韓 松，林艷茹，馬曉艷，滕 紅

（吉林大學(xué)第二醫(yī)院 婦產(chǎn)科，吉林 長(zhǎng)春130041）

自然流產(chǎn)是婦產(chǎn)科的一種常見(jiàn)病，目前國(guó)內(nèi)的定義是指妊娠不足28周、胎兒體重不足1 000g而終止者，發(fā)病的幾率約為15%－40%[1]。在導(dǎo)致早期自然流產(chǎn)的眾多因素中最常見(jiàn)的是染色體的異常，約占60%[2]。本文就近幾年對(duì)染色體異常的多種檢測(cè)技術(shù)的應(yīng)用進(jìn)展進(jìn)行綜述。

染色體的異常包括染色體結(jié)構(gòu)異常和染色體數(shù)目異常，而數(shù)目異常則是最常見(jiàn)的原因。目前，臨床應(yīng)用最廣泛的是絨毛培養(yǎng)結(jié)合染色體核型分析技術(shù)，能夠發(fā)現(xiàn)所有染色體的數(shù)目異常和結(jié)構(gòu)異常。但缺點(diǎn)是細(xì)胞培養(yǎng)周期長(zhǎng)，需無(wú)菌取材、操作，對(duì)實(shí)驗(yàn)室、技術(shù)人員要求較高，另外對(duì)母源組織的污染也難鑒別等。同時(shí)這種方法還受分裂相數(shù)量、質(zhì)量等的影響。自然流產(chǎn)組織一般都具有組織陳舊、容易污染、培養(yǎng)失敗率較高等自身特點(diǎn)，限制了此方法在臨床中的廣泛應(yīng)用。

近幾年，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步，新技術(shù)、新方法層出不窮被逐漸應(yīng)用于臨床，為各種疾病的診斷提供重要依據(jù)和創(chuàng)新思路。目前，檢測(cè)染色體異常的技術(shù)主要有SKY、FISH、羊膜腔穿刺培養(yǎng)、QF－PCR、MLPA等。

1 FISH技術(shù)檢測(cè)染色體異常的應(yīng)用

1.1 熒光原位雜交技術(shù)檢測(cè)染色體異常的應(yīng)用熒光原位雜交（Fluorescence In Situ Hybridization，F(xiàn)ISH）技術(shù)是20世紀(jì)80年代末興起的細(xì)胞遺傳生物學(xué)方法中的一種新型技術(shù)，它采用特殊熒光素標(biāo)記的DNA探針，對(duì)未培養(yǎng)的絨毛組織按照同源互補(bǔ)原則進(jìn)行原位雜交，雜交后經(jīng)過(guò)免疫顯色，就能快速準(zhǔn)確的判斷染色體顏色和數(shù)目的異常。

1.2 FISH檢測(cè)染色體異常的優(yōu)勢(shì) 在自然流產(chǎn)組織中染色體非整倍體異常是最常見(jiàn)的畸變類(lèi)型，如21三體、18三體、性染色體及多倍體，嵌合體等，約占50%－60%[3，4]。①FISH 技術(shù)可直接應(yīng)用于未培養(yǎng)絨毛細(xì)胞的分裂中期、間期分裂相等階段②相比傳統(tǒng)的G顯帶核型分析技術(shù)的費(fèi)時(shí)耗力，F(xiàn)ISH則只需在采集標(biāo)本1－2個(gè)小時(shí)后即可做出診斷，明顯縮短了檢測(cè)時(shí)間。③早期自然流產(chǎn)組織培養(yǎng)失敗率為5%－42%[5，6]，對(duì)于自然流產(chǎn)組織的陳舊，易污染，培養(yǎng)的時(shí)間長(zhǎng)失敗率高[7]等問(wèn)題，F(xiàn)ISH則是解決它們很有效的手段。④在傳統(tǒng)方法檢測(cè)染色體中無(wú)法辨別的染色體異常的病例，如染色體的突變，染色體的微缺失等方面的異常，F(xiàn)ISH則能快速準(zhǔn)確的做出診斷，具有特異性強(qiáng)，靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)。方小武、李紅艷等檢測(cè)了30例培養(yǎng)失敗的絨毛組織標(biāo)本，應(yīng)用FISH技術(shù)檢出染色體數(shù)目異常14例，使檢測(cè)的準(zhǔn)確率提高[8]。FISH技術(shù)用于檢測(cè)自然流產(chǎn)組織染色體的異常時(shí)，避免了標(biāo)本易污染導(dǎo)致的細(xì)胞培養(yǎng)失敗、培養(yǎng)過(guò)程中染色體的變異等缺點(diǎn)，省去了制備染色體DNA和顯微鏡下分析核型等繁瑣的過(guò)程，能快速診斷疾病，減少了患者焦慮的等待時(shí)間，具有較高的靈敏度和特異性。

