邢 茜，陳思宇

（上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院腫瘤科，上海200092）

microRNA與肝癌研究進(jìn)展

邢 茜，陳思宇

（上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院腫瘤科，上海200092）

microRNA；肝癌；表達(dá)上調(diào)；表達(dá)下調(diào)；臨床意義

隨著人類后基因組計劃的進(jìn)一步開展，占人類基因組99%的非編碼序列日益引起科學(xué)家的關(guān)注，其中最引人注目的是microRNA（以下簡稱miRNA）的發(fā)現(xiàn)。miRNA是一類全長為18～25個核苷酸的單鏈小分子RNA，通過與靶標(biāo)基因3'非翻譯區(qū)（3'UTR）結(jié)合在轉(zhuǎn)錄后對靶標(biāo)基因的表達(dá)水平進(jìn)行調(diào)控［1］。

原發(fā)性肝癌的發(fā)病率居全球第5位，原發(fā)性肝癌中有80%～90%是肝細(xì)胞性肝癌（以下簡稱肝癌）［2］。肝癌侵襲力強(qiáng)、死亡率高。早期肝癌手術(shù)切除、肝移植治療后術(shù)后5 a生存率僅為70%。進(jìn)展期肝癌治療手段更為有限，由于已發(fā)生血行轉(zhuǎn)移，多數(shù)患者喪失手術(shù)機(jī)會，而化療作用不大且有藥物毒性，因此早期診斷是肝癌有效治療的關(guān)鍵。

隨著分子技術(shù)的不斷進(jìn)步，有研究［3］利用一些高通量檢測方法分析不同人類腫瘤的miRNA表達(dá)譜，已經(jīng)證實(shí)在乳腺癌、肝癌、肺癌、胃癌、卵巢癌等多種腫瘤中發(fā)現(xiàn)特異性miRNA的差異表達(dá)，腫瘤特異性的miRNA表達(dá)譜揭示miRNA與腫瘤之間存在密切聯(lián)系。miRNA與肝癌的發(fā)生有關(guān)，miRNA的指標(biāo)變化對早期發(fā)現(xiàn)、診斷肝癌和判斷肝癌預(yù)后有著重要意義，同時也為肝癌治療提供新的思路和研究方向。本文就近年關(guān)于miRNA與肝癌的相關(guān)研究進(jìn)展作一綜述。

1 microRNA的發(fā)現(xiàn)

1993年，Lee等［4］在秀麗新小桿線蟲中意外地發(fā)現(xiàn)一種定時調(diào)控胚胎后期發(fā)育的基因Lin-4，其編碼一種小分子RNA，這種小分子RNA通過與靶基因Lin-4的mRNA的3'UTR特定區(qū)域結(jié)合以抑制Lin-4的翻譯。后來這種相似的小分子在線蟲、果蠅、小鼠和人類細(xì)胞中不斷被發(fā)現(xiàn)，并被命名為miRNA，至今已被鑒定出上千種之多。

2 miRNA的合成和生物學(xué)功能

研究［5-8］表明，miRNA基因由RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄成初級轉(zhuǎn)錄物Pri-miRNA，此Pri-miRNA是包含Drosha酶（具有核糖核酸酶Ⅲ活性的酶）的多蛋白復(fù)合物，Pri-miRNA后經(jīng)Drosha酶剪切形成長度約為80 bp的發(fā)卡狀結(jié)構(gòu)的miRNA前體Pre-miRNA，并由Fxportin-5/Ran-GTP轉(zhuǎn)運(yùn)至胞漿，最后在胞漿中Dicer內(nèi)切酶將其加工成長度約為22個堿基的雙鏈RNA，雙鏈中的一條則與一種RNA沉默復(fù)合物（RISC）結(jié)合成RISC-miRNA復(fù)合物，再互補(bǔ)結(jié)合至靶基因mRNA的3'UTR，從而誘導(dǎo)其靶點(diǎn)mRNA的降解或翻譯抑制，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控靶基因的表達(dá)。

