張 利 吳慧麗 姚俊芳 李琨琨 肖興國

河南省鄭州大學附屬鄭州中心醫(yī)院消化一科，河南鄭州 450007

大腸癌在我國發(fā)病率位居居第3位，其大多具有明確的癌前病變期(如大腸腺瘤樣息肉)，且早期無癥狀或癥狀不典型，就診的臨床病例多為中晚期，而且其治療效果和預后均不理想[1]，是全國重點防治的8種癌癥之一，進行早期診斷和綜合防治[2]是關鍵。國內(nèi)有類似相關研究，均是對中晚期結腸癌等相關血液指標研究，結腸早癌的相關研究少[3]。

該研究通過對我院350例結腸息肉樣病變患者，電子結腸鏡下行粘膜切除（EMR）或剝離（ESD）后病理學檢查證實結腸早癌120例，與單純結腸腺息肉病組230例，正常結腸鏡結腸粘膜200例，檢測血液中促炎因子、抑炎因子、抑癌基因水平，進行比較分析，為結腸早癌篩查及診斷提供臨床指導，同時對結腸腺瘤向結腸早癌的發(fā)生機制進行初步分析、探討。

1 入選標準、材料與方法

1.1 入選標準及分組

入選標準：選取2010年2月—2014年2月鄭州大學附屬鄭州中心醫(yī)院通過腸鏡檢測為結腸息肉樣病變，大小均以大于或等于1.0 cm，排除結腸淋巴瘤后350例；分組：對照組：為200例查結腸鏡結腸粘膜正常患者，男性126例，女性74例，平均年齡（50±6.5）歲；實驗①組：電子結腸鏡下行息肉切除（EMR）或剝離（ESD）后病理學檢查證實230例單純結腸腺息肉患者,其中男性123例，女性107例，平均年齡（55±5.5）歲；實驗②組：電子結腸鏡下行息肉切除（EMR）或剝離（ESD）后病理學檢查證實結腸早癌120例患者，其中男性68例，女性52例，平均年齡（57±5.5）歲。

1.2 材料

電子結腸鏡(Olympus),細胞裂解液，Rb PTEN、PHLPP兔抗人一抗,羊抗兔二抗,5×上樣baffer,Ecl試劑盒 （以上試劑盒及抗體購自上?？婆d公司），電泳及電轉槽等western儀器設備（鄭州大學基礎實驗室）。

1.3 方法

1.3.1 內(nèi)鏡治療過程 結腸鏡下EMR或ESD操作見圖1。

圖1 一例直腸息肉內(nèi)鏡下粘膜剝離術：①術前鏡下觀；②NBI染色后；③完整粘膜剝離后；④剝離組織塊。

1.3.2 檢測指標 三組患者，均檢測血清促炎因子 TNF-a、IL-6、COX2水平,抑炎因子IL-10水平，檢測組織APC、PTEN、PHLPP蛋白表達量。

1.3.3 蛋白印跡試驗 將收集各樣品在低溫下提取總蛋白,取上清液，制作標準曲線，測定上清液蛋白濃度，樣品均以50ng總蛋白計算上樣液體量,進行12.5%PAGE凝膠泳,行電泳、電轉,使蛋白轉膜,將NC膜用封閉液封閉,再加入一抗低溫4℃過夜，加入二抗室溫孵育,將NC膜置于ECL(增強化學發(fā)光試劑)中反應1～3 min,暗室中使X線片曝光,常規(guī)方法顯影定影,X線片上的條帶用凝膠圖象處理系統(tǒng)分析目標帶的分子量和凈光密度值，以：APC、PTEN、PHLPP/β-actin的比值表示。

1.4 統(tǒng)計學處理

以mean±SD數(shù)據(jù)處理并用SPSS 13.0分析,兩個獨立樣本資料采用有序多分類資料秩和檢驗（Wilcoxon），計量資料組與組之間比較用t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 血清炎癥因子結果分析顯示

（1）實驗①組與對照組IL-6、Cox2，抑炎因子IL-10水平血清濃度比較，無統(tǒng)計學差異，P＞0.05。（2）實驗②血清 IL-6、Cox2濃度較實驗組①高，分別為（22.45±4.65）、（31.20±3.46）升高至（45.46±5.69）、（56.46±6.68），而明顯高于對照組（18.21±3.68）,（24.16±4.02）；血清抑炎因子IL-10則明顯下降，由實驗①組（33.46±3.89）下降至（16.56±2.68），較對照組（38.46±4.69）下降明顯,實驗②組血清IL-6、Cox2、IL-10 與對照組、實驗①組比較，P=0.0035、P=0.0040、P=0.0340；P=0.0045、P=0.0328、P=0.0409。3）血清 TNF-a 各實驗組與對照組均為差異，以及實驗組之間比較無差異 (表1)。

表1 實驗組與對照組血清TNF-a、IL-6、Cox2水平和抑炎因子IL-10的變化

2.2 Western-blot檢測抑癌因子水平表達

其中實驗①組組織APC、PTEN、PHLPP蛋白表達水平與對照組比較，均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），實驗②與對照組比較，均有統(tǒng)計學意義，其中PHLPP有顯著意義（P＜0.01）；實驗②組與實驗①組比較，均有統(tǒng)計學差異，且PHLPP存在顯著差異（P＜0.01）。（見表2）。

