柳愛姿，包曉辰，方以群，桑仲娜，李華江，張萬起△

（1.天津醫(yī)科大學，天津300070；2.海軍醫(yī)學研究所，上海200433；3.海軍司令部航海保證部綜合辦，天津300042）

臨床上經常采用氧氣治療各種缺氧性疾病，高壓氧氣被用來治療減壓病、股骨頭壞死等疾?。?］。但長時間暴露于氧氣中會導致氧中毒的發(fā)生，其中較為常見的是肺型氧中毒［2］。

目前，認為氧自由基是導致氧中毒發(fā)生的主要原因［3］。但最近有文獻報道高壓氧導致的肺型氧中毒和常壓氧（1 ATA，100%氧氣）導致的肺型氧中毒存在不同的發(fā)病機制，而不同的一氧化氮合成酶（eNOS，nNOS）可能在兩種肺型氧中毒中各自起著主要作用［4］。因此Demchenko IT等學者認為兩者存在不同的發(fā)病機制［5，6］。本文擬通過檢測不同壓力氧氣暴露下大鼠肺組織中eNOS、nNOS的表達變化，探討常壓氧及高壓氧導致的肺型氧中毒的不同發(fā)病特點。

1 材料與方法

1.1 動物及分組

60只雄性SD大鼠，體重200 g左右，6周。購買于上海畢凱實驗動物公司。實驗前1周飼養(yǎng)于海軍醫(yī)學研究所動物中心。動物隨機分為6組（n＝10），分別是對照組、1 ATA組、1.5 ATA組、2 ATA組、2.5 ATA組、3 ATA組。

1.2 試劑

eNOS、nNOS抗體購自 Transduction Laboratories公司。BCA蛋白試劑盒購自pierce公司。Gapdh抗體、ECL試劑盒購自santa cruze公司。5x蛋白上樣緩沖液購自上海生工。

1.3 氧暴露方案

實驗動物置于氧艙中，氧艙內放置CO2吸收劑。100%氧氣洗艙10 min后，氧流量監(jiān)測儀顯示氧氣濃度大于97%，加壓至實驗壓力。1ATA組暴露56 h、1.5 ATA組暴露20 h、2 ATA組暴露10 h、2.5 ATA組暴露8 h、3 ATA組暴露6 h。

1.4 肺組織濕干比

取右下肺組織，先稱取各個肺組織的濕重。然后置于80°C烤箱中烘烤48 h后，稱取干重。計算濕／干重的比例（n＝5）。

1.5 支氣管肺泡灌洗液蛋白含量測定

每組取5只大鼠，采用戊巴比妥鈉麻醉后（100 mg／kg，腹腔注射），逐層剪開皮膚、分離主支氣管、剪T型切口。5 ml注射器抽取5 ml預冷的PBS，插入主支氣管，結扎固定后，反復抽吸5次，回收率達到60%以上（～3 ml）。收獲的支氣管肺泡灌洗液1 000，4℃離心10 min后，收集上清儲存在70℃冰箱。灌洗液蛋白測定按照Pierce BCA蛋白試劑盒說明書操作。

1.6 Western blot檢測凋亡蛋白

動物麻醉后，取肺組織，在蛋白裂解液中裂解（Cell Signaling Technology，Inc.，Danvers，MA，USA）containing 0.2 mmol／L phenylmethylsulfonyl fluoride（PMSF），0.15μmol／L pepstatin A，20μmol／L leupeptin，and 1 mmol／L sodium orthovanadate后，1 000 g，4°C離心10 min后，取上清，測定蛋白含量。蛋白樣品加入5x上樣緩沖液，100°C煮沸5 min。等量樣品加入電泳槽中，濃縮膠90 V電泳15 min，10%分離膠120 V電泳90 min后。400 mA恒流轉膜150 min后，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h。分別和一抗eNOS、nNOS（1∶1 000），gapdh（1∶8 000）4℃孵育過夜。TBST洗脫15 min×3次后，二抗室溫孵育1 h，TBST洗脫15 min×3次，ECL液顯影，膠片曝光。

