劉小章岳煥勛

1. 成都中醫(yī)藥大學(xué)四川省計(jì)劃生育科研所（成都 610041）; 2. 四川大學(xué)第二醫(yī)院

·講 座·

年齡對(duì)男性生殖功能的影響

劉小章1岳煥勛2

1. 成都中醫(yī)藥大學(xué)四川省計(jì)劃生育科研所（成都 610041）; 2. 四川大學(xué)第二醫(yī)院

為追求高學(xué)歷和職業(yè)發(fā)展，女性推遲生育已成為一種趨勢(shì)。此外，隨婚姻類型的變化，再婚后希望生育的現(xiàn)象也越來越普遍，選擇在中年后生育的男子也越來越多。據(jù)統(tǒng)計(jì)，美國(guó)2009年每1 000例活產(chǎn)兒父親年齡在45～49歲的比例從1980年的6.1升至2007年的8.2，上升34%[1]。英國(guó)1993年25%出生兒父親年齡在35～54歲，10年后該比例上升至40%[2]。許多中國(guó)男子也在推遲生育年齡，尤其在大城市更為明顯[3]。這一趨勢(shì)的公共衛(wèi)生意義尚未引起廣泛關(guān)注。夫婦年齡增加，生育問題的風(fēng)險(xiǎn)也隨之增高。女性生育力在35歲以后明顯下降，同時(shí)流產(chǎn)、妊娠并發(fā)癥、以及后代染色體缺陷的風(fēng)險(xiǎn)也隨之增高[4,5]。與女性不同，男性雄激素合成及精子發(fā)生可維持至生命晚期，男方高齡是否也可能存在生育力受損和生育風(fēng)險(xiǎn)增高等問題引發(fā)了人們的關(guān)注。

對(duì)高齡父親年齡的界定尚不明確，通常引用的標(biāo)準(zhǔn)是受孕時(shí)男方年齡≥40歲[6]。年齡對(duì)男子生育功能的影響不僅涉及分子、細(xì)胞及內(nèi)分泌網(wǎng)絡(luò)調(diào)控多方面改變，同時(shí)個(gè)體差異顯著，并受生活方式及環(huán)境因素的影響。本文簡(jiǎn)要綜述與男性年齡相關(guān)的睪丸功能、精液參數(shù)改變、對(duì)生育及生育結(jié)局的影響、遺傳疾病風(fēng)險(xiǎn)及其可能的生物學(xué)機(jī)制的研究進(jìn)展。

增齡對(duì)男性生殖系統(tǒng)的負(fù)面影響是漸進(jìn)性的。睪丸容積長(zhǎng)期保持恒定，與年齡特異相關(guān)的睪丸容積下降僅見于80歲后男子，平均雙側(cè)睪丸容積（BTV）比18～40歲男子降低31%[7]。睪丸組織學(xué)的退行性改變個(gè)體差異極大。老化睪丸的形態(tài)學(xué)特征包括暗A(chǔ)型精原細(xì)胞數(shù)量減少，多核精原細(xì)胞、巨精母細(xì)胞和巨大精子細(xì)胞發(fā)生增加，以及精原細(xì)胞多層化和生精小管憩室形成。支持細(xì)胞數(shù)量減少，胞質(zhì)內(nèi)脂滴聚積及空泡化。間質(zhì)細(xì)胞亦見多核化，細(xì)胞內(nèi)脂褐質(zhì)蓄積增加，數(shù)量減少。在一項(xiàng)多變量分析，F(xiàn)SH、抑制素B和生物可利用睪酮（T）與老年男子BTV獨(dú)立相關(guān)。BTV中度下降與抑制素B/FSH比值降低顯著相關(guān)，與支持細(xì)胞數(shù)量減少相一致。由于FSH水平代償性增高支持細(xì)胞功能僅出現(xiàn)有限下降[8]。生精小管進(jìn)行性退化，生精上皮減少。由于初級(jí)精母細(xì)胞凋亡加速，老齡化睪丸中每個(gè)支持細(xì)胞上初級(jí)精母細(xì)胞數(shù)量減少，致精子發(fā)生效能降低。此外，支持細(xì)胞和生殖細(xì)胞間通信干擾也有報(bào)道。所有這些因素均造成了老齡睪丸精子發(fā)生障礙[9-12]。

