文永兵 郭艷幸 張玉可

1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)，安徽 合肥 23003;2.洛陽(yáng)正骨醫(yī)院，河南 洛陽(yáng) 471000;3.河南中醫(yī)學(xué)院，河南 鄭州 450000

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎 (Rheumatoid arthritis，RA)是一種以關(guān)節(jié)滑膜為主要靶組織的慢性系統(tǒng)性炎癥性自身免疫功能障礙性疾病，主要表現(xiàn)為對(duì)稱性、慢性、進(jìn)行性多關(guān)節(jié)炎，基本病理特征為關(guān)節(jié)滑膜炎。關(guān)節(jié)滑膜炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，滑膜細(xì)胞增殖，血管翳形成并侵襲關(guān)節(jié)軟骨和骨組織，造成關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)的破壞［1］。其確切病因及發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，目前尚無有效的治療方法。近年來研究表明，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎成纖維樣滑膜細(xì)胞 (fibroblast-like synovio—cytes，F(xiàn)LS)增生活躍，具有轉(zhuǎn)化細(xì)胞的特征，能夠形成腫瘤樣病灶，可能是類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎疾病發(fā)生的早期特征［2］。制備兔類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎模型，為研究RA的發(fā)病機(jī)制提供了一個(gè)良好的平臺(tái);體外培養(yǎng)FLS為臨床藥物的開發(fā)與評(píng)估提供了一個(gè)理想的實(shí)驗(yàn)條件，對(duì)進(jìn)一步揭示RA的發(fā)病機(jī)制及開發(fā)防治RA的藥物具有深遠(yuǎn)的意義。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康大耳白兔8只，普通級(jí)，體重:1.5～2.0 kg，5月齡，雌雄各半，由河南康達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，檢疫合格。所有動(dòng)物均在同等條件下喂養(yǎng)，自由飲水進(jìn)食，普通飼料定時(shí)定量喂養(yǎng);選擇光線充足，通風(fēng)良好實(shí)驗(yàn)環(huán)境，實(shí)驗(yàn)前先適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑 雞卵蛋白粉 (Albumin Egg)，sigma A-5253;二甲基亞砜 (DMSO)，sigma;完全弗氏佐劑，美國(guó)Sigma公司，批號(hào):F5881;DMEM/LOW GLUCOSE，批號(hào):NXJ0702，HyClone;無支原體胎牛血清，批號(hào):120716，浙江天抗生物科技有限公司;0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液，批 號(hào):90090602，Solarbio;PBS緩 沖 液，批 號(hào):NYJ0985，HyClone;D-PBS緩沖液，批號(hào):20120928，biohao;

1.2 設(shè)備及儀器 電子天平，XS205型，METTLER TOLEDO公司;-20℃冰箱，BCD-248WBCSLA，青島海爾股份有限公司;-80℃超低溫冰箱，3111型，Thermo;液氮罐，YDS-50B-125型，樂山市東亞機(jī)電工貿(mào)有限公司;水套式二氧化碳培養(yǎng)箱，F(xiàn)orma 3111型，Thermo;倒置顯微鏡，TS100/TS100-F，Nikon;電熱恒溫水浴鍋，DKS22型，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;立式自動(dòng)電熱壓力蒸汽滅菌器，LX-C35L型，合肥華泰醫(yī)療設(shè)備有限公司;漩渦混合器，QL-861，QILINBEI離心機(jī)，LDZ5-2，北京離心機(jī)廠;自動(dòng)包埋機(jī)，EC350型，MICROM公司;石蠟切片機(jī)，HM360型，MICROM公司

2 方法

2.1 動(dòng)物分組 健康大耳白兔8只，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分成兩組，正常組4只，模型組4只，每組雌雄各半。

2.2 造模與檢測(cè) 模型組將采用1962年由 Dumonde和Glynn創(chuàng)立的卵蛋白誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎模型進(jìn)行造模，發(fā)病率達(dá)100% ，近期的實(shí)驗(yàn)研究［3］證實(shí)了模型復(fù)制的成功率。

2.2.1 試劑的配制及致敏 用電子天平量取雞卵蛋白粉100 mg，放入離心管，注入5 ml生理鹽水，在漩渦混合器上充分振蕩溶解，配制成濃度為20 mg·ml-1的懸液，用10 ml注射器吸取懸液，通過針頭過濾器過濾到另一無菌離心管中，在離心管中加入完全弗氏佐劑5 ml，在漩渦混合器上震蕩5 min左右至混合液完全乳化，用理發(fā)器除去家兔肩胛間區(qū)兔毛，暴露皮膚，酒精消毒;用1 ml注射器抽取上述乳化液l ml，在兔肩胛間區(qū)分5個(gè)部位皮下注射致敏，每只l ml，間隔一周注射一次，連續(xù)3周致敏，注射后，注射部位皮下將產(chǎn)生1 cm×1 cm×1 cm大小的略圓形皮下硬結(jié)，至處死時(shí)仍未消散。