1.7 統(tǒng)計學方法

2 結 果

2.1 行為學改變

1.0 ATA組大鼠無明顯的氧驚厥等癥狀，1.5 ATA組及2.0 ATA組大鼠有輕微的運動障礙。2.5 ATA組有1只大鼠（10%）出現抽搐，3.0 ATA組有2只（20%）出現氧驚厥。3.0 ATA組其余大鼠出現呼吸緩慢、肢體抽搐等癥狀。

2.2 肺濕干比及支氣管肺泡灌洗液蛋白量

正常對照組濕干比（4.99±0.15）相比較，1.0 ATA及1.5 ATA氧氣暴露組大鼠肺組織的濕干比明顯升高，分別是（6.72±0.35）（P＜0.01）和（5.72±0.19）（P＜0.05）。正常對照組肺泡灌洗液蛋白量為（380.84±68.41）μg／ml，1.0 ATA及 1.5 ATA氧氣暴露組大鼠支氣管肺泡灌洗液中蛋白含量明顯升高，分別是（2432.78±651.77）μg／mL（P＜0.05）和（514.36±27.86）μg／mL（P＜0.05）。而 2.0 ATA、2.5 ATA及3.0 ATA組無明顯改變。和1.0 ATA氧氣暴露組比較，1.5 ATA、2.0 ATA、2.5 ATA及 3.0 ATA氧氣暴露組肺組織的濕干比及支氣管肺泡灌洗液中的蛋白含量均顯著降低（P＜0.01，表1）。

Tab.1 Comparison of the lung injury score and ratio of wet and dry weight（W／D）and bronchoalveolar lavage fluid（BALF）albumin concentration levels

Tab.1 Comparison of the lung injury score and ratio of wet and dry weight（W／D）and bronchoalveolar lavage fluid（BALF）albumin concentration levels

*P＜0.05，**P＜0.01 vs shamgroup；＃＃P＜0.01 vs 1 ATA group

）Sham 4.99±0.15 380.84±68.41 1 ATA 6.72±0.35** 2432.78±651.77*1.5 ATA 5.72±0.19*＃＃ 514.36±27.86*＃＃2 ATA 5.26±0.40＃＃ 548.01±45.40＃＃2.5 ATA 4.99±0.34＃＃ 564.90±92.58＃＃3 ATA 5.43±0.56＃＃ 837.04±289.11 Group W／D Total protein in BALF（μg／mL＃＃

2.3 NOS的表達量

和正常對照組相比較，各個氧氣壓力暴露組大鼠肺組織中nNOS的含量沒有明顯改變（P＞0.05）。而eNOS含量則在氧氣壓力為2 ATA時明顯降低（P＜0.05），氧氣壓力為2.5 ATA及3 ATA時明顯增高（P＜0.05，圖 1）。

3 討 論

最近有文獻證實常壓氧導致的肺型氧中毒和高壓氧導致的肺型氧中毒可能存在不同的發(fā)病機制［4，5］，而NOS可能在其中起著重要的作用。本研究為了探討NOS在不同氧氣壓力導致的肺型氧中毒的表達變化，分別研究了6組不同壓力氧暴露下的大鼠肺組織的變化。在實驗設計中，不同的壓力暴露采用了不同的暴露時間，該實驗設計參考了 Demchenko IT等的實驗，他們發(fā)現1 ATA氧氣暴露的半數致死量（LD50）時間為 69 h，1.5 ATA為 24.2 h，2 ATA為 14.2 h，2.5 ATA為 11.2 h，3 ATA為 8.3 h［4］。因此，在本實驗中，我們選擇了達到半數致死量時間的80%作為各個壓力的暴露時間，分別是1 ATA為 56 h、1.5 ATA為 20 h、2 ATA為 10 h、2.5 ATA為8 h、3 ATA為6 h。

