■張 娟 劉 麗 高 侃 何陽春 王永俠 汪海峰

(浙江農(nóng)林大學(xué)動物科技學(xué)院，浙江臨安311300)

近年來，工業(yè)上對天然聚合物的需求引起人們對多糖越來越多的關(guān)注，尤其是植物多糖和微生物來源的多糖。細(xì)菌胞外多糖（Exopolysaccharide，EPS）是細(xì)菌在生長代謝過程中分泌到周圍環(huán)境中的一類高分子的長鏈聚合物。許多細(xì)菌都能產(chǎn)生胞外多糖，乳酸菌為主要的益生菌，其所產(chǎn)生的胞外多糖對健康無任何毒副作用，是食品級多糖的來源。細(xì)菌多糖由于它們獨特的功能作用，具有作為新的綠色飼料添加劑開發(fā)應(yīng)用的廣闊前景。乳酸桿菌EPS在發(fā)酵乳的流變學(xué)特性、產(chǎn)品的結(jié)構(gòu)和質(zhì)地以及口感等方面起重要作用外，還具有抗腫瘤、抗氧化、降低膽固醇、增強免疫力等多種生理功能。鼠李糖乳酸桿菌（Lactobacillus rhamnosus GG，LGG）能夠定植于腸道，起到抑制病原菌的生長、調(diào)節(jié)腸道菌群、抗病毒、預(yù)防和治療腹瀉、提高免疫力等作用。然而目前乳酸桿菌EPS的產(chǎn)量不高,提取成本高,制約著其進一步生產(chǎn)應(yīng)用。本文系統(tǒng)的對鼠李糖乳酸桿菌EPS的提取條件和合成條件進行了優(yōu)化,旨在提高EPS的產(chǎn)量,為進一步分離純化、研究其活性及應(yīng)用于生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株與培養(yǎng)基

鼠李糖乳酸桿菌Lactobacillus rhamnosus GG（美國喬治亞大學(xué)饋贈）、乳酸桿菌選擇性培養(yǎng)基（MRS肉湯培養(yǎng)基）。

1.2 EPS含量的測定

苯酚-硫酸法，以葡萄糖作為標(biāo)準(zhǔn)。

1.3 試驗流程

LGG在MRS肉湯中過夜培養(yǎng)→將過夜培養(yǎng)的LGG接種到新鮮MRS肉湯中培養(yǎng)→離心（12 000 g，10 min，4℃）除菌體和凝結(jié)蛋白→上清液中加三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）→離心除去沉淀蛋白→乙醇沉淀→離心去上清→去離子水熱溶解沉淀多糖→去離子水4℃透析（透析袋截留分子量為8～14 kDa）48 h，每8 h換水1次→冷凍干燥→得粗多糖。

1.4 EPS提取條件的優(yōu)化

TCA除蛋白條件的優(yōu)化：取LGG培養(yǎng)液離心后的上清液，分別在其中加入80%的TCA至終濃度為4%、6%、8%、10%、12%、14%和16%，離心醇沉后研究不同TCA濃度對EPS提取量的影響。乙醇添加量及乙醇沉淀時間的優(yōu)化：分析不同的乙醇添加量（1、2、3、4和5倍體積95%乙醇）及乙醇沉淀時間（12、16、20、24、28、32 h）對EPS提取量的影響。

1.5 EPS合成條件的優(yōu)化

1.5.1 單因子試驗

以EPS產(chǎn)量為測定目標(biāo)，采用單因素試驗，分析不同的碳源（果糖、甘露糖、乳糖、半乳糖、蔗糖、麥芽糖、葡萄糖）、葡萄糖濃度（20、25、30、40 g/l）、培養(yǎng)基初始pH值（5.5、6.0、6.5、7.0）、接種量（1%、2%、3%、4%和5%）、培養(yǎng)溫度（25、30、37、42 ℃）、培養(yǎng)時間（8、12、16、20、24、28 h）對EPS產(chǎn)量的影響。

1.5.2 正交試驗

根據(jù)1.5.1節(jié)單因素多水平結(jié)果，選擇對EPS產(chǎn)量具有較大影響的培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時間、培養(yǎng)基初始pH值、葡萄糖濃度作為正交試驗因素，設(shè)計4因素3水平[L9（34）]正交試驗，優(yōu)化合成EPS的條件。