2.2.2 致敏檢測(cè) 第3周致敏后1周，取上述白蛋白溶液0.1 ml在兔后臀皮下注射，24～48小時(shí)內(nèi)皮試呈陽(yáng)性反應(yīng)(產(chǎn)生至少16 mm的皮膚紅色隆起)為致敏成功。

2.2.3 模型的誘發(fā) 末次注射后一周，即第4周，致敏檢測(cè)成功后，將兔固定于手術(shù)臺(tái)上，雙膝關(guān)節(jié)部位用理發(fā)器剃毛，常規(guī)酒精消毒，注射部位選擇在脛骨結(jié)節(jié)最高點(diǎn)與髕骨下緣連線之中點(diǎn)的髕韌帶外側(cè)。注射時(shí)膝關(guān)節(jié)屈曲約20°由髕韌帶外側(cè)中點(diǎn)與皮膚呈45°角進(jìn)針深度約1 cm，穿破關(guān)節(jié)囊時(shí)有突破感，選用1 ml注射器在模型兔雙膝各注射0.5 ml白蛋白溶液 (含雞卵蛋白5 mg)，注射后將兔放回原籠。

2.3 細(xì)胞培養(yǎng)前的準(zhǔn)備 二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)部用75%酒精噴灑，紗布擦拭干凈，紫外線燈照射30 min，內(nèi)部水盤高溫高壓滅菌后放回，打開二氧化碳培養(yǎng)箱開關(guān)，向培養(yǎng)箱內(nèi)水盤注入2000 ml蒸餾水，將二氧化碳濃度調(diào)整為0，設(shè)置溫度為37℃，穩(wěn)定一天，校準(zhǔn)二氧化碳濃度后調(diào)整為5%，打開二氧化碳閥門，培養(yǎng)箱參數(shù)穩(wěn)定在溫度37℃，二氧化碳濃度5%即可，將解剖器械在

2.4 取滑膜組織進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)、傳代、凍存及復(fù)蘇

2.4.1 取滑膜組織 模型誘發(fā)后第2周，模型組兔雙膝關(guān)節(jié)腫脹明顯。從模型組中任選兩只大耳白兔，麻醉后，仰位固定，無菌環(huán)境下于膝關(guān)節(jié)正中縱行切開皮膚，分離肌肉，露出膝蓋骨，沿脛骨結(jié)節(jié)切斷髕韌帶，向上翻起，打開關(guān)節(jié)腔，用眼科剪及眼科鑷取關(guān)節(jié)囊內(nèi)面平滑光亮的滑膜組織，同法取另一側(cè)膝關(guān)節(jié)滑膜層組織，放置于無菌培養(yǎng)皿中。取滑膜組織過程中，見模型組滑膜組織大量增生變厚，打開關(guān)節(jié)腔見大量滑液流出。

2.4.2 滑膜細(xì)胞原代組織塊培養(yǎng) 在超凈臺(tái)中，用PBS液沖洗取出的滑膜組織3次，然后剪成1～2 mm3小塊，PBS液洗滌離心2次，吸取上清液，將組織小塊用眼科鑷送入25 cm2培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，用牙科探針將組織塊在瓶壁上均勻擺置，每小塊間距5mm左右，放置15～20塊，組織放好后，向瓶?jī)?nèi)注入1ml培養(yǎng)液 (含15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基)，勿將組織塊漂浮，蓋好瓶蓋，放置在5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，旋開瓶口少許，培養(yǎng)12 h，待組織塊貼附后，再補(bǔ)加1ml培養(yǎng)液，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天觀察組織塊的貼附及周圍細(xì)胞生長(zhǎng)情況，視培養(yǎng)液顏色變化2～3天更換培養(yǎng)液。

