黨永輝，劉仲偉，陳 峰，郭 坤，王家蓓

1西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部法醫(yī)學(xué)院 衛(wèi)生部法醫(yī)學(xué)重點實驗室 教育部環(huán)境與疾病相關(guān)基因重點實驗室，西安710061

三聯(lián)組氨酸核苷結(jié)合蛋白1概況

含三聯(lián)組氨酸 (histidine triad，HIT)域的蛋白構(gòu)成酶類超家族，共享組氨酸-x-組氨酸-x-組氨酸-xx基序 (x為疏水性氨基酸)。按酶活性分類，HIT蛋白分為核苷氨基磷酸酯水解酶、二核苷酸水解酶、核苷轉(zhuǎn)移酶。HIT蛋白以組氨酸-x-組氨酸-x-組氨酸-xx活性位點正對底物的α-磷酸結(jié)合核苷酸。HIT蛋白在進(jìn)化中較為保守，其超家族中超過35個成員已在包括細(xì)菌、古細(xì)菌、酵母、植物、線蟲、果蠅和哺乳動物的29個物種中得以發(fā)現(xiàn)，表明它行使著基本而重要的生理功能［1］。人類基因組編碼7個HIT蛋白，可被分為5類，即三聯(lián)組氨酸核苷結(jié)合蛋白 (histidine triad nucleotide-binding protein，HINT)、半乳糖-1-磷酸尿苷?；D(zhuǎn)移酶、Aprataxin、DcpS/DCS-1以及脆性組氨酸三聯(lián)體蛋白，主要發(fā)揮核苷轉(zhuǎn)移酶和水解酶的作用［2-5］。

HINT(包括人類HINT和非人類HINT)是HIT超家族中的第1類。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在得到全長測序的所有基因組中至少存在1個HINT/Hint。人類基因組包括3個獨立的基因，分別編碼Hint1、Hint2及Hint3基因產(chǎn)物。HINT1蛋白編碼基因位于人類染色體5q31.2，其基因序列全長6 160 bp，含有3個外顯子，mRNA序列由782個堿基組成，編碼產(chǎn)物是含126個氨基酸的細(xì)胞溶質(zhì)蛋白，相對分子質(zhì)量約 14 ×103［2，6］。晶體學(xué)和核磁共振波譜法結(jié)構(gòu)研究結(jié)果表明，HINT1屬嘌呤核苷酸結(jié)合蛋白［7-9］。HINT1形成同源二聚體，每一個亞單位結(jié)合1個核苷酸。1990年HINT1被首度發(fā)現(xiàn)是蛋白激酶抑制劑［10］，在早期文獻(xiàn)中一直被當(dāng)作蛋白激酶C抑制劑-1［11-12］。然而其蛋白激酶C抑制作用現(xiàn)在被認(rèn)為是存疑的，也正因為如此，蛋白激酶C抑制劑-1被重新命名為HINT1［7］。

HINT1的酶活性

研究顯示HINT1能夠水解在很多真核生物由AMP-SO4和NH3合成的細(xì)胞內(nèi)溶質(zhì)AMP-NH2［13-15］。而組氨酸—丙氨酸突變使該酶的活性喪失，因此其單胺磷酸酯酶活性依賴于HIT域中的第2個組氨酸殘基［13］。AMP-NH2的生理作用未知，可能不是HINT1的天然底物。HINT1能夠水解結(jié)合于腺苷酸化蛋白賴氨酸殘基的AMP加成化合物，因而可能調(diào)控蛋白底物的核苷酸化［2］。Chou等［16］應(yīng)用敏感、連續(xù)的熒光方法測定氨基磷酸酯的水解活性以研究HINT1的底物特異性，HINT1表現(xiàn)出對嘧啶氨基磷酸酯上嘌呤的優(yōu)先結(jié)合特性。