無論在人或動(dòng)物，血清睪酮（T）水平隨年齡增加而下降[13]。T水平的下降導(dǎo)致多種生理功能下降，包括骨密度、瘦體量、體能、肌肉強(qiáng)度下降；心理、認(rèn)知能力、情緒變化以及頻發(fā)的勃起功能障礙。相當(dāng)比例60歲以上男子的血清T水平低于年輕男子（20～30歲）的下限[14]。增齡造成循環(huán)總睪酮（TT）和生物可利用T以相對(duì)恒定的速率下降。由于血清性激素結(jié)合球蛋白（SHBG）隨年齡而增高，游離T指數(shù)（T/SHBG）下降比總T水平下降更為顯著。采用TT濃度為標(biāo)準(zhǔn)，血清T水平處于性腺功能減退范圍的發(fā)生率在 60歲以上、70歲以上和80歲以上的男子分別為20%、30%和50%，當(dāng)采用游離T指數(shù)為標(biāo)準(zhǔn)時(shí)該發(fā)生率更高[15]。其他研究也注意到與增齡相關(guān)的TT下降[16]，這種下降大約從30歲開始[11,17]，其機(jī)制尚不完全清楚。隨著T水平下降，血清FSH水平升高而LH水平輕度上升或無改變[16]，表明T的下降并非LH降低的結(jié)果，提示存在間質(zhì)細(xì)胞缺陷。盡管血清LH水平無明顯改變，但下丘腦GnRH基因表達(dá)和含量及LH脈沖幅度存在與年齡相關(guān)的變化已得到證實(shí)。與年輕男子相比，血清T水平低下的健康年長(zhǎng)男子LH脈沖頻率異常，脈沖幅度降低，以及分泌無序[18]，因此即使平均血清LH濃度無下降，也不能排除下丘腦-垂體功能衰退在間質(zhì)細(xì)胞衰老中的原發(fā)作用。采用脈沖式靜脈滴注重組人LH及分析LH-T計(jì)量反應(yīng)估算模式，Veldhuis等證實(shí)LH刺激睪丸合成T的能力呈現(xiàn)年齡相關(guān)的下降。睪丸對(duì)LH刺激的應(yīng)答表現(xiàn)出與年齡相關(guān)的3種不同缺陷：生物合成的LH脈沖效力進(jìn)行性降低、間質(zhì)細(xì)胞對(duì)內(nèi)源性LH脈沖的敏感性降低以及LH脈沖對(duì)T的降調(diào)增強(qiáng)[19]。老齡Brown Norway大鼠（20月齡）與年輕大鼠（4～6月齡）相比，間質(zhì)細(xì)胞甾體合成能力下降近50%，將分離純化的衰老間質(zhì)細(xì)胞與LH進(jìn)行離體培養(yǎng)不能增加其T的合成[13,20]。有證據(jù)顯示源自線粒體電子傳遞鏈、類固醇合成和（或）巨噬細(xì)胞的活性氧（ROS）通過改變衰老間質(zhì)細(xì)胞內(nèi)的氧化還原環(huán)境，可能損傷間質(zhì)細(xì)胞膜脂質(zhì)和蛋白質(zhì)，致使LH信號(hào)傳導(dǎo)衰減，影響環(huán)磷酸腺苷的生成、膽固醇經(jīng)類固醇生成急性調(diào)節(jié)蛋白（StAR）和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（18-kd TSPO）的轉(zhuǎn)運(yùn)以及類固醇合成酶。年齡相關(guān)的COX2活性增加（可能起因于ROS誘導(dǎo)的p38MAPK磷酸化）也促成了StAR表達(dá)降低，從而抑制T生物合成的限速步驟。此外，其他激素和（或）生長(zhǎng)因子，包括PACAP和細(xì)胞因子可能也參與了年齡相關(guān)的間質(zhì)細(xì)胞T合成下降[13,21]。不過，也有人認(rèn)為用LH受體或間質(zhì)細(xì)胞絕對(duì)數(shù)量減少來解釋LH效力的減弱更合理，內(nèi)源性LH生物活性的改變可能是間質(zhì)細(xì)胞類固醇合成降低的原因[18]。

