張亞妮，王世紅，孫 瓊，李 煜

銅綠假單胞菌（pseudomonas aeruginosa）是院內(nèi)感染的主要病原菌之一，具有很強的耐藥性。其產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物綠膿菌素（pyocyanin，PCN），可改變細(xì)胞內(nèi)氧化還原水平，對宿主造成氧化傷害，是導(dǎo)致銅綠假單胞菌感染病人死亡的主要 原 因 之 一［1－3］。N-乙 酰 半 胱 氨 酸 （N-acetylcysteine，NAC）是一種含有巰基的小分子化合物，常被作為抗氧化劑，用來改善細(xì)胞內(nèi)氧化還原水平［2，4］，因此在一些臨床實驗中，NAC被用來治療銅綠假單胞菌感染性疾病。但是，從目前已有的研究可以看出，NAC是否有助于銅綠假單胞菌感染性疾病的治療還沒有一致的觀點，具體機制也并不清楚。在本研究中，為了進(jìn)一步明晰NAC與銅綠假單胞菌感染性疾病的關(guān)系，我們研究了NAC與銅綠假單胞菌的耐藥性和毒性分泌關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 抗生素：卡那霉素（kanamycin sulfate，Kan）、氯霉素（chloramphenicol，Cm）、慶大霉素（gentamycin sulfate，Gm）、紅霉素（erythromycin，Em）購自 Amresco公司；四環(huán)素（tetracyclin HCl，Tet）、氨芐青霉素（ampicillin，Amp）、硫酸鏈霉素（steptomycin sulfate，Strep）購自 Genview公司。酵母粉與蛋白胨購自O(shè)XOID公司；NAC購自Sigma公司。

1.2 細(xì)菌、培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件 本研究所用銅綠假單胞菌為實驗室保存的野生型菌株P(guān)AO1。LB培養(yǎng)基和PIA培養(yǎng)基按常規(guī)方法配置。37℃培養(yǎng)菌體，液體培養(yǎng)時，搖床轉(zhuǎn)速為 200 r·min－1。

1.3 抗生素抑菌活性測定 抑菌活性測定按照文獻(xiàn)［5］方法，采用瓊脂擴散法測定抑菌圈大小和最小抑制濃度（MIC）兩種方法。

1.4 綠膿菌素（PCN）的測定 按照文獻(xiàn)［6］所述測定。

2 結(jié)果

2.1 NAC影響抗生素對銅綠假單胞菌的抗菌活性 NAC配制成50 g·L－1儲備液，過濾滅菌存放在－20℃條件下。在本研究中，選用7種不同的抗生素，分別為Kan、Gm、Cm、Tet、Amp、Em、Strep，這些抗生素可作為一些主要類別抗生素的代表。用濾紙片瓊脂擴散法和MIC法測定NAC影響銅綠假單胞菌對不同抗生素的敏感性變化。結(jié)果顯示，在LB培養(yǎng)基中添加1 g·L－1的NAC后，與對照組比較，NAC可以降低銅綠假單胞菌對Gm、Em、Kan和 Strep的敏感性，增加對Cm、Amp、Tet的敏感性。在 1g·L－1的 NAC存在條件下，Kan的 MIC從 120 mg·L－1上升到 480 mg·L－1，Strep的MIC從12.5 mg·L－1上升到125 mg·L－1，而 Cm的 MIC從30 mg·L－1下降到6 mg·L－1，Tet的 MIC從8 mg·L－1下降到 2.5 mg·L－1。

2.2 NAC對銅綠假單胞菌綠膿菌素產(chǎn)量的影響 PCN是銅綠假單胞菌分泌的一種藍(lán)綠色次級代謝產(chǎn)物，是重要的致病因子和促炎介質(zhì)。為了了解NAC對PCN的影響，在銅綠假單胞菌液體培養(yǎng)過程中添加1g·L－1的NAC，發(fā)現(xiàn)加NAC的培養(yǎng)液顏色與對照組顏色差別很大，對照組可明顯看到藍(lán)綠色的PCN產(chǎn)生，而加NAC的培養(yǎng)液顏色較淡。對PCN的產(chǎn)量進(jìn)行測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PAO1的平均PCN產(chǎn)量為2.9 mg·L－1，而在培養(yǎng)過程中加 NAC后，PCN產(chǎn)量明顯下降到1.86 mg·L－1。這表明NAC可以降低銅綠假單胞菌的PCN產(chǎn)量。