使用純化的賴氨酰-tRNA合成酶，Chou和Wagner［17］證實賴氨酰-AMP是HINT1的底物，這產(chǎn)生了酶的腺苷酸化形式。這一發(fā)現(xiàn)使人們注意到HINT1參與一系列細(xì)胞功能。氨酰-tRNA合成酶是聯(lián)合氨基酸與其相應(yīng)同工tRNA形成氨酰-tRNAs的重要酶，這一反應(yīng)通過形成氨酰-AMP中間產(chǎn)物而進(jìn)行。氨酰-tRNA合成酶在調(diào)控轉(zhuǎn)錄、翻譯、剪切、炎癥、血管發(fā)生和凋亡中具有多種生理功能［18］。幾種氨酰-tRNA合成酶 (E、I、L、R、Q、M、K、D)與3種氨酰-tRNA合成酶相互作用多功能蛋白 (aminoacyl-tRNA synthetase-interacting multifunctional proteins，AIMP)1/p43、 AIMP2/p38以及AIMP3/p18關(guān)聯(lián)而形成大分子復(fù)合物。AIMP1是內(nèi)皮單核細(xì)胞活化多肽Ⅱ的前體，是一種致炎性細(xì)胞因子，可以增加成纖維細(xì)胞的增殖和膠原生成，誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的遷移，并可激活巨噬細(xì)胞［19］。AIMP2是一種與p53相互作用的致凋亡因子［20］。AIMP3則是一種腫瘤抑制因子，可以激活對受損DNA的修復(fù)［18］。賴氨酰-tRNA合成酶對于增加前述復(fù)合物的穩(wěn)定性是必需的［21］。研究顯示人類賴氨酰-tRNA合成酶可由多種細(xì)胞系分泌，并與細(xì)胞表面趨化因子受體相互作用刺激腫瘤壞死因子的生成。色氨?；?和酪氨?；?tRNA合成酶也可產(chǎn)生細(xì)胞因子，但與以上復(fù)合物作用無關(guān)［21-22］。

HINT1與腫瘤

自HINT1發(fā)現(xiàn)以來，首先發(fā)現(xiàn)其與腫瘤具有相關(guān)性，因而該領(lǐng)域的研究相對較為深入。

HINT1的抑癌基因作用 Su等［23］報道給予致癌物，Hint1基因敲除小鼠更容易罹患腫瘤。不只是Hint1基因敲除 (KO，－/－)小鼠，雜合 (+/－)小鼠同樣比野生型 (WT，+/+)小鼠更容易被誘導(dǎo)出乳腺和卵巢腫瘤，這意味著HINT1是單倍劑量不足腫瘤抑制因子［24］。

有研究表明在HINT1、賴氨酰-tRNA合成酶、黑色素瘤癌基因小眼畸形轉(zhuǎn)錄因子 (microphthalmia transcription factor，MITF)(MITF表達(dá)可以轉(zhuǎn)化人類原初黑素細(xì)胞，并增加其化學(xué)抗性［25］)以及在真核細(xì)胞廣泛表達(dá)的癌基因上游刺激因子2(upstream stimulatory factor 2，USF2)［26-27］之間存在著一種功能性的多種蛋白交互作用。賴氨酰-tRNA合成酶除了在tRNA氨?；邪l(fā)揮作用，同時還能產(chǎn)生信號分子二腺苷四磷酸鹽［28］。HINT1與MITF和USF2相互作用并抑制其活性，進(jìn)而發(fā)揮抑制腫瘤發(fā)生的作用，而二腺苷四磷酸鹽結(jié)合于HINT1，使HINT1從MITF、USF2上解離進(jìn)而被激活。