二、精液質(zhì)量

精液質(zhì)量通常被視為評(píng)估男性生育力的替代指標(biāo)，已發(fā)現(xiàn)精子濃度≥40×106/ml可增加一個(gè)月經(jīng)周期的受孕概率[22]。多種因素包括毒物接觸的蓄積、宿主自身的因素如泌尿生殖道感染、血管性疾病或年齡等可都能導(dǎo)致精液質(zhì)量的改變。對(duì)3698例不育男子的回顧性橫斷面數(shù)據(jù)顯示，附性腺感染發(fā)生率隨年齡增加而增高（＜25歲為6.1%而＞40歲男子為13.65%），附性腺感染者精子計(jì)數(shù)顯著降低。毒性物質(zhì)的長(zhǎng)期接觸或蓄積可直接損傷精子發(fā)生或生殖細(xì)胞DNA，接觸后對(duì)精子數(shù)量和活力的影響可持續(xù)多年。不過，盡管環(huán)境因素對(duì)中老年男子精液參數(shù)的損傷已被廣泛接受，但尚缺乏確鑿證據(jù)[23]。年齡對(duì)常規(guī)精液參數(shù)的真實(shí)意義尚有爭(zhēng)議，但至少有大量證據(jù)表明老齡化與精液量、精子活力和正常形態(tài)精子比例降低有關(guān)，與精子濃度的關(guān)系不明確[23,24]。還有研究發(fā)現(xiàn)年齡相關(guān)的精子存活率[25,26]、精漿果糖和α-葡糖苷酶水平下降[27]。涉及1 174例健康人群的大樣本研究顯示45歲以上男子精液參數(shù)基線值達(dá)到或超過WHO推薦的正常參考值者僅占46%[28]，對(duì)中國(guó)健康男子的研究也有類似發(fā)現(xiàn)[25]，因此評(píng)價(jià)精液質(zhì)量時(shí)應(yīng)考慮年齡因素的影響。Sloter等[29]應(yīng)用計(jì)算機(jī)輔助精液分析證實(shí)年齡相關(guān)的精子活力下降（活動(dòng)精子、前向活動(dòng)精子、快速活動(dòng)精子分別以每年0.8%、0.9%、0.4%的速度下降），精子運(yùn)動(dòng)的3個(gè)定量指標(biāo)包括直線性、直線速度、平均軌跡速度分別以每年02.%、0.2%和0.3%速度下降。推測(cè)隨年齡增加，運(yùn)動(dòng)精子減少，運(yùn)動(dòng)精子的線性運(yùn)動(dòng)能力降低，致單位時(shí)間內(nèi)前向運(yùn)動(dòng)距離減小，從而影響男性生育力。另外，利用活動(dòng)精子細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察，Silva等證實(shí)增齡伴有顯著的正常精子比例下降和大核空泡精子（精子核空泡區(qū)＞50%）比例增加，絕大多數(shù)≥41歲男子都見有明顯的精子形態(tài)學(xué)改變[30]。有證據(jù)顯示大的核空泡與精子DNA碎片和變性以及異常染色質(zhì)包裝有關(guān)。

