梁 珂，楊 東，歐陽(yáng)駿

膀胱癌占全部惡性腫瘤的1%～2%，在國(guó)內(nèi)其發(fā)病率和死亡率均居泌尿系腫瘤首位。世界范圍內(nèi)，膀胱癌位列男性最常見(jiàn)實(shí)體瘤的第4位，在女性列第7位，每年新診斷的膀胱癌患者超過(guò)35萬(wàn)例[1]。膀胱癌初次診斷時(shí)有70%～80%為非肌層浸潤(rùn)性的，另20%～30%為肌層浸潤(rùn)性的。50%～70%的非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌治療后5年內(nèi)復(fù)發(fā)，10%～30%會(huì)進(jìn)展為肌層浸潤(rùn)性膀胱癌[2]。放化療雖可減輕患者癥狀，對(duì)膀胱癌有一定療效，但不良反應(yīng)較嚴(yán)重，且不能實(shí)際延長(zhǎng)患者的生存期。因此，尋找敏感性及特異性高的膀胱癌標(biāo)志物，發(fā)展以疾病相關(guān)生物學(xué)基礎(chǔ)的靶向治療已成為當(dāng)下的研究熱點(diǎn)。目前已有大量研究證實(shí)miRNA的異常表達(dá)與膀胱癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，有可能成為膀胱癌治療的重要靶點(diǎn)。本文就膀胱癌的靶向治療與miRNA表達(dá)異常的研究進(jìn)展做一綜述。

1 miRNA的分子機(jī)制

miRNA屬于內(nèi)源性非編碼單鏈小RNA，由19～25個(gè)核苷酸(nucleotide)組成。一個(gè)miRNA通常靶向一個(gè)或者多個(gè)信使RNA(mRNA)，通過(guò)與靶mRNA特異的堿基配對(duì)引起靶mRNA的降解或翻譯抑制，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)，從而調(diào)控細(xì)胞分化、生長(zhǎng)、增殖、代謝和凋亡等。miRNA與其靶分子組成了一個(gè)復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，控制細(xì)胞及個(gè)體的重要生命活動(dòng)。正常組織中，miRNA轉(zhuǎn)錄、加工，與mRNA特異結(jié)合，通過(guò)抑制翻譯或使mRNA降解而調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。如miRNA與其相應(yīng)的靶mRNA以完全互補(bǔ)的方式結(jié)合在開(kāi)放閱讀框，mRNA將發(fā)生特異性降解；如miRNA以部分互補(bǔ)的方式結(jié)合在mRNA的3′端非翻譯區(qū)(3′UTR)，則僅僅抑制其翻譯，不影響mRNA的穩(wěn)定性。miRNA的5′端有2～8個(gè)核苷酸區(qū)被稱為“種子區(qū)”，對(duì)miRNA與mRNA的3′UTR的配對(duì)非常重要。miRNA種子區(qū)通常和相應(yīng)的靶序列完全配對(duì)，因此可以用種子區(qū)序列預(yù)測(cè)miRNA的靶基因[3]。一種miRNA可作用于多種mRNA靶點(diǎn)，多個(gè)miRNA也可協(xié)同調(diào)控同一個(gè)mRNA分子。mRNA的3′UTR可以包含多個(gè)miRNA的作用位點(diǎn)，并且與抑制翻譯的程度有關(guān)，miRNA結(jié)合的位點(diǎn)越多，抑制的程度就越大。miRNA是細(xì)胞生長(zhǎng)和發(fā)育過(guò)程的調(diào)節(jié)中起多重作用，是若干細(xì)胞進(jìn)程的重要調(diào)節(jié)因子，一旦miRNA的表達(dá)水平失衡，將可能導(dǎo)致疾病的發(fā)生。