3 miRNA與肝癌

3.1 miRNA與腫瘤發(fā)生miRNA參與生命過程中一系列的重要進(jìn)程，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、凋亡、轉(zhuǎn)移有密切的關(guān)系。乳腺癌、卵巢癌、胃癌、肺癌中均有miRNA的異常表達(dá)。目前認(rèn)為，miRNA在腫瘤發(fā)生中的作用主要在于3個方面：1）有些miRNA在正常組織表達(dá)下調(diào)，在腫瘤組織表達(dá)上調(diào)，可能起著癌性miRNA的作用；2）有些miRNA則在正常組織表達(dá)上調(diào)，在腫瘤組織表達(dá)下調(diào)，可能起著抑癌性miRNA的作用；3）一些致癌病毒編碼的miRNA也可能參與相關(guān)腫瘤的發(fā)生。

3.2 miRNA與肝癌的關(guān)系miRNA在肝癌發(fā)生過程中，既可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡或細(xì)胞周期，也可經(jīng)調(diào)節(jié)癌基因或抑癌基因參與腫瘤發(fā)生途徑，其作用具有網(wǎng)絡(luò)化、雙向性及組織特異性的特點(diǎn)，從而調(diào)控肝癌細(xì)胞的增殖凋亡、血管生成、細(xì)胞轉(zhuǎn)移和耐藥性等。

