的最適溫度同酵母發(fā)酵的最適溫度的不一致性，纖維素酶的最適溫度為45～50℃，而酵母發(fā)酵的控制溫度一般在30℃左右，選用耐高溫酵母菌株是解決纖維素同步發(fā)酵中這兩個溫度不協(xié)調(diào)的有效方法。Seki等（1983）、方靄祺和李紹蘭（1990）通過原生質(zhì)體融合分別獲得了42℃條件下發(fā)酵產(chǎn)酒精體積分?jǐn)?shù)為6.0%和40℃發(fā)酵產(chǎn)酒精體積分?jǐn)?shù)為5.9%的耐高溫酵母。文鐵橋和趙學(xué)慧（1999）通過耐高溫的克魯維酵母和產(chǎn)酒率高的釀酒酵母進(jìn)行屬間原生質(zhì)體融合，獲得了在45℃下發(fā)酵產(chǎn)酒精體積分?jǐn)?shù)為7.14%的融合子。孫君社等（2002）通過原生質(zhì)體融合獲得了在固態(tài)發(fā)酵45℃時產(chǎn)酒能力達(dá)到體積分?jǐn)?shù)為7.28%的融合子。

由于自身生長條件的限制，許多菌種如雙歧桿菌是嚴(yán)格的厭氧菌，生長相對緩慢，需經(jīng)F6PPK的特殊途徑發(fā)酵葡萄糖，對氧極為敏感，暴露在空氣中易死亡，給雙歧桿菌微生態(tài)制劑的生產(chǎn)、開發(fā)帶來困難，其制劑中的活菌數(shù)也難以長時間維持，極大地限制了其在食品工業(yè)中的應(yīng)用。張莉滟和張德純（2003）將兼性厭氧菌保加利亞乳桿菌熱滅活的原生質(zhì)體作為遺傳物質(zhì)供體，采用電融合方法，誘導(dǎo)其原生質(zhì)體與雙歧桿菌融合，將其耐氧基因隨機(jī)整合到長雙歧桿菌中，提高了其耐氧能力。黎永學(xué)等（2002）將雙歧桿菌和釀酒酵母原生質(zhì)體融合，初篩出具有雙歧桿菌和釀酒酵母生物學(xué)特性、較穩(wěn)定的融合細(xì)胞株BSF1和BSF2，克服了雙歧桿菌因厭氧而不易開發(fā)利用的難題，為益生菌種的改良提供了新思路。

嗜酸乳桿菌（L.acidophilus）是人和動物腸道中重要的微生物，口服乳酸菌需要菌體能夠通過低pH胃液存活下來，還要耐受腸道內(nèi)的膽鹽濃度，但不是所有的嗜酸乳桿菌都能耐受低pH和高濃度膽鹽環(huán)境，王玉華等（2006）利用原生質(zhì)體融合技術(shù)獲得一株能耐酸耐膽鹽能力強(qiáng)的菌株La-F1，并且其生長特性符合乳酸發(fā)酵食品的要求，也可用在發(fā)酵肉制品、醫(yī)藥和飼料工業(yè)中。

5 原生質(zhì)體融合育種存在的問題

原生質(zhì)體融合技術(shù)雖取得了較大的發(fā)展，但也存在著許多問題和困難。雖然細(xì)胞融合階段不存在異種間的任何不親和性，但在核融合染色體交換、雜交，以及融合雜種細(xì)胞隨后的發(fā)育過程中，遠(yuǎn)源物種之間仍存在著嚴(yán)重的不親和性和排斥性，有時并未發(fā)生真正的核融合，兩親本的染色體是相互保守甚至是排斥的，它們所帶的基因無法在一個細(xì)胞中同時表達(dá)出來，最終產(chǎn)生了分離。原生質(zhì)體融合技術(shù)的另一困難是雜種鑒定問題。雜種鑒定往往需要從遺傳、生化等方面獲得有利的證據(jù)。所以首選兩親本也應(yīng)有某些生化或遺傳標(biāo)記，但在自然界帶有這類標(biāo)記的細(xì)菌很少，雖可通過人工誘導(dǎo)產(chǎn)生突變體，而獲得一個真正的突變體不經(jīng)過幾年的時間是無法獲得的，而單親滅活原生質(zhì)體可顯著縮短融合工序和時間，提高篩選效率，但融合的頻率明顯降低。

6 小結(jié)

綜上所述，原生質(zhì)體融合技術(shù)為遺傳操縱、分子生物學(xué)和基礎(chǔ)理論研究提供了一種重要工具，也為遺傳育種改良提供了一種有效手段，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于各個領(lǐng)域，尤其為微生物育種提供了一種簡潔而高效的方法。

目前，原生質(zhì)體融合技術(shù)發(fā)展迅速、應(yīng)用廣泛，已經(jīng)成為遺傳育種的重要手段，尋找具有更高融合效率的方法有著重要意義。如基于微流控芯片的原生質(zhì)體融合技術(shù)、高通量原生質(zhì)體融合芯片、空間原生質(zhì)體融合技術(shù)、離子束原生質(zhì)體融合技術(shù)和滅活原生質(zhì)體融合技術(shù)相繼被提出并被應(yīng)用于遺傳育種中。而且高通量原生質(zhì)體融合芯片可以與化學(xué)誘導(dǎo)融合、電融合等方法相互結(jié)合，這些技術(shù)將在未來原生質(zhì)體融合育種方面的研究中發(fā)揮重要作用，相信隨著融合技術(shù)的不斷完善，原生質(zhì)體融合技術(shù)在遺傳育種中的地位將會越來越重要（王登宇等，2008）。

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