3 討論

對于NAC等抗氧化劑在治療銅綠假單胞菌感染性疾病過程中，是否起到積極地作用，存在不同的研究結(jié)果。銅綠假單胞菌感染的囊性纖維化病人和慢性肺病病人口服和吸入霧化的NAC可以明顯改善肺部和支氣管的感染癥狀［7－9］，改善最大呼氣流速率、最大肺活量和最大呼氣流量容積［10］。但 Decramer等［11］研究認(rèn)為，NAC對于阻止肺功能惡化和病情加劇是無效的。Stey等［12］對公開發(fā)表文獻(xiàn)中2011個口服NAC的病人進(jìn)行了統(tǒng)計，分析NAC是否有助于病情的緩解及治愈，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，口服NAC可以降低病情加重的風(fēng)險，改善慢性支氣管炎的癥狀。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)NAC對抗生素的抑菌作用有很大程度的影響，并且能夠明顯降低PCN的產(chǎn)量。因此，NAC用于銅綠假單胞菌感染病人的治療應(yīng)該是有益的，但是與抗生素聯(lián)合用藥時，要考慮NAC對不同抗生素抑菌能力的改變。本研究結(jié)果為NAC的臨床聯(lián)合用藥提供了有力的科學(xué)支撐，并為后續(xù)研究NAC工作提供一定的思路和參考價值。

參考文獻(xiàn)：

［1］ Price-Whelan A，Dietrich L E，Newman D K.Rethinking‘secondary’metabolism：physiological roles for phenazine antibiotics［J］.Nat Chem Biol，2006，2（2）：71－8.

［2］ Repine JE，Bast A，Lankhorst I.Oxidative stress in chronic obstructive pulmonary disease.Oxidative Stress Study Group［J］.Am J Respir Crit Care Med，1997，156（2 Pt 1）：341－57.

［3］ Lau G W，Hassett D J，Ran H，et al.The role of pyocyanin in Pseudomonas aeruginosa infection［J］.Trends Mol Med，2004，10（12）：599－606.

［4］ Fink M P.Role of reactive oxygen and nitrogen species in acute respiratory distress syndrome［J］.Curr Opin Crit Care，2002，8（1）：6－11.

［5］ 張亞妮.谷胱甘肽與銅綠假單胞菌致病性及抗生素抗性的關(guān)系研究［D］.西北大學(xué)，2009.

［5］ Zhang Y N.The Roles of Glutathione in Pseudomonas aeruginosa Pathogenicity and Antibiotic Resistance［D］.Northwest University，2009.

［6］ Essar D W，Eberly L，Hadero A，Crawford I P.Identification and characterization of genes for a second anthranilate synthase in Pseudomonas aeruginosa：interchangeability of the two anthranilate synthases and evolutionary implications［J］.J Bacteriol，1990，172（2）：884－90.

［7］ Tirouvanziam R，Conrad C K，Bottiglieri T，et al.High-dose oral N-acetylcysteine，a glutathione prodrug，modulates inflammation in cystic fibrosis［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2006，103（12）：4628－33.

［8］ Kao L W，Kirk M A，F(xiàn)urbee R B，et al.What is the rate of adverse events after oral N-acetylcysteine administered by the intravenous route to patients with suspected acetaminophen poisoning？［J］.Ann Emerg Med，2003，42（6）：741－50.

［9］ Zuin R，Palamidese A，Negrin R，et al.High-dose N-acetylcysteine in patients with exacerbations of chronic obstructive pulmonary disease［J］.Clin Drug Investig，2005，25（6）：401－8.

［10］ Stafanger G，Koch C.N-acetylcysteine in cystic fibrosis and Pseudomonas aeruginosa infection：clinical score，spirometry and ciliary motility［J］.Eur Respir J，1989，2（3）：234－7.

［11］Decramer M，Rutten-van Molken M，Dekhuijzen P N，et al.Effects of N-acetylcysteine on outcomes in chronic obstructive pulmonary disease（Bronchitis Randomized on NACCost-Utility Study，BRONCUS）：a randomised placebo-controlled trial［J］.Lancet，2005，365（9470）：1552－60.

［12］Stey C，Steurer J，Bachmann S，et al.The effect of oral N-acetylcysteine in chronic bronchitis：a quantitative systematic review［J］.Eur Respir J，2000，16（2）：253－62.