3.2.1 在肝癌中表達(dá)上調(diào)的miRNA 1）miRNA-21：miRNA-21是目前研究最多的miRNA之一，參與多種腫瘤的發(fā)生和一系列病理生理改變，與肝臟再生、肝細(xì)胞代謝、肝臟免疫反應(yīng)及肝癌發(fā)生和發(fā)展有著密切聯(lián)系。miRNA-21在肝癌組織中的表達(dá)約為正常肝組織中相對表達(dá)量的10倍，目前關(guān)于其調(diào)控肝癌細(xì)胞的機(jī)制有以下3種研究結(jié)論：基因PTFN是一種抑癌基因，其表達(dá)增加可減少腫瘤細(xì)胞的增生、遷移和侵襲。然而miRNA-21通過作用于PTFN激活RTKS、P13K，進(jìn)而激活A(yù)KT路徑，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長增殖，增加其侵襲力［9］。RHOB基因已知具有腫瘤抑制作用，肝癌細(xì)胞中的miRNA-21，通過直接靶向RHOB的3'URT壓制RHOB表達(dá)從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖［10］。此外，在肝癌細(xì)胞中，miRNA-21主要通過影響一些信號通路中的分子，如基質(zhì)金屬蛋白酶-2（MMP-2）和MMP-9來抑制其靶基因細(xì)胞凋亡基因（PDCD）的mRNA和蛋白水平，從而抑制肝癌細(xì)胞凋亡［11］，越來越多的研究表明miRNA-21-PDCD環(huán)路異常在肝癌發(fā)生中具有重要的作用，相信關(guān)于miRNA-21-PDCD環(huán)路作為肝癌治療靶點(diǎn)的可能性會備受關(guān)注；2）miRNA-221：miRNA-221與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)，其在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、前列腺癌等多種腫瘤中表達(dá)異常，高表達(dá)miRNA-221的腫瘤進(jìn)展快、存活率差、復(fù)發(fā)率高。諸多研究［12-14］表明miRNA-22l在肝癌組織中高表達(dá)。近年來很多學(xué)者進(jìn)行關(guān)于miRNA-221致癌機(jī)制的研究：Gramantieri等［12］在體外將肝癌細(xì)胞株分為miRNA-221轉(zhuǎn)染及抑制組，通過熒光素酶基因檢測法發(fā)現(xiàn)miRNA-221抑制組可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，Bmf基因具有促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)miRNA-221正是通過與Bmf基因mRNA的3'UTR結(jié)合抑制其表達(dá)從而促進(jìn)肝癌的發(fā)生、發(fā)展。亦有研究［13-14］闡述其作用機(jī)制可能為高表達(dá)miRNA-221抑制細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑P27、P57的表達(dá)從而調(diào)控細(xì)胞周期促進(jìn)細(xì)胞增殖。2010年P(guān)ineau等［15］利用肝癌小鼠模型，發(fā)現(xiàn)miRNA-221的過表達(dá)刺激致瘤小鼠的肝祖細(xì)胞的生長。同時確定miRNA-221的作用靶點(diǎn)為mTOR通路的調(diào)節(jié)劑：DNA損傷誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子4（DDIT4）。因此，使用miRNA-221合成的抑制劑可能是一種很有前途的肝癌治療方法。在去年Yuan等［16］應(yīng)用2/3手術(shù)誘導(dǎo)部分肝切除的肝再生模型中，證實(shí)過表達(dá)的miRNA-221加速小鼠體內(nèi)肝細(xì)胞增殖。miRNA-221過表達(dá)導(dǎo)致肝細(xì)胞迅速進(jìn)入S期從而實(shí)現(xiàn)肝再生。芳香烴核易位（ARNT）信使RNA是miRNA-221的一個作用靶點(diǎn)，與miRNA-221的促細(xì)胞增殖活性有關(guān)。因此，miRNA-221過表達(dá)促進(jìn)肝細(xì)胞增殖，作用于miRNA-221的藥物可通過防止細(xì)胞凋亡、誘導(dǎo)肝臟再生來治療肝衰竭；3）miRNA-224：miRNA-224是一個新近被提出的在肝癌組織中表達(dá)上調(diào)的小分子 RNA。2008年，Wang等［17］在19例肝癌患者中進(jìn)行miRNA表達(dá)譜檢測，發(fā)現(xiàn)miRNA-224在肝癌患者中有顯著上調(diào)，還發(fā)現(xiàn)miRNA-224通過抑制ALP-5基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)以增加肝癌細(xì)胞的增殖。2012年Scisciani等［18］通過RT-PCR方法和芯片檢測發(fā)現(xiàn)p65/NFκB蛋白復(fù)合物是miR-224表達(dá)的直接轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，并與miRNA-224在肝癌中上調(diào)有關(guān)；4）miRNA-10：Yan等［19］從細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)miRNA-10a在肝癌中表達(dá)上調(diào)，并促進(jìn)肝癌細(xì)胞的體外遷移和侵襲，厄酪氨酸激酶受體FphA4被認(rèn)定為miRNA-10a的靶基因，F(xiàn)phA4通過調(diào)控上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程和β1整合素通路影響細(xì)胞浸潤和粘連。miRNA-10b最近報道在肝癌中表達(dá)上調(diào)，其上調(diào)與肝癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)。研究［20］結(jié)果證實(shí)，CADM1受miRNA-10b的過表達(dá)抑制，而CADM1的沉默導(dǎo)致細(xì)胞運(yùn)動性和侵襲顯著增加。這些結(jié)果表明miRNA-10b可通過積極地靶向CADM1來調(diào)節(jié)肝癌的侵襲和轉(zhuǎn)移。