2 膀胱癌的靶向治療現(xiàn)狀

膀胱腫瘤發(fā)生過(guò)程中信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是很復(fù)雜的，通路之間也有交叉，單一阻斷某一靶點(diǎn)顯然不能對(duì)所有膀胱癌患者達(dá)到治療目的。但隨著蛋白組學(xué)和藥物基因組學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，對(duì)導(dǎo)致膀胱癌形成的具體信號(hào)通路有了更深入的認(rèn)識(shí)，從而為選擇患者進(jìn)行個(gè)體化靶向治療提供了依據(jù)。目前開(kāi)展的膀胱癌分子靶向治療主要有：(1)表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的靶向治療[4-5]，如抗EGFR的單克隆抗體曲妥珠單抗和西妥昔單抗；EGFR小分子酪氨酸激酶抑制劑埃羅替尼和拉帕替尼等。(2)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)通路的靶向治療[6-7]，如抗VEGF的單克隆抗體貝伐單抗；VEGF小分子酪氨酸激酶抑制劑舒尼替尼和索拉菲尼等[8-9]。(3)P53、Bcl-2、Rb、PIK-3等基因的靶向治療。(4)miRNA在靶向治療中的應(yīng)用。其中，miRNA的靶向治療被看做是膀胱癌最有前景的治療方法之一。由于一些miRNA具有重要的抑癌基因的功能，設(shè)計(jì)基因療法阻斷癌細(xì)胞生長(zhǎng)和生成有很大前景；另外一些具有癌基因功能的miRNA也可以充分利用，在確定致癌性miRNA序列后，設(shè)計(jì)合成互補(bǔ)的反義寡聚核苷酸使得miRNA失活，從而可有效的延緩癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。

3 膀胱癌與miRNA表達(dá)異常

目前人類基因組中已經(jīng)鑒定的miRNA有721個(gè)，研究發(fā)現(xiàn)約50%得到注解的miRNA在基因組上定位于腫瘤發(fā)生相關(guān)區(qū)域和脆性位點(diǎn)，這說(shuō)明miRNA在腫瘤發(fā)生過(guò)程中起至關(guān)重要的作用，類似于抑癌基因或癌基因的功能。研究者通過(guò)寡核苷酸RNA微點(diǎn)陣分析、磁珠流式細(xì)胞計(jì)數(shù)、實(shí)時(shí)定量PCR等方法對(duì)人類腫瘤中的miRNA進(jìn)行了表達(dá)譜鑒定和功能分析，發(fā)現(xiàn)一些miRNA與腫瘤的診斷、分期、進(jìn)展、預(yù)后及對(duì)治療的反應(yīng)性均有關(guān)。Lu等[10]對(duì)334例腫瘤及正常組織的miRNA的表達(dá)譜進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)不同類型的腫瘤、正常組織、以及分化水平相同的細(xì)胞均具有不同的miRNA表達(dá)譜。通過(guò)對(duì)肺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、前列腺癌、甲狀腺癌、膀胱癌及胰腺癌等組織中miRNA譜與正常組織譜的對(duì)比分析，發(fā)現(xiàn)各種腫瘤具有各自的特征性miRNA。miRNA在膀胱癌中表達(dá)異常的原因分析如下：(1)染色體異常，比如染色體重組、擴(kuò)增、缺失、插入突變等除了會(huì)改變蛋白質(zhì)的編碼基因外，也會(huì)改變編碼miRNA的基因。(2)表觀遺傳學(xué)修飾，表觀遺傳學(xué)修飾在膀胱癌的發(fā)生和惡化中有著顯著的影響，有3種表觀遺傳學(xué)活動(dòng)調(diào)控腫瘤相關(guān)基因，即：腫瘤抑制基因的異常過(guò)度甲基化，DNA整體水平的低甲基化和組蛋白的翻譯后修飾。(3)miRNA基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，轉(zhuǎn)錄水平是調(diào)控miRNA生物合成和很多作用因子的主要控制階段。

4 膀胱癌中具有抑癌基因作用的miRNA

抑癌基因是一類調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)，抑制腫瘤表型表達(dá)的基因，編碼對(duì)腫瘤形成起抑制作用的蛋白質(zhì)。正常情況下負(fù)責(zé)控制細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖，而當(dāng)這些基因不能表達(dá)，或者當(dāng)其產(chǎn)物失去活性時(shí)，可以導(dǎo)致癌變?，F(xiàn)就膀胱癌中具有抑癌基因作用的miRNA介紹如下。