1.3 FISH技術(shù)檢測(cè)染色體異常中的缺點(diǎn) 應(yīng)用FISH技術(shù)檢測(cè)染色體異常時(shí)雖然有很多自身優(yōu)勢(shì)，但也因各方面的限制使其仍不能完全取代傳統(tǒng)細(xì)胞遺傳學(xué)方法，臨床上若將FISH與常規(guī)染色體核型分析聯(lián)合應(yīng)用，則可為臨床疾病的診斷提供更準(zhǔn)確的依據(jù)。①探針?lè)N類(lèi)有限，只能檢測(cè)幾種常見(jiàn)的非整倍體染色體異常，使得一些特異性區(qū)域無(wú)法檢測(cè)而造成漏診，因此商品化的探針數(shù)目有限而使FISH在應(yīng)用上受到一定的限制。②可有假陽(yáng)性或假陰性結(jié)果出現(xiàn)，即使是正常染色體標(biāo)本，在FISH試驗(yàn)中也會(huì)出現(xiàn)異常的情況.③母體細(xì)胞受到污染時(shí)，F(xiàn)ISH則不能準(zhǔn)確檢測(cè)到存在母體污染的女性胚胎。④價(jià)格昂貴，探針和實(shí)驗(yàn)儀器價(jià)格昂貴，對(duì)實(shí)驗(yàn)室條件要求高等。

2 CGH、QF－PCR、MLPA

2.1 CGH在檢測(cè)染色體異常中的應(yīng)用 CGH

（comparative genomic hybridization）比較基因組雜交技術(shù)，是一種新型的細(xì)胞遺傳學(xué)技術(shù)，它是一種快速、系統(tǒng)、全方位的檢測(cè)方法，可以檢測(cè)整個(gè)基因組內(nèi)染色體的獲得與丟失。最初主要應(yīng)用于腫瘤遺傳方面的研究[9]，現(xiàn)被證實(shí)它也可以應(yīng)用于臨床細(xì)胞遺傳學(xué)研究[10－13]。

臨床上自然流產(chǎn)組織的標(biāo)本，不僅培養(yǎng)失敗率高，且大多數(shù)不能及時(shí)檢測(cè)，而CGH分析檢測(cè)陳舊組織時(shí)僅需要DNA，不需要培養(yǎng)，可直接從標(biāo)本中獲得，這樣就可避免培養(yǎng)失??；CGH可直接對(duì)冰凍組織、陳舊組織等儲(chǔ)存樣本進(jìn)行研究，只需少量的樣本就可以對(duì)整個(gè)基因組染色體數(shù)目的變化做出診斷，具有較高的準(zhǔn)確率。作為一種在FISH基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的新型技術(shù)，它彌補(bǔ)了FISH探針?lè)N類(lèi)有限和檢測(cè)位點(diǎn)局限的缺點(diǎn)。

目前CGH技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于自然流產(chǎn)組織染色體異常的檢測(cè)，2009年 Menten[14]等將CGH與傳統(tǒng)細(xì)胞遺傳學(xué)技術(shù)結(jié)合流式細(xì)胞儀分析的100例自然流產(chǎn)組織和死胎標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)染色體異常核型為26例；2002年Stephenson[15]等用CGH 技術(shù)對(duì)285例反復(fù)流產(chǎn)患者，420例自然流產(chǎn)標(biāo)本進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)染色體異常率為46%；2000年Fritz[16]等用CGH技術(shù)檢測(cè)了60例早期自然流產(chǎn)樣本，檢測(cè)出染色體異常率約為72%。

2.2 熒光定量QF－PCR在檢測(cè)染色體異常中的應(yīng)用 熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（Quantitative Fluorescent Polymerase Chain Reaction，QF－PCR）技術(shù)是一種通過(guò)對(duì)短串聯(lián)重復(fù)序列（short tandem repeat，STR）進(jìn)行擴(kuò)增，然后對(duì)染色體拷貝數(shù)目異常進(jìn)行快速產(chǎn)前診斷的方法。最初應(yīng)用于唐氏綜合征的快速產(chǎn)前診斷。后來(lái)經(jīng)過(guò)優(yōu)化和改良，目前已被廣泛應(yīng)用于染色體異常的檢測(cè)，主要用于產(chǎn)前診斷中13三體、18三體、21三體的診斷；同時(shí)也應(yīng)用于性染色體異常的診斷，如XO和XXY。