3.2.2 在肝癌中表達(dá)下調(diào)的miRNA 1）miRNA-122：miRNA-122只在肝細(xì)胞中表達(dá)，約占肝細(xì)胞總miRNA量的70%，每個細(xì)胞內(nèi)約有50 000個拷貝，不僅參與肝臟分化的調(diào)節(jié)，還參與維持肝臟正常功能，是一種調(diào)節(jié)肝臟發(fā)育的肝特異性miRNA，所以關(guān)于miRNA-122的研究也逐漸成為熱點(diǎn)［21］。Gramantieri等［22］利用含有381個人類miRNA探針的基因芯片檢測17例原發(fā)性肝癌組織及21例肝硬化組織內(nèi)miRNA的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)miRNA-122a表達(dá)下調(diào)，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)cyclin G1的mRNA為其作用靶點(diǎn)之一。miRNA-122a可能是通過抑制cyclin G1的表達(dá)達(dá)到維持染色體穩(wěn)定、抑制細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用，在肝癌發(fā)生發(fā)展中扮演著腫瘤抑制物的角色［23］。近年來，大量研究［24-26］發(fā)現(xiàn)miRNA-122在肝癌組織中表達(dá)下調(diào)，并通過負(fù)反饋?zhàn)饔糜诳沟蛲龌駼cl-w家族和促進(jìn)血管增生、細(xì)胞轉(zhuǎn)移的ADAM-1基因，正反饋?zhàn)饔糜诖龠M(jìn)細(xì)胞凋亡的Wnt-1信號通路從而調(diào)節(jié)肝癌細(xì)胞的血管生成、細(xì)胞凋亡和轉(zhuǎn)移；2）miRNA-199：miRNA-199在肝癌和其他惡性腫瘤組織中均有許多表達(dá)下調(diào)的報道。Fornari等［27］將39例肝癌標(biāo)本及10例正常肝組織標(biāo)本篩選后，發(fā)現(xiàn)miRNA-199轉(zhuǎn)染組可以使細(xì)胞周期阻滯于G1期，減少肝癌細(xì)胞侵襲力，提高肝癌細(xì)胞對缺氧誘導(dǎo)凋亡及阿霉素的敏感性，并最終證實(shí)mTOR和C-Met基因均為其作用靶點(diǎn)。mTOR基因在細(xì)胞生長、侵襲、凋亡及蛋白翻譯、代謝等過程中起著重要作用，抑制其表達(dá)可以使細(xì)胞周期阻滯于G1期，從而促發(fā)細(xì)胞凋亡。C-Met基因有促進(jìn)新生血管形成和內(nèi)皮細(xì)胞運(yùn)動、保護(hù)細(xì)胞免受各種誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡因子影響的作用。miRNA-199正是通過抑制上述2種基因的表達(dá)從而促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡、減少其侵襲力，增加其對誘導(dǎo)因素的敏感性。同時miRNA-199可抑制PAK4從而抑制癌細(xì)胞的增殖，PAK蛋白是的Rho GTP酶對細(xì)胞骨架重組和核信號的關(guān)鍵激酶，能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖［28］。此外，caveolin-2是參與重要的細(xì)胞功能，包括信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、脂質(zhì)代謝、細(xì)胞的生長控制和凋亡的一種蛋白質(zhì)，最近幾年，以caveolin-2為靶點(diǎn)來進(jìn)行腫瘤抑制已經(jīng)成為研究熱門，研究［29］表明miRNA-199在肝癌細(xì)胞中通過抑制蛋白caveolin-2的功能以抑制腫瘤細(xì)胞增殖分化。盤狀結(jié)構(gòu)域受體1（DDR1）參與細(xì)胞侵襲相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，研究［30］表明miRNA-199抑制DDR1從而抑制肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移。目前晚期肝癌順鉑化療患者由于耐藥性問題在臨床治療中療效欠佳，研究［31］表明順鉑肝癌化療中miRNA-199表達(dá)下調(diào)，促進(jìn)自噬基因ATG7表達(dá)的自噬活動，這一研究為解決順鉑化療的耐藥性問題提出新的解決途徑；3）miRNA-101：Su等［32］利用含有308個人類miRNA的芯片，分析肝癌細(xì)胞株、手術(shù)切除肝癌組織和正常肝細(xì)胞中miRNA的表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)miRNA-101明顯下調(diào)，達(dá)94. 1%，轉(zhuǎn)染miRNA-101組腫瘤細(xì)胞在體外克隆和體內(nèi)生長均受抑制，并且轉(zhuǎn)染組腫瘤細(xì)胞對饑餓及化療藥物更加敏感。進(jìn)一步試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)miRNA-101的靶基因?yàn)镸cL-1，McL-1是Bcl-2家族中的一種抗細(xì)胞凋亡基因，其主要致癌機(jī)制是保護(hù)細(xì)胞免受各種刺激細(xì)胞凋亡的因素的影響，降低其表達(dá)可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。miRNA-101通過與McL-1的3'UTR結(jié)合抑制其表達(dá)，進(jìn)而抑制肝癌的發(fā)生及發(fā)展。Zhang等［33］研究發(fā)現(xiàn)miRNA-101的靶基因?yàn)镾OX-9基因，SOX-9基因?qū)儆赪nt/β-catenin信號通路負(fù)性調(diào)控因子SOX家族，miRNA-101通過抑制SOX-9基因表達(dá)，促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡；4）miRNA-214：Shih等［34］的研究表明miRNA-214的下調(diào)，活化肝癌衍生生長因子HDGF旁分泌途徑，有助于腫瘤血管生成，從而導(dǎo)致肝癌的血管增生。同年，Wang等［35］證實(shí)miRNA-214在肝癌細(xì)胞標(biāo)本表達(dá)下調(diào)，進(jìn)一步的研究揭示miRNA-214可以直接靶向3'-UTR的β-連環(huán)蛋白的mRNA，抑制其蛋白質(zhì)的表達(dá)，β-連環(huán)蛋白表達(dá)下調(diào)抑制細(xì)胞生長，這些發(fā)現(xiàn)表明miRNA-214可作為腫瘤抑制物，通過抑制β-連環(huán)蛋白來抑制肝癌發(fā)生。鑒于這些，miRNA-214可以作為肝癌治療的靶標(biāo)。