4.1 miR-23b Majid等[11]發(fā)現(xiàn)miR-23b在膀胱癌的細(xì)胞株中比在非惡性細(xì)胞和正常組織中顯著下調(diào)。Kaplan-Meier分析揭示膀胱癌患者的miR-23b高表達(dá)組具有較高的整體生存期。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，膀胱癌患者miR-23b的高表達(dá)可抑制細(xì)胞增殖，破壞集落形成。熒光激活細(xì)胞分選(FACS)揭示miR-23b的表達(dá)通過(guò)誘導(dǎo)G0/G1期細(xì)胞周期阻滯和凋亡而抑制細(xì)胞遷移和侵襲。熒光素酶分析表明E盒結(jié)合鋅指蛋白1(zinc finger E-box binding homeobox 1, Zeb1)是miR-23b在膀胱癌中的作用靶點(diǎn)，Zeb1可調(diào)節(jié)上皮組織向間質(zhì)轉(zhuǎn)化。miR-23b下調(diào)會(huì)促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞的遷移和侵襲，增強(qiáng)miR-23b的表達(dá)將是膀胱癌的可能治療策略。

4.2 miR-409-3p/miRNA-101 越來(lái)越多的證據(jù)表明某些miRNA的失調(diào)有助于腫瘤的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移，Xu等[12]研究發(fā)現(xiàn)miR-409-3p在膀胱癌組織和細(xì)胞系中明顯下調(diào)，miR-409-3p在膀胱癌細(xì)胞中表達(dá)增強(qiáng)能顯著減少膀胱癌的轉(zhuǎn)移和侵襲，但不影響細(xì)胞的活力，生物信息學(xué)分析確定親轉(zhuǎn)移基因c-Met是miR-409-3p在膀胱癌組織中的潛在靶標(biāo)，miR-409-3p通過(guò)與c-Met的3`端非翻譯區(qū)結(jié)合抑制其表達(dá)，靜止的c-Met通過(guò)小干擾RNA改變miR-409-3p過(guò)度表達(dá)的影響，c-Met在膀胱癌細(xì)胞中的恢復(fù)能部分扭轉(zhuǎn)miR-409-3p的抑制，研究還揭示基質(zhì)金屬蛋白酶2(matrix metalloproteinase-2,MMP-2)和MMP-9可能是miR-409-3p下游的效應(yīng)蛋白，這些發(fā)現(xiàn)表明miR-409-3p可能是膀胱癌的抑制基因。Hu等[13]發(fā)現(xiàn)miRNA-101也是以c-Met為靶標(biāo)，通過(guò)與其3`端非翻譯區(qū)結(jié)合發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，miRNA-101的高表達(dá)會(huì)降低c-Met在mRNA和蛋白水平的表達(dá)，最終抑制T24細(xì)胞以c-Met依賴方式進(jìn)行遷移和侵襲，該研究還表明，miRNA-101是新的膀胱癌抑癌基因，通過(guò)負(fù)調(diào)控c-Met抑制T24細(xì)胞的遷移和侵襲發(fā)揮作用。

4.3 miRNA-100 Xu等[14]應(yīng)用基因芯片的miRNA陣列檢測(cè)10對(duì)膀胱癌組織的miRNA表達(dá)譜，證實(shí)了10個(gè)差異表達(dá)的miRNA發(fā)生在任何階段的膀胱癌組織和癌旁組織。實(shí)時(shí)定量PCR進(jìn)行67對(duì)膀胱癌組織和10種膀胱癌細(xì)胞株的擴(kuò)大隊(duì)列驗(yàn)證后，發(fā)現(xiàn)miR-100在癌組織中下調(diào)最顯著。異位修復(fù)膀胱癌細(xì)胞中miR-100的表達(dá)抑制細(xì)胞增殖和遷移，在體外誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯，在體內(nèi)抑制膀胱癌的發(fā)生。生物信息學(xué)分析表明，mTOR基因是miR-100的靶標(biāo)。在癌轉(zhuǎn)移的裸鼠模型實(shí)驗(yàn)揭示miR-100/mTOR調(diào)節(jié)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)，并與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)聯(lián)。mTOR和p70S6K(下游信使)在原發(fā)腫瘤的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移灶(如肝臟和腎臟轉(zhuǎn)移)出現(xiàn)較高的表達(dá)水平比。因此，miR-100可作為膀胱癌的一種腫瘤抑制基因，通過(guò)降低靶基因的表達(dá)將成熟的miRNA引入到腫瘤組織中被證明是一種治療策略。