HINT1的啟動子在肝細(xì)胞癌中通常高度甲基化，保持HINT1在腫瘤組織中的低表達(dá)狀態(tài)［29］。因此HINT1名列易受DNA啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)影響 (使轉(zhuǎn)錄失活)的腫瘤抑制基因名單［30］。HINT1啟動子區(qū)高甲基化的程度與肝細(xì)胞癌的預(yù)后相關(guān)［31］。HINT1基因的甲基化程度越高，HINT1蛋白的表達(dá)水平越低，肝細(xì)胞癌的預(yù)后越差。Calvisi等［31］的研究表明HINT1影響S期激酶相關(guān)蛋白2的活性，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白p27KIP1降解，這些都是肝細(xì)胞癌預(yù)后不良的特征。另外，HINT1參與DNA雙鏈斷裂修復(fù)［32］，而這一發(fā)現(xiàn)很可能會改變HINT1腫瘤抑制因子的屬性。在電離輻射誘導(dǎo)DNA受損后小鼠Hint1與γ-組蛋白2AX和運動失調(diào)性毛細(xì)血管擴(kuò)張癥變異蛋白激酶復(fù)合物相互作用，導(dǎo)致兩種蛋白被活化并募集于DNA斷裂點參與DNA的損傷修復(fù)。Hint1敲除使得胚胎成纖維細(xì)胞對于電離輻射造成的細(xì)胞毒性和細(xì)胞凋亡效應(yīng)更加耐受［23］，這可能與Hint1對γ-組蛋白2AX和運動失調(diào)性毛細(xì)血管擴(kuò)張癥變異的調(diào)控作用缺失有關(guān)［32］。

HINT1介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及對腫瘤細(xì)胞周期機(jī)制的影響 腫瘤是一類多步驟發(fā)生、多基因突變所致的細(xì)胞克隆性、進(jìn)化性疾病，同時也是一類細(xì)胞周期疾病。Hint1的抑癌機(jī)制與許多細(xì)胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路以及腫瘤細(xì)胞周期機(jī)制有關(guān)。有研究顯示Hint1結(jié)合于富含SH3結(jié)構(gòu)域蛋白 (protein“plenty of SH3 domains”，POSH)，POSH是一種支架蛋白，參與由Rac-1、混合譜系激酶3(mixed lineage kinase 3，MLK3)、促分裂原活化蛋白激酶激酶4/7和Jun氨基末端激酶1/2形成的復(fù)合物［33-34］。POSH能夠激活JNK并引起細(xì)胞凋亡，同時它的異位表達(dá)可以激活細(xì)胞核因子-κB信號通路，從而促進(jìn)p65往核內(nèi)轉(zhuǎn)運，增強(qiáng)目的基因的表達(dá)［35］。另有研究表明，POSH的過度表達(dá)能夠促進(jìn)神經(jīng)元的凋亡［36］，而用反義寡核苷酸和siRNA沉默POSH能抑制JNK活性和由撤回神經(jīng)生長因子介導(dǎo)的神經(jīng)元細(xì)胞凋亡［36］，同時可通過抑制混合譜系激酶3-促分裂原活化蛋白激酶激酶4-Jun氨基末端激酶信號通路和細(xì)胞凋亡蛋白酶3活性來預(yù)防局部缺血性損傷［37］。從另一個方面看，凋亡也可以增加POSH和MLKs在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)［38］。Hint1/POSH的交互作用顯著降低JNK2磷酸化活化蛋白1(癌細(xì)胞中的一種重要轉(zhuǎn)錄因子［33］)的能力從而抑制癌細(xì)胞的增殖。除了抑制活化蛋白-1的轉(zhuǎn)錄活性之外，HINT1也可以與S期激酶相關(guān)蛋白2-SCF泛素連接酶復(fù)合物相互作用，并抑制這一復(fù)合物的形成，調(diào)控細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白p27KIP1的泛素化水平影響細(xì)胞周期［39］。

HINT1通過與細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白依賴激酶Cdk7相互作用而調(diào)控基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄因子TFIIH與靶基因的結(jié)合［13，40］。利用酵母雜交實驗也證實了 Hint1和 Kin28之間 (在哺乳動物分別是HINT1和Cdk7)相互作用，同時破壞Hint1和Kin28之間的相互作用會導(dǎo)致細(xì)胞周期延長和菌落形成減少［40］。但是，Hint1－/－小鼠未能表現(xiàn)出與Hint1調(diào)控Cdk7活性作用相一致的表型［41］。