Fig.1 Volume changes of the expression of nNOS and eNOS in lung tissue of rats in every group of proteins

本研究結果發(fā)現1.0 ATA氧導致的肺型氧中毒主要表現為肺部組織水腫、支氣管肺泡灌洗液蛋白含量增高。隨著氧分壓的增高，上述改變逐漸減弱。和1.0 ATA組相比較，1.5 ATA以上壓力組的肺水腫、灌洗液中蛋白含量明顯降低，提示常壓氧中毒和高壓氧中毒可能存在不同的發(fā)病機制。這個結果和Demchenko IT等的結果相似［4］，提示隨著氧分壓的增高，炎癥及肺水腫的癥狀逐漸減輕。

實驗結果顯示不同氧氣壓力暴露下nNOS的表達無變化，而eNOS則在2 ATA時明顯下降，2.5 ATA及3 ATA時上調明顯。提示eNOS在高分壓氧導致的肺型氧中毒的發(fā)病機制中起著作用。eNOS是表達在內皮細胞上的NO合成酶，在肺組織中廣泛表達，有文獻證實eNOS在氧中毒發(fā)病中起著重要作用［7］，高壓氧可增加內皮細胞的eNOS活性及NO的釋放［8，9］。Kondrikov等證實肺動脈內皮細胞上eNOS的表達上調可促進高壓氧誘導的過氧亞硝酸鹽的產生，從而導致肺血管床的亞硝酸應激［9］。

結果表明eNOS在2 ATA時下降明顯，而在2.5 ATA及3 ATA時增高。目前認為2 ATA以下的壓力導致的肺型氧中毒的發(fā)病表現類似于常壓氧導致的肺型氧中毒，當壓力超過2 ATA時，肺型氧中毒的發(fā)病特點出現了明顯變化，主要表現為肺部組織出血，而炎癥和滲出不明顯。因此我們認為eNOS上調可能在超過2 ATA以上的氧氣導致的肺型氧中毒中起得作用更大。這需要進一步的實驗進行探討。

總結上述的實驗結果，可以看出在達到半數致死量時間的80%作為各個壓力的暴露時間，相比于nNOS，eNOS在高分壓氧導致的肺型氧中毒中具有重要作用。肺濕干比、支氣管肺泡灌洗液蛋白量隨著氧氣壓力的變化而改變。

［1］ Balentine JD.Pathology of Oxygen Toxicity［M］.New York：Academic Press，1982.

［2］ Wispe JR，Roberts RJ.Molecular basis of pulmonary oxygen toxicity［J］.Clin Perinatol，1987，14（3）：651-666.

［3］ Jamieson D，Chance B，Cadenas E，et al.The relation of free radical production to hyperoxia.［J］.Annu Rev Physiol，1986，48：703-719.

［4］ Demchenko IT，Welty-Wolf KE，Allen BW，et al.Similar but not the same：normobaric and hyperbaric pulmonary oxygen toxicity，the role of nitric oxide［J］.Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol，2007，293（1）：L229-238.

［5］ Demchenko IT，Atochin DN，Gutsaeva DR，et al.Contributions of nitric oxide synthase isoforms to pulmonary oxygen toxicity，local vs.mediated effects［J］.Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol，2008，294（5）：L984-90.

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［8］ Li LF，Liao SK，Lee CH，et al.Involvement of Akt and endothelial nitric oxide synthase in ventilation-induced neutrophil infiltration：a prospective，controlled animal experiment［J］.Crit Care，2007，11（4）：R89.

［9］ Kondrikov D，Elms S，Fulton D，et al.eNOS-beta-actin interaction contributes to increased peroxynitrite formation during hyperoxia in pulmonary artery endothelial cells and mouse lungs［J］.J Biol Chem，2010，285（46）：35479-35487.