4.4 其他具有抑癌基因作用的miRNA Zaravinos等[15]對(duì)77例膀胱癌組織和77個(gè)正常樣本進(jìn)行實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，分析1組參與膀胱癌血管生成、腫瘤細(xì)胞增殖、抑癌基因抑制、上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)移激活的miRNA表達(dá)譜，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-10b，19a，126，145，221，296-5p和378在膀胱癌組織中明顯下調(diào)，miR-145是本組下調(diào)最突出的microRNA。多因素分析表明，miR-378可作為對(duì)患者的整體生存的獨(dú)立預(yù)后因素。miR-145，221，296-5p和378組合表現(xiàn)出最好的ROC曲線的特異性和敏感性。這些miRNA可能會(huì)作為未來(lái)膀胱癌診斷、治療和預(yù)后的候選生物標(biāo)志物。Chen等[16]研究認(rèn)為miR-449a是人類膀胱癌的腫瘤抑制劑，miR-449a能夠抑制膀胱癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和誘導(dǎo)T24和5637人膀胱癌細(xì)胞在G1期阻滯。T24腫瘤異種移植的增長(zhǎng)能被外源性miR-449a抑制，使用miR-449a治療的腫瘤核增殖抗原Ki-67的表達(dá)下調(diào)。Ichimi等[17]通過(guò)轉(zhuǎn)染了miRNA-30a-3p/miRNA133a/miRNA-199a的膀胱癌細(xì)胞株，發(fā)現(xiàn)KRT7角蛋白的表達(dá)減少，進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。Huang等[18]發(fā)現(xiàn)，miRNA-125b通過(guò)減少細(xì)胞周期中轉(zhuǎn)錄因子E2F3蛋白的表達(dá)，抑制E2F3-cyclinA2信號(hào)途徑，使膀胱腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)在G1期發(fā)生停滯。Bo等[19]首次證實(shí)在膀胱癌組織中miRNA-203表達(dá)降低，miRNA-203在膀胱癌細(xì)胞株中的高表達(dá)將抑制細(xì)胞的增殖，進(jìn)一步研究揭示miRNA-203可能通過(guò)抑制Bcl-w基因的表達(dá)來(lái)發(fā)揮其抑癌基因的作用。

5 膀胱癌中具有癌基因作用的miRNA

癌基因是一類會(huì)引起細(xì)胞癌變的基因，癌基因編碼的產(chǎn)物與細(xì)胞的腫瘤性轉(zhuǎn)化有關(guān)。miRNA既可以作為腫瘤抑制基因也可以作為癌基因參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。研究發(fā)現(xiàn)，在膀胱癌組織中部分類型的miRNA的高表達(dá)會(huì)促使正常細(xì)胞發(fā)生癌變?，F(xiàn)就膀胱癌中具有癌基因作用的miRNA介紹如下。

5.1 miR-205 上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)在腫瘤轉(zhuǎn)移中起著重要的作用，EMT的典型特征是上皮標(biāo)記上皮型E-鈣粘蛋白(E-Cadherin,E-cad)的缺失和EMT相關(guān)的轉(zhuǎn)錄抑制因子Zeb1和Zeb2的表達(dá)增加。miR-200家族和miR-205通過(guò)抑制Zeb1/2阻止EMT發(fā)生。p53基因與miR-200C的調(diào)控有關(guān)，P53家族和P63亞型ΔNp63α促進(jìn)miR-205的轉(zhuǎn)錄和控制人類膀胱癌細(xì)胞EMT發(fā)生。在膀胱癌上皮細(xì)胞系UM-UC6中敲除ΔNp63α能降低miR-205的表達(dá)和誘導(dǎo)表達(dá)Zeb1/2，外源性miR-205的表達(dá)能逆轉(zhuǎn)該效應(yīng)。反知，ΔNp63α在“間質(zhì)性”膀胱癌UM-UC3細(xì)胞系過(guò)度表達(dá)會(huì)誘導(dǎo)miR-205，抑制Zeb1/2。抑制ΔNp63α?xí){(diào)低miR-205和miR-205的“主機(jī)”(miR-205HG)基因的表達(dá)，減少RNA聚合酶Ⅱ和miR-205HG啟動(dòng)子的結(jié)合，抑制miR-205HG的轉(zhuǎn)錄。Tran等[20]的研究數(shù)據(jù)表明，ΔNp63α介導(dǎo)的miR-205表達(dá)調(diào)控膀胱癌細(xì)胞的EMT，miR-205為人類膀胱癌的分子標(biāo)志物，miR-205的高表達(dá)預(yù)示著膀胱癌患者的臨床預(yù)后不佳。