盡管不少研究者認(rèn)為精液參數(shù)的變化呈漸進(jìn)性，無明確年齡界線[9,24,29,31]。但Stone等觀察4822份精液樣本，發(fā)現(xiàn)34歲后總精子數(shù)和精子活力明顯下降，40歲開始精子密度和正常形態(tài)精子比例下降（分別為0.8%/年），43歲后活動(dòng)精子比例和活動(dòng)精子前向運(yùn)動(dòng)參數(shù)下降（分別每年為2%和0.8%/年），45歲后精液量下降，55歲后見精液中攜帶Y和X染色體精子比值下降，預(yù)測(cè)＞34歲男子致孕的可能性降低[32]。也有研究報(bào)告類似結(jié)果[33,34]。Levitas 等發(fā)現(xiàn)精子參數(shù)峰值出現(xiàn)在年齡≥30歲～＜35歲，最明顯的下降發(fā)生在55歲以后[33]。Zhu等以人群為基礎(chǔ)涉及998例中國(guó)男子的研究也觀察到精子前向運(yùn)動(dòng)率、存活率及正常形態(tài)精子比例的下降具有不同年齡的轉(zhuǎn)折點(diǎn)，精子快速前向運(yùn)動(dòng)力和正常形態(tài)精子比例從30歲開始緩慢下降，前向運(yùn)動(dòng)力的下降從40歲開始，精子存活率在20～60歲持續(xù)緩慢下降[35]。研究人群、年齡組截點(diǎn)、以及分析方法的不同可能解釋研究結(jié)果間的差異。

三、生育力與生育結(jié)局

精液質(zhì)量?jī)H為受孕概率的間接測(cè)量，年齡相關(guān)的精液質(zhì)量下降并不能證明高齡男子致孕或受精機(jī)會(huì)降低。多種混淆變量包括女方高齡、性交頻率降低、勃起功能障礙發(fā)生率增高、以及吸煙等，增加了獨(dú)立評(píng)估男方年齡對(duì)生育潛能影響的難度。

Katz-Jaffe等對(duì)6～8周齡雄性遠(yuǎn)系繁殖CF1小鼠在15個(gè)月期間與6～8周齡超排卵雌鼠常規(guī)交配的生育結(jié)局（體內(nèi)、體外）進(jìn)行觀察。結(jié)果顯示≥12月齡雄鼠所致體內(nèi)受精率、胎兒體長(zhǎng)體質(zhì)量、胎盤質(zhì)量均明顯低于＜12月齡雄性小鼠。離體胚囊發(fā)育明顯降低，胚囊移植流產(chǎn)率明顯增高。此外，12～15月齡小鼠精子Ace-1、Prm1、Prm2以及Smep基因表達(dá)水平降低。表明父系生育力從中年（12月齡，相當(dāng)于人40～50歲）開始迅速退化，父系年齡對(duì)自然受孕、離體胚囊發(fā)育、胚囊植入潛能以及胎兒生存具有直接負(fù)面影響[36]。

也有大樣本研究嘗試描述男方年齡對(duì)夫婦生育力的影響[24,37]。在對(duì)2 112妊娠婦女的隊(duì)列研究，Hassan等發(fā)現(xiàn)，當(dāng)男方年齡＞45歲時(shí)，妊娠等待時(shí)間（TTP）增加5倍，夫婦TTP＞1年或＞2年的相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)分別是≤25歲男子的4.6倍和12.5倍[38]。Dunson等對(duì)782對(duì)健康夫婦5 860個(gè)月經(jīng)周期的回顧性分析也顯示男子生育力在35歲后明顯下降[39]。這些研究均對(duì)女方年齡及性行為等混雜變量進(jìn)行了控制。丹麥一般人群前瞻性隊(duì)列研究亦顯示與20～24歲男子相比，35～39歲男子的生育力略有下降（0.95，95% CI: 0.77-1.19），去除周期規(guī)律和月經(jīng)周期長(zhǎng)度變量后該結(jié)果保持不變[40]。Matorras等發(fā)現(xiàn)男性從35～39歲開始生育力呈指數(shù)型下降（斜率-0.11至-0.12），其獨(dú)立于女方年齡，39歲后生育力年下降率為21%～23%[41]。