3.2.3 miRNA與HBV相關(guān)性肝癌 miRNA-602是與HBV相關(guān)性肝癌關(guān)系密切的一種miRNA。我國是“乙肝大國”，與HBV感染相關(guān)的原發(fā)性肝癌愈發(fā)被重視，越來越多的學(xué)者開展miRNA與HBV相關(guān)性肝癌的研究，Yang等［36］分別檢測慢性乙型肝炎肝組織、乙肝病毒陽性肝硬化組織、乙肝病毒陽性肝癌組織及正常肝組織的miRNA，發(fā)現(xiàn)miRNA-602在3種異常肝組織中的表達(dá)明顯高于正常肝臟組織。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-602的靶基因?yàn)槟[瘤抑制基因RASSFlA，表達(dá)上調(diào)的miRNA-602抑制RASSFlA的表達(dá)。研究［37］指出miRNA-602在HBV感染早期階段即過度表達(dá)，并通過抑制抑癌基因RASSFlA的表達(dá)以介導(dǎo)慢性乙型肝炎發(fā)展到HBV相關(guān)性肝癌的這一過程。他們還發(fā)現(xiàn)，miRNA-602定位于9q34.3，是常見乙肝病毒基因整合位點(diǎn)，推測乙肝病毒在該區(qū)域的插入是導(dǎo)致miRNA-602過度上調(diào)表達(dá)的原因。miRNA-602可能作為HBV相關(guān)性肝癌的早期檢測物，在癌變前的肝炎、肝硬化階段作為治療靶點(diǎn)。