5.2 miR-708 Song等[21]用實(shí)時(shí)定量PCR分析了miR-708在膀胱癌組織和鄰近的正常組織的表達(dá)水平，用流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞的凋亡情況，使用裸鼠為模型對(duì)致瘤細(xì)胞進(jìn)行評(píng)估，用熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)進(jìn)行識(shí)別miR-708和Caspase-2的mRNA的3′UTR之間的相互作用，用免疫印跡檢測(cè)Caspase-2的蛋白水平。結(jié)果顯示，miR-708在人類的膀胱癌組織中經(jīng)常失控，沉默miR-708能夠促進(jìn)T24和5637細(xì)胞凋亡和抑制膀胱腫瘤在體內(nèi)生長(zhǎng)，Caspase-2是miR-708在T24和5637細(xì)胞中作用靶點(diǎn)，并參與miR-708調(diào)控細(xì)胞凋亡。這些結(jié)果表明，miR-708是一種致癌基因，并通過(guò)下調(diào)Caspase-2的水平誘發(fā)膀胱癌的致癌性。

5.3 miR-182-5p Hirata等[22]通過(guò)在膀胱癌組織中過(guò)度表達(dá)miR-182-5P發(fā)現(xiàn)膀胱癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力增加，細(xì)胞凋亡被抑制，并證實(shí)Smad4(drosophila mothers against decapentaplegic protein)和RECK(reversion-inducing-cysteine-rich protein with kazal motifs)是miR-182-5p的潛在靶基因，在miR-182--5p的抑制劑轉(zhuǎn)染的膀胱癌細(xì)胞中靶基因的3′UTR熒光素酶活性顯著下降，靶基因的蛋白表達(dá)顯著上調(diào)。miR-182-5P增加核β-catenin的表達(dá)，而Smad4抑制核β-catenin的表達(dá)。該研究發(fā)現(xiàn)miR-182-5p在膀胱癌的表達(dá)顯著高于正常組織，高miR-182-5p表達(dá)的患者總生存期較短，miR-182-5p是膀胱癌的一種重要致癌基因，通過(guò)下調(diào)RECK和Smad4基因，激活膀胱癌中的Wnt-β-catenin信號(hào)通路發(fā)揮作用。

6 展望

隨著后基因組時(shí)代的來(lái)臨，探索非編碼序列的生物學(xué)意義日益凸顯，miRNA在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用更是當(dāng)前生命科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。目前研究已證實(shí)，miRNA在膀胱癌細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲、腫瘤血管形成或上皮向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化等過(guò)程中都發(fā)揮著重要的作用。miRNA通過(guò)表達(dá)上調(diào)或下調(diào)，發(fā)揮抑癌基因或癌基因的作用，雖然目前關(guān)于miRNA和膀胱癌的研究尚處于起步階段，但是miRNA的這種靶向調(diào)節(jié)作用為膀胱癌的分子診斷和靶向治療提供了新的切入點(diǎn)。針對(duì)靶向細(xì)胞或組織特異性較強(qiáng)的小分子物質(zhì)如miRNA的寡核苷酸及其類似物或激動(dòng)劑等，改良傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)染方式，將miRNA作為膀胱癌藥物靶向治療的分子靶點(diǎn)，使膀胱癌的早期診斷分類、優(yōu)化治療成為可能，為膀胱癌的診治開(kāi)辟一條新的更有效的研究路徑。

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