還有大量研究檢測(cè)了父親年齡對(duì)接受輔助生育技術(shù)（ART）治療夫婦妊娠結(jié)局的影響。Klonoff-Cohen等發(fā)現(xiàn)妊娠率隨男方年齡的增加而降低。男方年齡≤30歲、36～40歲、＞40歲時(shí)活產(chǎn)率分別為38%、17%和7%。男方年齡每增加一歲，無成功活產(chǎn)的比值增加12%[42]。為了避免男方年齡分析中的取樣偏倚，Rochebrochard等選擇研究了1938對(duì)因女方不孕（雙側(cè)輸卵管梗阻或缺失）要求IVF治療夫婦的ART數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)與＜30歲男子相比，男方年齡≥40歲IVF受孕失敗的比值比為1.70，表明類似女方年齡超過35歲，男方年齡超過40歲也是生育的一個(gè)主要危險(xiǎn)因素[43]。

有人提出贈(zèng)卵接受者是研究人類父親年齡對(duì)妊娠結(jié)局影響的最佳人群。因贈(zèng)卵一般取自年輕健康婦女，基本排除了女方年齡的影響。Frattarelli等對(duì)接受贈(zèng)卵周期治療的1 023對(duì)不孕夫婦的評(píng)價(jià)報(bào)告男方年齡＞50歲對(duì)妊娠結(jié)局及囊胚形成率有顯著影響，男方年齡≤50歲和＞50歲活產(chǎn)率和流產(chǎn)率分別為56.0%和41.3%，24.4%和41.5%。植入率、妊娠率及早期胚胎發(fā)育不受男方年齡的影響[44]。相反，一項(xiàng)涉及1083對(duì)不孕夫婦1 392贈(zèng)卵周期的回顧性隊(duì)列研究在對(duì)女方受體年齡和治療周期數(shù)進(jìn)行校正后，未發(fā)現(xiàn)父親年齡與妊娠結(jié)局有明顯的關(guān)系，不過男方年齡增加與精液量和精子活力顯著相關(guān)[45]。近期Dain等的Meta分析認(rèn)為沒有足夠證據(jù)證明父親高齡對(duì)ART結(jié)局的影響，但確發(fā)現(xiàn)胚囊形成比例降低與父親年齡增加有關(guān)[46]。

采用全基因組測(cè)序證實(shí)父親新生突變率隨年齡的增加而增高[2,37,47,48]。高齡父親與生育能力之間的反向關(guān)系提示老化雄性配子新生基因突變的可能性。每一次細(xì)胞有絲分裂，基因組的復(fù)制對(duì)諸如堿基對(duì)交換、微缺失、微重疊等錯(cuò)誤更為敏感，導(dǎo)致可能影響蛋白質(zhì)編碼和（或）功能的新生突變累積。據(jù)估計(jì)精原干細(xì)胞在青春期前分裂30次，進(jìn)入成年期后每16d分裂一次，50歲時(shí)已發(fā)生840次分裂，每一次復(fù)制都可能導(dǎo)致DNA拷貝錯(cuò)誤[36,48]。老齡化過程亦累及到表觀遺傳學(xué)，生殖細(xì)胞表觀遺傳標(biāo)記的建立和（或）維持中的錯(cuò)誤，包括DNA甲基化、組蛋白尾部修飾、目標(biāo)組蛋白保留、魚精蛋白嵌入可能導(dǎo)致受精率降低，存活率下降及不正確的胚胎基因組活化等[36,49]。新的基因突變的產(chǎn)生和表觀遺傳修飾可能影響精子質(zhì)量和功能。高齡父親應(yīng)被視為人群中新的基因突變的重要原因。最新估計(jì)表明15%～30%男性因素不育是基因異常所致，隨著更多導(dǎo)致不育基因的識(shí)別該比例可能還會(huì)升高[50]。高齡男子精漿ROS水平升高，精子DNA損傷（單鏈和雙鏈DNA斷裂）增加及早期凋亡標(biāo)記表達(dá)增高[11,51]。目前標(biāo)準(zhǔn)臨床試驗(yàn)室檢測(cè)方法無法識(shí)別的早期凋亡精子可能存在功能不全而不能受精，攜帶DNA損傷的精子進(jìn)入卵子可導(dǎo)致胚胎發(fā)育不良、流產(chǎn)及其他負(fù)面影響的風(fēng)險(xiǎn)。為此，一些國(guó)家將供精者年齡上限定為40～45歲。