Weiske 和 Huber［42］證實 HINT1 與 β-連環(huán)蛋白配體Pontin和Reptin之間存在相互作用，從而抑制三元復(fù)合物因子 (ternary complex factor，TCF)-β-連環(huán)蛋白的轉(zhuǎn)錄活性，進(jìn)而抑制Wnt信號通路靶基因，如axin2和細(xì)胞周期蛋白D1的表達(dá)。免疫沉淀實驗結(jié)果顯示，HINT1不能直接與β-連環(huán)蛋白或者LEF-1結(jié)合，不影響LEF-1/β-連環(huán)蛋白的相互作用，也不干擾Pontin或 Reptin與 β-連環(huán)蛋白的結(jié)合，確切來說，HINT1干擾Pontin/Reptin復(fù)合物，能夠結(jié)合于組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶Tip60［43］。這個結(jié)果表明HINT1/Tip60復(fù)合物至少對一部分TCF/β-連環(huán)蛋白靶基因具有抑制作用。

將HINT1瞬時轉(zhuǎn)染于SW480和MCF-7細(xì)胞，可以引起p53、Bax表達(dá)增加以及Bcl-2表達(dá)減少，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，而HINT1蛋白的下調(diào)則降低p53和Bax的表達(dá)，進(jìn)一步研究表明HINT1與Tip60形成復(fù)合物可以與Bax的啟動子結(jié)合而激活其轉(zhuǎn)錄活性［44］。

HINT1與神經(jīng)精神疾病

HINT1在中樞神經(jīng)系統(tǒng)廣泛表達(dá)［45-47］，提示它在正常神經(jīng)元生理功能或在神經(jīng)精神疾病病理條件下可能發(fā)揮重要作用。HINT1基因位于5q31.2遺傳位點內(nèi)，這一區(qū)域與精神分裂癥關(guān)聯(lián)［48-49］。Vawter等［50-51］采用芯片技術(shù)篩選顯示HINT1 mRNA在精神分裂癥患者背外側(cè)前額皮質(zhì) (dorsolateral prefrontal cortex，DLPFC)表達(dá)水平較低，這一發(fā)現(xiàn)為其隨后的RT-PCR和原位雜交實驗所進(jìn)一步證實［52］。另一項對染色體5q22-33區(qū)域進(jìn)行的精細(xì)定位研究顯示SPEC2/PDZ-GEF2/ACSL6區(qū)域單體型與精神分裂癥關(guān)聯(lián)，而Hint1基因位于這一區(qū)域中［53］。此后利用患者群體和患者死后腦組織的多項研究均提示這種關(guān)聯(lián)的存在［6，54-55］，而這種關(guān)聯(lián)呈性別特異性，僅與男性患者有關(guān)［6，52-53］。缺乏Hint1的小鼠對甲基苯丙胺和多巴胺受體激動劑阿撲嗎啡的自主活動反應(yīng)增強(qiáng)，表明缺乏Hint1導(dǎo)致突觸后水平多巴胺傳遞的異常［56］，這也是精神分裂癥可能的發(fā)病原因之一［57］。

最近，人類Hint功能喪失已被認(rèn)為是遺傳性周圍神經(jīng)病的原因。一項對33個無關(guān)核心家庭50例患者的全基因組單核苷酸多態(tài)性分析表明，人類Hint1活性的喪失與具有神經(jīng)肌強(qiáng)直表現(xiàn)的常染色體隱性軸突神經(jīng)病變這一遺傳性周圍神經(jīng)病存在強(qiáng)烈關(guān)聯(lián)，成為第1個被發(fā)現(xiàn)與人類Hint1酶活性相關(guān)的疾病表型［45］。此外還發(fā)現(xiàn)HINT1調(diào)制精神活性物質(zhì)的效應(yīng)。HINT1與μ阿片受體特異性相互作用，緩和蛋白激酶C調(diào)節(jié)的μ阿片受體的磷酸化和脫敏［58］?；蜿P(guān)聯(lián)研究表明Hint1基因變異與尼古丁依賴有關(guān)［59］。缺乏HINT1的小鼠基礎(chǔ)痛閾增加，嗎啡誘導(dǎo)的鎮(zhèn)痛效應(yīng)增強(qiáng)，對嗎啡的耐受增加［58］。

