，，，

（安徽省動物疫病預(yù)防與控制中心，安徽合肥 236001）

應(yīng)用Kappa檢驗比較豬藍耳病ELISA抗體檢測試劑盒

劉 華，詹松鶴，何長生，朱良強

（安徽省動物疫病預(yù)防與控制中心，安徽合肥 236001）

[目的] 比較兩個豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）抗體酶聯(lián)免疫吸附試驗（ ELISA）檢測試劑盒結(jié)果的一致性。[方法] 對390份豬血清進行PRRSV抗體ELISA檢測，應(yīng)用Kappa檢驗比較兩種試劑盒檢測結(jié)果的一致性并進行分析。[結(jié)果] 兩種試劑盒聯(lián)合檢測出250份PRRSV抗體陽性和70份陰性，陽性一致性為80.65%，陰性一致性為87.50%，符合率82.1%，結(jié)果一致性為中度一致（ Kappa 值=0.552） 。[結(jié)論]2種方法檢測結(jié)果一致性較好，建議根據(jù)實際需要選擇PRRSV抗體檢測試劑盒。

豬繁殖與呼吸綜合征；酶聯(lián)免疫吸附試驗試劑盒；比較；Kappa檢驗

豬藍耳病，是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）引起豬的一種接觸性傳染病。近年來，由于PRRS病毒基因變異，出現(xiàn)高致病性的病毒缺失變異毒株。已證實，它是引起我國南方地區(qū)“高熱病”的主要病原之一。高致病性藍耳病給我國養(yǎng)豬業(yè)造成了很大經(jīng)濟損失。從2009年起，農(nóng)業(yè)部將其納入強制免疫監(jiān)測的動物疫病范疇。PRRSV抗體監(jiān)測的方法較多，其中酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）為國際貿(mào)易中PRRSV抗體檢測指定方法之一，能迅速檢測大量樣品，而且該方法具有敏感、特異、簡便等特點。筆者用國內(nèi)較廣泛使用的兩種進口豬藍耳病病毒抗體ELISA檢測試劑盒，檢測了豬血清，并對兩種試劑盒檢測結(jié)果的一致性進行了分析，結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 豬血清

390份豬血清，為本實驗室保存的春季集中檢測樣品。

1.2 檢測試劑

豬繁殖與呼吸綜合征抗體檢測試劑盒，分別為2個廠家生產(chǎn)，產(chǎn)品A（批號：09418-CE820）；產(chǎn)品B（批號：8D6B）。

1.3 檢測方法

1.3.1 產(chǎn)品A

為N-ELISA，即測定病毒N蛋白。方法如下：血清用樣品稀釋液進行40倍稀釋，濃縮洗液恢復(fù)到室溫后混勻并用去離子水做10倍稀釋。在試劑盒中96孔板的C1、C2、 D1、D 2中加入100μL未稀釋的陰性對照，在A1、B1、A2、B2孔中加入100μL未稀釋的陽性對照，被檢樣品各加兩孔，每孔100μL 。室溫孵育30 min，甩去液體，每孔用洗液300μL清洗3～5 次。每孔加入100μL酶標(biāo)抗體，室溫孵育30min。甩去液體，每孔用洗液300μL清洗3～5次。每孔加入100μL T MB底物溶液，室溫孵育15 min。加入100μL終止液并讀取OD650值。按試劑盒給定計算公式進行判定，S/P值≥0.4判為陽性。

1.3.2 產(chǎn)品B

為G-ELISA，即測定病毒G蛋白。方法如下：濃縮洗液恢復(fù)到室溫后混勻并用去離子水做10倍稀釋。濃縮的樣品稀釋液進行3倍稀釋后，每孔加95μL至樣品稀釋板，加5μL待檢血清，混合后室溫靜置5min。在96孔包被板A1、B1孔內(nèi)加入50μL陰性對照，C1、D1孔中加入50μL陽性對照。將預(yù)稀釋后的被檢樣品加入每孔，再加入45μL1×樣品稀釋液，37±2℃孵育1h，甩去液體，每孔用洗液300μL清洗3 次。每孔加入50μL酶標(biāo)抗體，37±2℃孵育1h。甩去液體，每孔用洗液300μL清洗3次。每孔加入50μL底物溶液，室溫暗室孵育10 min。加入50μL終止液混勻并讀取OD450值。按試劑盒給定計算公式進行判定，IRPC值＞20判為陽性。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 20.0 統(tǒng)計學(xué)軟件對2 種產(chǎn)品檢測的陽性率進行χ2檢驗；結(jié)果一致性進行Kappa 檢驗。Kappa系數(shù)<0，極差；0～ 0.2，微弱；0.21～0.4，弱；0.41～0.6，中度；0.61～0.8，高度；0.81～1.0，極強[1]。

2 結(jié)果與分析

產(chǎn)品A和B同時檢測390份血清樣本的結(jié)果比較見表1。

兩種試劑盒聯(lián)合檢出250份陽性，陽性率64.10%。產(chǎn)品A單獨檢出260份陽性，陽性率66.67%。產(chǎn)品B單獨檢出310份陽性，陽性率79.49%，略高于產(chǎn)品A（χ2=16.29，p<0.01）。兩個產(chǎn)品的陽性結(jié)果一致性為80.6%；陰性結(jié)果一致性為87.5%；總體樣本結(jié)果的一致性為82.1%。根據(jù)Kappa一致性檢驗，Kappa值為0.553（95%置信區(qū)間：0.459-0.647），表明兩種產(chǎn)品的一致性為中度一致。