理解男性年齡對(duì)生育功能的影響具有重要的公共衛(wèi)生意義。男性睪丸功能和精子質(zhì)量隨年齡增長(zhǎng)而下降，高齡父親攜帶已知和未知的風(fēng)險(xiǎn)。ART的發(fā)展使得即使是精液質(zhì)量最差的高齡男子也能夠致孕，但其中所涉及風(fēng)險(xiǎn)并未被完全認(rèn)識(shí)。年齡是決定生育力的一個(gè)最重要的因素，不僅是高齡母親，父親年齡的增長(zhǎng)（＞40歲）也與生育力降低、妊娠相關(guān)并發(fā)癥及不良結(jié)局有關(guān)。在生殖生物學(xué)領(lǐng)域人們的思維模式正在轉(zhuǎn)變，高齡父親的潛在風(fēng)險(xiǎn)將與母親因素一并考慮。同時(shí)應(yīng)盡快制定高齡潛在父親評(píng)估和咨詢的正式指南。

父親年齡; 生育力; 生育結(jié)局

1 Martin JA, Hamilton BE, Ventura SJ, et al. Natl Vital Stat Rep 2011; 60(1): 1-72

2 Wiener-Megnazi Z, Auslender R, Dirnfeld M. Asian J Androl 2012; 14(1): 69-76

3 Yu J Zhang X, Huang H, et al. Chin J Fam Plan 2008; 153: 413-415

4 American Society for Reproductive Medicine. Age and fertility. A guide for patients revised 2012. http:// www.asrm.org/uploadedFiles/ASRM_Content/Resources/ Patient_Resources/Fact_Sheets_and_Info_Booklets/ agefertility.pdf