2.4.3 滑膜細(xì)胞傳代 原代細(xì)胞組織塊周圍出現(xiàn)大量成纖維細(xì)胞并占滿瓶底面積約70%時(shí)，將原代細(xì)胞傳代，一、二代細(xì)胞占滿瓶底面積約80%～90%，進(jìn)行細(xì)胞傳代。傳代前，將已經(jīng)配制好含15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基、D-PBS液和0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液放入37℃水浴鍋內(nèi)預(yù)熱約15分鐘，用75%酒精擦拭超凈工作臺(tái)，將無菌空培養(yǎng)瓶、一次性吸管及廢液缸放在工作臺(tái)，然后打開紫外線燈照射30分鐘，在超凈臺(tái)中合理擺放預(yù)熱后并用75%酒精紗布擦拭好的液體，從培養(yǎng)箱內(nèi)取出25cm2培養(yǎng)瓶，將各瓶口一一打開，同時(shí)要在酒精燈上燒口消毒，小心吸出舊培養(yǎng)液，用 D-PBS清洗1次，加入1.5 ml消化液，消化溫度37℃，消化時(shí)間大約3分鐘，倒置顯微鏡下觀察消化細(xì)胞，胞質(zhì)回縮，細(xì)胞之間不再連接成片，表明此時(shí)細(xì)胞消化適度，此時(shí)加入3倍消化液量的完全培養(yǎng)液中和胰酶，吸管反復(fù)吹打細(xì)胞成細(xì)胞懸液，移入15ml離心管中，平衡后將離心管放入離心機(jī)中，以1000r·min-1離心5 min，除去消化液中的EDTA，吸管小心吸去上清液，加入2ml完全培養(yǎng)液，用滴管輕輕吹打細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)后，以3×105·ml-1的細(xì)胞密度分裝在2～3個(gè)25cm2培養(yǎng)瓶中 (原代細(xì)胞較少，繼續(xù)在1個(gè)瓶中培養(yǎng))，放置在二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.4.4 滑膜細(xì)胞凍存 滑膜細(xì)胞傳至第3～4代時(shí)，細(xì)胞數(shù)量增多，選生長(zhǎng)狀態(tài)好 (占滿瓶底90～95%)，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，對(duì)生長(zhǎng)數(shù)量大于5×105·ml-1進(jìn)行凍存，以供后期實(shí)驗(yàn)利用。將所有需凍存細(xì)胞前一天換液一次，預(yù)先配制好凍存液 (含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液:DMSO=9∶1)，依據(jù)傳代方法把消化好的細(xì)胞收集于離心管中，離心機(jī)低速離心5 min，小心棄上清液，將細(xì)胞凍存液加入細(xì)胞離心管中，重懸細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)調(diào)整至1×106·ml-1～1×107·ml-1，用吸管輕輕吹打使細(xì)胞均勻，將懸浮細(xì)胞放置細(xì)胞凍存管中，每管1 ml，密封細(xì)胞凍存管，標(biāo)明細(xì)胞種類和凍存日期，按下列順序降溫保存細(xì)胞:室溫→4℃ (20 min)→ 冰箱冷凍室 (30 min)→ 超低溫冰箱(-80℃過夜)→ 液氮，少量細(xì)胞僅保存在超低溫冰箱存放。

2.4.5 滑膜細(xì)胞復(fù)蘇 從液氮容器中或從超低溫冰箱中取出原代細(xì)胞凍存管后，立即將細(xì)胞凍存管直接浸入37℃水浴中，在2 min內(nèi)搖動(dòng)細(xì)胞凍存管至凍存的細(xì)胞融化，用酒精消毒后，擰開凍存管，用吸管吸出細(xì)胞懸液，注入離心管并滴加10倍以上培養(yǎng)液，混合后低速離心5 min，除去上清液，用培養(yǎng)液適當(dāng)稀釋后，接種密度約5×105·ml-1接種至25cm2培養(yǎng)瓶，放在二氧化碳培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，次日更換一次培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。

2.5 取正常組及模型組兔膝關(guān)節(jié)病理檢測(cè) 模型誘發(fā)后第2周和第6周分別取正常組和模型組各一只白兔雙膝關(guān)節(jié)，用于病理切片觀察，操作步驟如下:耳緣靜脈栓塞法處死白兔，仰臥固定，膝關(guān)節(jié)剃毛后作縱切口，橫斷脛骨結(jié)節(jié)下約1 cm髕骨上約1 cm肌肉，暴露脛骨及股骨，鋸條橫斷脛骨、股骨，取出完整雙膝關(guān)節(jié)，裝入標(biāo)本袋，分別注明日期及組別，用10%福爾馬林液固定48 h，將標(biāo)本放入10%甲酸溶液，脫鈣2周，送檢驗(yàn)科包埋、切片。