3 討論

3.1 Kappa一致性檢驗的應(yīng)用

在檢驗醫(yī)學(xué)研究工作中，常遇到評估兩種檢測方法、兩名檢驗人員或兩種設(shè)備檢測結(jié)果的符合程度及用同一種方法進行多次測定的結(jié)果能否重現(xiàn)的問題[2]。國際上，主要依據(jù)美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會（CLSI）EP12-2A文件公布的2種定性檢測方法的一致性比較[3-4]。國內(nèi)對獸用診斷制品的技術(shù)指標(biāo)進行實驗室檢測主要參考農(nóng)業(yè)部第 683 號公告有關(guān)規(guī)定進行，常采用對標(biāo)準(zhǔn)陽性血清和標(biāo)準(zhǔn)陰性血清進行檢測，評價試劑盒的敏感性、特異性和符合率。其計算公式如下：敏感性= （與標(biāo)準(zhǔn)陽性血清檢測結(jié)果一致的血清份數(shù)/標(biāo)準(zhǔn)陽性血清總份數(shù)） ×100%；特異性 = （與標(biāo)準(zhǔn)陰性血清檢測結(jié)果一致的血清份數(shù)/標(biāo)準(zhǔn)陰性血清總份數(shù)）×100%；符合率 = （與標(biāo)準(zhǔn)血清檢測結(jié)果一致的血清份數(shù)/標(biāo)準(zhǔn)血清總份數(shù)） ×100%[5]。筆者認為，獸醫(yī)診斷試劑對Kappa一致性檢驗的應(yīng)用，應(yīng)加以重視和借鑒。

3.2 試劑盒選擇

Kappa值主要體現(xiàn)兩種不同試劑或方法檢測結(jié)果的一致性，但不能判定哪個試劑盒或方法較好。Kappa值越大，兩者一致性越高，則表明結(jié)果可靠程度越高[1]?？勺鳛闄z測試劑或方法檢測結(jié)果的可靠程度的參考。判定試劑盒的主要指標(biāo)主要以對標(biāo)準(zhǔn)陽性血清和標(biāo)準(zhǔn)陰性血清進行檢測，判定其敏感性和特異性。由于目前國內(nèi)缺乏豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗體檢測的金標(biāo)準(zhǔn)，常無法做出判斷。從本次試驗的結(jié)果看，兩種試劑盒的檢測結(jié)果差異有統(tǒng)計學(xué)意義，結(jié)果中度一致，這與吳雪軍等報道的基本一致[6]。因此，建議根據(jù)實際情況選擇不同的試劑盒。

[1]Landis JR，Koch GG.The measurement of observer agreement for Gategorical data[J].Biometrics，1977，33：159-174.

[2]張波. Kappa一致性檢驗在流行病學(xué)中的應(yīng)用舉例[J].寧夏醫(yī)學(xué)院學(xué)報，1995，17（4）：336-337.

[3]夏邦世，吳金華. Kappa一致性檢驗在檢驗醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用[J]. 中華檢驗醫(yī)學(xué)雜志，2006，29（1）：83-84.

[4]宋斌斌，趙瀛，張春燕，等.兩種抗中性粒細胞胞漿抗體檢測方法的結(jié)果比較[J]. 檢驗醫(yī)學(xué)，2011，26（7）：457-460.

[5]吳華偉，高金源，鄧永，等. 國內(nèi)5種豬圓環(huán)病毒PCV2抗體檢測試劑盒的比較試驗[J]. 中國獸藥雜志，2011，45（6）：11-12，15.

[6]吳雪軍，周彩琴，趙靈燕，等. 檢測豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒抗體的兩種ELISA方法的比較及其應(yīng)用[J].中國獸醫(yī)雜志，2012，48（4）：27-29.

Application of Kappa Test for Evaluation of PRRSV Antibody ELISA Kits

Liu Hua，Zhan Songhe，He Changsheng，Zhu Liangqiang

（Anhui Center for Animal Disease Prevention and Control，Hefei，Anhui 230061 ）

Objective To compare the consistency between the results of the PRRSV antibody ELISA Kits produced by 2 frms. Method 390 swine serum samples were tested by the PRRSV antibody ELISA kits produced by two different frms. The consistency between the results of the 2 different kits was compared by means of Kappa test. Results 250 positive and 70 negative were tested by the 2 kits together．The positive consistency rate was 80.65%，and the negative consistency rate was 87.50%，and the coincidence rate was 82.1%. The consistency was moderate （Kappa=0.552）. Conclusion：The results showed a good consistency between the 2 kits，both could be used for PRRSV antibody detection，and it just depends on the actual needs.

porcine reproductive and respiratory syndrome；ELISA kit；comparison；Kappa test

S858.28

：B

：1005-944X（2014）11-0095-03

朱良強