3.3 miRNA在肝癌中的臨床意義

3.3.1 miRNA作為腫瘤標(biāo)志物 miRNA可作為輔助肝癌診斷和評估肝癌預(yù)后的腫瘤標(biāo)志物，如前文，下調(diào)的miRNA-122、miRNA-199、miRNA-101、miRNA-214，與腫瘤侵襲、復(fù)發(fā)的風(fēng)險增高有關(guān)，同樣，上調(diào)的miRNA-21、miRNA-221、miRNA-224，miRNA-10亦與預(yù)后不良有關(guān)。研究［38］表明，血漿或血清中的miRNA并不被RNA酶裂解，因此通過外周血檢測miRNA，可以用于惡性腫瘤的篩查和診斷，且外周血樣本來源比活檢標(biāo)本簡便，操作易行，傷害輕，對于腫瘤的早期發(fā)現(xiàn)具有重要意義，外周血檢測miRNA對肝癌等血運(yùn)豐富器官的惡性腫瘤更有意義。研究發(fā)現(xiàn)超過20種血漿或血清中的miRNA檢測與肝癌相關(guān)聯(lián)。此外，Zhou等［39］的研究證明miRNA-122、miRNA-192、miRNA-21、miRNA-223、miRNA-26a、miRNA-27a和 miRNA-801a對檢測早期肝癌精確度較高。當(dāng)然外周血檢測到的miRNA相對于組織仍具有一定局限性，包括血清中的miRNA并不能完全直接反映組織中miRNA的表達(dá)水平；血清中miRNA含量較少，更適于研究高表達(dá)的miRNA而非低表達(dá)的miRNA等。對此仍需要進(jìn)一步的研究和驗(yàn)證，提高檢測方法的靈敏性和特異性。

3.3.2 miRNA作為治療靶點(diǎn) miRNA不僅有利于肝癌的診斷，對靶向治療和基因治療等也具有提示作用。目前研究miRNA用于腫瘤的治療主要為2種思路：1）促進(jìn)或補(bǔ)充在腫瘤組織中異常低表達(dá)的抑癌性miRNA（補(bǔ)充替代療法），或抑制該腫瘤miRNA的癌性靶基因以減緩腫瘤發(fā)展，延長生存期。前者（miRNA-26a［40］、miRNA-122［41］、miRNA-124［42］）在小鼠肝癌模型中被證實(shí)有效，但這種假設(shè)尚未在肝癌患者中進(jìn)行測試；2）抑制腫瘤中異常高表達(dá)的癌性miRNA，通過應(yīng)用反義寡核苷酸技術(shù)沉默腫瘤組織中高表達(dá)的miRNA，進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞生長和或轉(zhuǎn)移，有研究［43］設(shè)計出取自寡核苷酸序列的小分子，作用于miRNA-96發(fā)夾前體并抑制其生物合成，從而抑制其表達(dá)，誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡。目前反義寡核苷酸技術(shù)在體內(nèi)如何發(fā)揮效應(yīng)最為關(guān)鍵，還需要進(jìn)一步的研究。

4 小結(jié)與展望

肝癌是侵襲力強(qiáng)、死亡率高的惡性腫瘤。其早期診斷困難，治療手段有限，總體預(yù)后較差，嚴(yán)重危害人民健康。miRNA作為一類新的分子靶標(biāo)，自發(fā)現(xiàn)之日便一直是科學(xué)研究的熱點(diǎn)所在，其在很多惡性腫瘤中的作用得到證實(shí)，也有越來越多的miRNA被應(yīng)用于腫瘤的診斷、治療及預(yù)后判斷等。許多相關(guān)的科學(xué)研究都為miRNA應(yīng)用于肝癌的基因診斷、治療及預(yù)后判斷提供良好的依據(jù)，具有廣闊的前景。但目前miRNA與肝癌關(guān)系的研究仍處于起步階段，很多機(jī)制仍無法闡述，在臨床的應(yīng)用仍需更進(jìn)一步的探索和更多證據(jù)的支持。

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10.3969/j.issn.1673-5412.2014.05.036

R735.7；R730.23

A

1673-5412（2014）05-0447-05

2014-03-26）

邢茜（1991-），女，碩士在讀，主要從事腫瘤內(nèi)科臨床及相關(guān)科研工作。F-mail：754968890@sjtu.edu.cn

陳思宇（1975-），女，博士，副主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，主要從事腫瘤內(nèi)科臨床及相關(guān)科研工作。F-mail：chensiyu@ 126.com