QF－PCR具有以下特點(diǎn)：①快速。QF－PCR技術(shù)應(yīng)用了自動(dòng)軟件分析儀器而使整個(gè)檢測(cè)過(guò)程僅需幾個(gè)小時(shí)便可完成，減少了患者焦慮的等待時(shí)間；②QF－PCR在鑒別母源性污染時(shí)比傳統(tǒng)核型分析技術(shù)和FISH更具有優(yōu)勢(shì)。③其實(shí)驗(yàn)過(guò)程可實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化，對(duì)多個(gè)樣本可同時(shí)進(jìn)行批量檢測(cè)，操作簡(jiǎn)單方便，適用于大批量、大規(guī)模的檢測(cè)；④所需的標(biāo)本量少、結(jié)果可靠?？啥鄠€(gè)位點(diǎn)對(duì)引物進(jìn)行同步擴(kuò)增，結(jié)果并不互相影響；⑤費(fèi)用低，不需要特殊儀器更加經(jīng)濟(jì)。但是也有其自身的的缺點(diǎn)，如為了防止擴(kuò)增片段中加入不必要的染色體部分，則需要找到更多的位點(diǎn)進(jìn)行復(fù)合擴(kuò)增，具有一定的難度。目前因?yàn)樵噭┖械姆N類(lèi)有限，QF－PCR技術(shù)還需要探索和完善。

在診斷染色體異常方面QF－PCR技術(shù)具有十分廣闊的發(fā)展空間。Cirigliano等[17]利用 QF－PCR對(duì)43000例臨床樣本進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示凡涉及到21、18、13、X和Y染色體的非整倍體100%被檢測(cè)出，一部分三體和嵌合體也被檢測(cè)出，95%的臨床相關(guān)異常被迅速檢出以及異常妊娠可以及時(shí)終止而不用等核型分析的結(jié)果。Sellmidt等[18]使熒光定量QF－PCR與STR結(jié)合應(yīng)用，檢測(cè)了662例患者的13，18，21，X，Y號(hào)染色體，檢測(cè)出12個(gè)樣本常染色體數(shù)目異常，6個(gè)樣本的性染色體異常，21和13的染色體均有易位及在一例樣本檢測(cè)中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)嵌合體，檢測(cè)的結(jié)果和核型分析的結(jié)果相同，驗(yàn)證了這種方法應(yīng)用于產(chǎn)前診斷常見(jiàn)染色體的非整倍體的準(zhǔn)確可行性。最近Liao[19]等發(fā)現(xiàn)QF－PCR技術(shù)也可以用于檢測(cè)表型不明顯的染色體異常，這個(gè)發(fā)現(xiàn)又將產(chǎn)前診斷的發(fā)展向前推進(jìn)了一步。

2.3 多重連接探針擴(kuò)增技術(shù)在檢測(cè)染色體異常中的應(yīng)用 多重連接探針擴(kuò)增（multiplex ligation－dependent probe amplification，MLPA）技術(shù)是于2002年被Schouten等首次提出的，是結(jié)合分子雜交、連接和PCR半定量的新技術(shù)。于一次單一反應(yīng)管內(nèi)可同時(shí)檢測(cè)40個(gè)核苷酸序列拷貝數(shù)的變化，具有高通量、高分辨率以及成本低等優(yōu)點(diǎn)。目前被廣泛應(yīng)用于多個(gè)領(lǐng)域、多種疾病的研究。

MLPA技術(shù)具有高度的特異性，目前已針對(duì)容易發(fā)生畸變的熱點(diǎn)基因如18、13、21、X、Y染色體設(shè)計(jì)了特殊的探針，可以通過(guò)觀察基因數(shù)目的變化而判斷染色體的異常。該技術(shù)還可以利用探針信號(hào)的異常檢測(cè)出染色體三體型，部分嵌合體和染色體結(jié)構(gòu)畸變。在自然流產(chǎn)樣本染色體的分析中，它能檢測(cè)已知區(qū)域的微小缺失、重復(fù)或突變，補(bǔ)充了傳統(tǒng)細(xì)胞遺傳學(xué)分析中的不足。MLPA作為核型分析的補(bǔ)充手段之一，具有高效、特異性高、方便快捷、價(jià)格低廉等特點(diǎn)。國(guó)內(nèi)外均有研究將該技術(shù)用于胎兒、新生兒及流產(chǎn)組織的非整倍體檢測(cè)[20－22]。

綜上所述，隨著現(xiàn)代分子細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，尤其是快速產(chǎn)前診斷技術(shù)和自然流產(chǎn)染色體檢測(cè)技術(shù)等領(lǐng)域提供了巨大的發(fā)展空間。但是目前每種技術(shù)并不完美，存在自身局限性和缺陷，這也給其在臨床中的廣泛應(yīng)用帶來(lái)一定的困難。省時(shí)、簡(jiǎn)便、快捷、價(jià)格便宜的診斷方法是我們共同努力去實(shí)現(xiàn)的目標(biāo)，相信隨著分子生物學(xué)技術(shù)和細(xì)胞遺傳學(xué)技術(shù)的不斷創(chuàng)新和進(jìn)步，新技術(shù)新方法的不斷涌現(xiàn)，將會(huì)為我國(guó)優(yōu)生優(yōu)育做出重要的貢獻(xiàn)。

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