HINT1在調(diào)制情緒行為中也發(fā)揮重要作用。HINT1在雙相障礙患者DLPFC腦組織中表達(dá)下降［60］，在抑郁癥患者DLPFC表達(dá)上升［61］;而HINT1－/－小鼠則存在躁狂樣表現(xiàn)［62］，且焦慮樣行為增加，在不良環(huán)境條件下，情緒喚醒程度升高［62-64］。另外，HINT1蛋白還被發(fā)現(xiàn)在Down’s綜合征胎兒腦中下調(diào)［65］。

HINT1與其他疾病

糖尿病 Chu等［66］采用弱陽離子交換磁珠法純化樣本，基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜方法檢測來自28份2型糖尿病患者和29份健康個體隨機(jī)尿樣本，結(jié)果顯示與健康對照相比，3種不同表達(dá)的肽在2型糖尿病中減少，其中一種被鑒定為HINT1，研究人員據(jù)此認(rèn)為HINT1可被視為區(qū)分2型糖尿病患者和健康對照的潛在生物標(biāo)志物。

肝臟缺血/再灌注 在醫(yī)學(xué)研究中，尋求能夠降低缺血/再灌注 (ischemia/reperfusion，I/R)損傷的細(xì)胞通路一直是個前沿問題，其臨床需求十分迫切。Martin等［67］對 Hint1 KO以及 WT小鼠 (外購)進(jìn)行70%肝臟缺血后再灌注3或24 h，結(jié)果顯示與對照組相比，I/R后，Hint1 KO小鼠血清轉(zhuǎn)氨酶、肝實質(zhì)壞死、肝細(xì)胞凋亡顯著減少，細(xì)胞凋亡蛋白Bax表達(dá)減少2倍以上;而WT小鼠活性氧和血紅素加氧酶-1表達(dá)增加，KO小鼠未見增加;KO小鼠磷酸化Src和p65核轉(zhuǎn)運增加，磷酸化c-Jun核表達(dá)減少。Hint1 KO小鼠保護(hù)性細(xì)胞因子白細(xì)胞介素6和白細(xì)胞介素-10水平增加，增加KO小鼠I/R后的存活率，KO小鼠Kupffer細(xì)胞受脂多糖類刺激后活化細(xì)胞數(shù)比對照細(xì)胞少，這一實驗說明Hint1蛋白能夠影響I/R損傷過程，在治療過程中降低Kupffer細(xì)胞中Hint1的表達(dá)可能會發(fā)揮限制損傷程度的作用。

肝纖維化 轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)/Smad是參與肝纖維化的主要信號通路，而Wnt信號通路在肝纖維化的發(fā)展中也發(fā)揮重要作用。因此，Wu等［68］利用人類Hint1重組蛋白對四氯化碳誘發(fā)的大鼠肝纖維化進(jìn)行干預(yù)并探討其機(jī)制:實驗中大鼠被隨機(jī)分為正常對照組、肝纖維化模型組以及重組人類Hint1(50、100 μg/kg)干預(yù)組，4周干預(yù)后，對重組人類Hint1干預(yù)組大鼠的組織病理學(xué)分析表明肝纖維化顯著減少，羥脯氨酸水平較低，其潛在機(jī)制可能與重組人類Hint1抑制肝組織α-平滑肌肌動蛋白表達(dá)，降低TGF-β1/Smad3和β-連環(huán)蛋白/細(xì)胞周期蛋白D1信號通路活性有關(guān);然而，研究也顯示重組人類Hint1能夠激活TGF-β1信號通路Smad7的表達(dá)，可能是一種代償機(jī)制，這一研究結(jié)果表明Hint1或可作為治療肝纖維化的靶點分子。

綜上，HINT1廣泛參與腫瘤、神經(jīng)精神疾病等人類疾病的病理生理過程。其中，探究HINT1酶活性、腫瘤抑制、神經(jīng)病理之間的內(nèi)在聯(lián)系是一個重要的研究方向。

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