表2 Western-blot檢測APC、PTEN和PHLPP蛋白的表達

3 討論

我國大腸癌發(fā)病率逐年增高[4-5]，近30年我國大腸癌發(fā)病率總體增加了36.7%。而美國等西方國家，大腸癌發(fā)病率和死亡率逐步下降，原因是在預防方面如及時去除癌前病變及結腸早癌，并且建立了循證篩查、并推廣。大腸腫瘤篩查被列為國家“十一五”疾病防治工作重點課題[6]?，F(xiàn)已證實，85%結腸癌均由結腸息肉發(fā)展、惡變而形成，在這一演進過程中，患者血清炎癥因子或組織抑癌基因濃度有無變化，尚無類似研究。本研究通過對比分析正常人、結腸腺息肉患者及結腸早癌患者血清炎癥因子檢測水平及組織中抑癌基因表達水平，得出炎癥因子在結腸腺息肉向結腸早癌的發(fā)生、發(fā)展的作用，初步探討及作用機制，并分析提示結腸早癌敏感抑癌基因，為臨床結腸早癌刷查血清敏感性指標提供幫助，并為結腸癌治療效果評估指標，這是本研究重點及臨床意義。

Paiotti AP等[7]證實,COX2在腸道炎癥反應發(fā)生中，起重要作用,活動性潰瘍性結腸炎患者表達明顯增強,表達越強，其腸道炎癥也越嚴重。本實驗證實，在結腸早癌組促炎因子IL-6、Cox2表達水平明顯高于正常結腸組、結腸腺瘤組血清，P<0.05，而結腸腺瘤組與正常結腸組血清分析比較無差異。而抑癌因子IL-10則在結腸早癌組血清檢測最低，說明促炎因子IL-6、Cox2及抑炎因子IL-10在結腸腺息肉向結腸癌演變發(fā)展中可能起到一定作用，不排除參與結腸腺瘤向早癌的演進。這與臨床理論相符，即結腸或息肉粘膜反復炎癥就容易癌變，但機制需進一步研究。而TNF-α存在2個結構不同的受體，傳導不同的傳導信號:1型和2型受體(TNFR1、TNFR2)，前者導致細胞凋亡，后者是一種促炎因子,在本實驗中，TNF-α在正常結腸粘膜組、結腸腺瘤組及結腸早癌組血清表達水平均無明顯差異，說明TNF-α信號通路存在一種負反饋平衡,一方面，TNF-α作為促炎炎癥，可引起結腸腺瘤的發(fā)生、演進；另一方面，增強TNF-α誘導不典型增生細胞凋亡[8]。

腸道抑癌基因據(jù)報道有：APC、PTEN、PHLPP,這些基因減少及失活被認為是腫瘤發(fā)展的分子水平基礎，但那個基因在組織檢測水平差異最大，或是哪個基因敏感性最高尚無相關研究。本實驗檢測到,在結腸早癌組織中，以上三種抑癌基因均表達減少，這與理論一致，以上基因低表達與Akt/mTOR通道調(diào)控有關[8]：①在85%結腸癌中APC基因缺失或失活，并且該基因的缺陷與結腸癌的遺傳易感性直接相關，在散發(fā)性大腸癌的發(fā)生中APC基因突變也起著重要作用[9]。APC蛋白失表達可能與大腸癌的發(fā)生及演進密切相關。②PTEN調(diào)控Akt/mTOR通路去磷酸化調(diào)控VEGF發(fā)揮腫瘤抑制功能[10]，通過磷酸化而失活。③PHLPP參與調(diào)控Akt/mTOR通路中Akt的磷酸化及去磷酸化，也是腫瘤生長調(diào)節(jié)分子位點。總體來說，抑癌基因APC、PTEN、PHLPP在結腸早癌組織較正常結腸組織及結腸腺瘤組織中表達減低，統(tǒng)計分析存在差異，P<0.035、P<0.042。而PHLPP表達水平有顯著差異P<0.007，提示PHLPP是結腸早癌組織表達水平在三者中為最敏感指標。為早期結腸癌篩查提供幫助，同時可通過檢測以上基因水平評估結腸癌藥物治療療效性。

本實驗能夠得到，促炎因子IL-6、Cox2與抑炎因子IL-10，在不同等級結腸粘膜病變血清檢測值不同，分析可能共同參與結腸腺息肉向結腸早癌的發(fā)生及演進，并能通過對病人血清炎癥因子檢測提供預警信號；同時結腸組織中抑癌基因APC、PTEN、PHLPP表達水平，在結腸早癌組織中表達顯著減少，PHLPP表達更為敏感，為早期結腸癌篩查提供幫助，同時可通過檢測以上基因水平評估結腸癌藥物治療療效性。分析機制可能因Akt/mTOR通道調(diào)控調(diào)控以上抑癌基因，磷酸化失活失去對腫瘤發(fā)生及演進的抑制作用有關。本研究為臨床結腸早癌篩查工作及結腸癌發(fā)生的分子基礎提出了創(chuàng)新思維，并為大腸癌的防治作出指導性意義，同時下一步我們通過應用Akt/mTOR通道抑制劑雷帕霉素前后檢測炎癥因子及抑癌基因表達水平，評估雷帕霉素在防治結腸癌臨床療效性。

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