3 討論

RA的病理基礎(chǔ)是滑膜細(xì)胞的大量增生，而滑膜是關(guān)節(jié)的重要組成部分，有潤(rùn)滑關(guān)節(jié)，維持關(guān)節(jié)穩(wěn)定的作用，滑膜出現(xiàn)病變，勢(shì)必造成關(guān)節(jié)的病變。近年的研究證明RA的主要病因在于滑膜的病變，滑膜和炎性細(xì)胞形成血管翳，從而產(chǎn)生腫瘤樣的侵蝕作用，對(duì)關(guān)節(jié)軟骨造成破壞［4］。由卵蛋白誘導(dǎo)的白兔類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎在發(fā)病機(jī)制，病理改變方面更接近人類RA，較好地模擬了免疫性疾病的微環(huán)境［5］。膝關(guān)節(jié)是全身關(guān)節(jié)中滑膜最多的關(guān)節(jié)，易于進(jìn)行藥品注射及細(xì)胞移植治療，且它與人的手足小關(guān)節(jié)大小相近，對(duì)指導(dǎo)RA好發(fā)部位的治療很有意義［6］，因此采用此法對(duì)動(dòng)物造模并取雙膝關(guān)節(jié)滑膜組織體外培養(yǎng)并儲(chǔ)備，對(duì)后期的藥物實(shí)驗(yàn)研究提供很好的研究材料。筆者在對(duì)白兔造模中發(fā)現(xiàn)，在前3周致敏后，注射部位皮下有大小不等的硬結(jié)，長(zhǎng)期不消退，第四周臀部注射進(jìn)行致敏檢測(cè)，48 h后出現(xiàn)局部強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)，局部紅腫，一周內(nèi)檢測(cè)部位出現(xiàn)潰爛，說明致敏是成功的。造模過程中，觀察造模前后飲食、膝關(guān)節(jié)周徑及兔體重變化，造模成功后第2周，取兔膝關(guān)節(jié)滑膜的操作中，見模型組滑膜組織增生肥厚明顯，關(guān)節(jié)腔內(nèi)大量滑液流出，均與文獻(xiàn)上記載的相符［7］。

研究發(fā)現(xiàn)，卵蛋白誘導(dǎo)的兔RA模型，在關(guān)節(jié)腔誘導(dǎo)后第1～4周為膝關(guān)節(jié)滑膜增生的高峰期，4周后出現(xiàn)不可逆的軟骨破壞［8］。筆者在模型誘發(fā)后第2周取模型組兔膝關(guān)節(jié)滑膜組織進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，第2周和第6周各取一只正常組和模型組兔雙膝關(guān)節(jié)進(jìn)行病理檢測(cè)。在孫貴才等人實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)組織塊培養(yǎng)法是獲取優(yōu)質(zhì)滑膜細(xì)胞的最佳方法［9］。筆者在用組織塊培養(yǎng)法對(duì)兔膝關(guān)節(jié)滑膜組織培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)，從滑膜組織植入培養(yǎng)瓶算起，第3天發(fā)現(xiàn)組織塊周圍有少量細(xì)胞游離出，約一周后組織塊周圍有大量成纖維樣細(xì)胞游離出組織塊，少量為非纖維樣，第10天對(duì)原代滑膜細(xì)胞傳代，傳代后約經(jīng)過3～4天傳第二代，繼續(xù)培養(yǎng)，傳至第三代滑膜細(xì)胞形態(tài)單一，呈梭形，占滿瓶底80%～90%時(shí)，呈漩渦狀分布。第三代細(xì)胞形態(tài)單一，活性強(qiáng)，數(shù)量大，將細(xì)胞凍存后備用。1月后，將凍存在液氮和-80°冰箱中的滑膜細(xì)胞同時(shí)以相同的密度接種在25cm2培養(yǎng)瓶中，第二天，觀察細(xì)胞的貼壁情況，兩者差異不大，凍存在液氮里的滑膜細(xì)胞復(fù)蘇后3天長(zhǎng)滿瓶底，在-80°冰箱中的滑膜細(xì)胞復(fù)蘇后4天長(zhǎng)滿瓶底，所以，后期實(shí)驗(yàn)周期短的實(shí)驗(yàn)，滑膜細(xì)胞可以直接放置在-80°冰箱中暫時(shí)保存。

關(guān)節(jié)腔誘導(dǎo)模型成功后第2周取正常組兔及模型組兔雙膝關(guān)節(jié)病理檢測(cè)結(jié)果示:模型組兔雙膝關(guān)節(jié)滑膜組織明顯增生，正常組兔未見滑膜組織增生;第6周取正常組兔及模型組兔雙膝關(guān)節(jié)病理檢測(cè)結(jié)果示:模型組兔雙膝關(guān)節(jié)滑膜組織明顯增生，并有血管翳形成和不同程度的軟骨及骨破壞，正常組兔未見異常，模型組RA的誘導(dǎo)是成功的。

總之，卵蛋白誘導(dǎo)的兔RA模型方法簡(jiǎn)便，成功率高，為臨床研究RA的發(fā)病機(jī)制及治療手段提供了一個(gè)良好的實(shí)驗(yàn)平臺(tái)，通過對(duì)模型組兔膝關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞培養(yǎng)條件的摸索，可以成功培養(yǎng)出實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞，并成功凍存與復(fù)蘇，是后期體外實(shí)驗(yàn)深入研究RA的前提與基礎(chǔ)。

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