5 Dain L, Auslander R, Dirnfeld M. Fertil Steril 2011; 95(1): 1-8

6 Toriello HV, Meck JM，Professional Practice and Guidelines Committee. Genet Med 2008; 10(6): 457-460

7 Mahmoud AM, Goemaere S, El-Garem Y, et al. J Clin Endocrinol Metab 2003; 88(1): 179-184

8 Kidd SA, Eskenazi B, Wyrobek AJ. Fertil Steril 2001; 75(2): 237-248

9 Kühnert B, Nieschlag E. Hum Reprod Update 2004; 10(4): 327-339

10 Sampson N, Untergasser G, Plas E, et al. J Pathol 2007; 211(2): 206-218

11 Amaral S, Amaral A, Ramalho-Santos J. Front Biosci (Schol Ed) 2013; 5: 181-197

12 Kimura M, Itoh N, Takagi S, et al. J Androl 2003; 24(2): 185-191

13 Chen H, Ge RS, Zirkin BR. Mol Cell Endocrinol 2009; 10: 306(1-2): 9-16

14 Surampudi PN, Wang C, Swerdloff R. Int J Endocrinol 2012; 2012: 625434. doi:10.1144/2012/625434

15 Harman SM, Metter EJ, Tobin JD, et al. J Clin Endocrinol Metab 2001; 86(2): 724-731

16 Travison TG, Nguyen AH, Naganathan V, et al. J Clin Endocrinol Metabol 2011; 96(8): 2464-2474

17 Amaral S, Ramalho-Santos J. Curr Aging Sci 2009; 2(3): 165-173

18 Keenan DM, Veldhuis JD. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 2009; 297(5): R1215-R1227

19 Veldhuis JD, Liu PY, Keenan DM, et al. Am J Physiol Endocrinol Metab 2012; 302(1): E117-E122

20 Chen H, Hardy MP, Zirkin BR. Endocrinol 2002; 143(5): 1637-1642

21 Wang X, Stocco D. Mol Cell Endocrinol 2005; 238(1-2): 1-7

22 Jensen TK, Jacobsen R, Christensen K, et al. Am J Epidemiol 2009; 170(5): 559-565

23 Sartourius GA, Nieschlag E. Hum Reprod Update 2010; 16(1): 65-79

24 Kidd SA, Eskenazi B, Wyrobek AJ. Fertil Steril 2001; 75(2): 237-248

25 崔起元, 高爾生, 周維謹(jǐn), 等. 中華流行病學(xué)雜志 2009; 30(9): 899-902

26 Brahem S, Mehdi M, Elghezal H, et al. J Assist Reprodu Genet 2011; 28(5): 425-432

27 Molina RI, Martini AC, Tissera A, et al. Arch Esp Urol 2010; 63(3): 214-222

28 Hellstrom WJ, Overstreet JW, Sikka SC, et al. J Androl 2006; 27(3): 421-428

29 Sloter E, Schmid TE, Marchetti F, et al. Hum Reprod 2006; 21(11): 2868-2875

30 Silva LF, A Oliveira JB, Petersen CG, et al. Reprod Biol Endocrinol 2012;10:19

31 Eskenazi B, Wyrobek AJ, Sloter E, et al. Hum Reprod 2003; 18(2): 447-454

32 Stone BA, Alex A, Werlin LB, et al. Fertil Steril 2013; 100(4): 952-958

33 Levitas E, Lunenfeld E, Weisz N, et al. Andrologia 2007; 39(2): 45-50

34 Pasqualotto FF, Sobreiri BP, Hallak J, et al. Brit J Urol 2005; 96(7): 1087-1091

35 Zhu QX, Meads C, Lu ML, et al. Fertil Steril 2011; 96(3): 572-576

36 Katz-Jaffe MG, Parks J, McCallie B, et al. Fertil Steril 2013; 100(1): 262-268

37 Humm KC, Sakkas D. Fertil Steril 2013; 99(1): 30-36

38 Hassan MA, Killick SR. Fertil Steril 2003; 79 Suppl 3: 1520-1527

39 Dunson DB, Colombo B, Baird DD. Hum Reprod 2002;17(5): 1399-1403

40 Rothman KJ, Wise LA, Sorensen HT, et al. Fertil Steril 2013; 99(7): 1958-1964

41 Matorras R, Matorras F, Exposito A, et al. Gynecol Obstet Invest 2011; 71(4): 229-235

42 Klonoff-Cohen HS, Natarajan L. Am J Obstet Gynecol 2004; 191(2): 504-514

43 de La Rochebrochard, de Mouzon J, Thepot F, et al. Fertil Steril 2006; 85(5): 1420-1424

44 Frattarelli JL, Millier KA, Millier BT, et al. Fertil Steril 2008; 90(1): 97-103

45 Whitcomb BW, Turzanski-Fortner R, Richter KS, et al. Fertil Steril 2011; 95(1): 147-151

46 Dain L, Auslander R, Dirnfeld M. Fertil Steril 2011; 95: 1-8

47 Kovac JR, Addai J, Smith RP, et al. Asian J Androl 2013; 15(6): 723-728

48 Kong A, Frigge ML, Masson G, et al. Nature 2012; 488(7412): 471-475

49 Jenkins TG, Carrell DT. Asian J Androl 2011; 13(1): 76-80

50 Kovac JR, Pastuszak AW, Lamb DJ. Fertil Steril 2013; 99(4): 998-1007

51 Colin A, Barroso G, Comez-Lopez N, et al. Fertil Steril 2010; 94(7): 2609-2614

（2013-10-13收稿）

10.3969/j.issn.1008-0848.2014.01.020