1.6 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用SAS 9.1.3統(tǒng)計軟件的廣義線性模型（GLM）進行統(tǒng)計處理，采用Duncan氏新復(fù)極差法對各試驗組之間參數(shù)進行差異顯著性檢驗，試驗結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P＜0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 EPS提取條件的優(yōu)化結(jié)果

2.1.1 TCA濃度對EPS提取量的影響（見圖1）

圖1 TCA濃度對EPS提取量的影響

如圖1所示，在TCA的濃度還未達到10%時，隨著TCA濃度的增加，EPS產(chǎn)量增加，超過10%，EPS產(chǎn)量開始下降。但是添加8%、10%、12%的TCA所得EPS的量沒有顯著性差異（P＞0.05）。擬合曲線如圖1，根據(jù)回歸公式，計算得出最佳TCA濃度為11%。

2.1.2 乙醇添加量對EPS提取量的影響（見表1）

表1 95%乙醇添加量對EPS產(chǎn)量的影響

由表1可以看出，乙醇與發(fā)酵液體積比從1增加到4的過程中，EPS提取量顯著增加，但體積比從4增加到5時，EPS提取量增加比較緩慢，并且結(jié)果差異不顯著（P＞0.05）?？紤]到EPS提取量及提取成本，選擇4倍體積95%的乙醇進行沉淀。

2.1.3 乙醇沉淀時間對EPS提取量的影響（見表2）

表2 乙醇沉淀時間對EPS提取量的影響

由表2可知，EPS提取量隨乙醇沉淀時間的延長而增加；在12～16 h內(nèi)，產(chǎn)量增加不明顯，16～24 h內(nèi)EPS產(chǎn)量明顯增加。但是當(dāng)醇沉?xí)r間進一步從24 h增加到32 h時，提取量增加非常緩慢?？紤]到沉淀24、28和32 h所得EPS的量之間差異不顯著（P＞0.05），而且時間越短越可有效地利用資源，結(jié)合相關(guān)的研究結(jié)果，選擇醇沉?xí)r間為24 h。

綜合以上結(jié)果，選擇11%的三氯乙酸除蛋白，4倍體積95%的乙醇沉淀24 h，EPS提取效果較佳。

2.2 EPS合成條件的優(yōu)化結(jié)果

2.2.1 培養(yǎng)溫度及時間對EPS產(chǎn)量的影響

選取25、30、37和42℃ 4個培養(yǎng)溫度，測定不同溫度、不同時間對胞外多糖產(chǎn)量的影響，結(jié)果見表3。由表3可知，培養(yǎng)時間對EPS產(chǎn)量影響顯著（P＜0.05）；培養(yǎng)溫度對EPS的合成量無顯著影響（P＞0.05），兩者交互作用對EPS產(chǎn)量影響顯著（P＜0.05）。在這4個溫度下，隨著培養(yǎng)時間的延長，它們都呈現(xiàn)一個先上升后下降的趨勢。在30℃和37℃均是在培養(yǎng)16 h后EPS產(chǎn)量達到最大的，而25℃和42℃均是在培養(yǎng)24 h后EPS產(chǎn)量達到最大值。

表3 溫度對EPS產(chǎn)量的影響

2.2.2 培養(yǎng)基初始pH值對EPS產(chǎn)量的影響(見表4)

表4結(jié)果顯示，培養(yǎng)基初始pH值不同，EPS產(chǎn)量也不同。其中在6.0的初始pH值下，EPS產(chǎn)量高達203.8 mg/l。初始pH值在5.5、6.5時EPS產(chǎn)量之間差異不顯著（P＞0.05）。

2.2.3 接種量對EPS產(chǎn)量的影響(見表5)

表4 培養(yǎng)基初始pH值對EPS產(chǎn)量的影響

表5 接種量對EPS產(chǎn)量的影響

由表5可知，接種量不同，EPS產(chǎn)量不同，其中接種量為4%時，EPS產(chǎn)量最高。但不同接種量下的差異不顯著（P＞0.05）。

2.2.4 碳源對EPS產(chǎn)量的影響(見表6)

表6 碳源對EPS產(chǎn)量的影響

由表6可知，在不同的碳源下，菌株所產(chǎn)EPS的量各不相同，其中以半乳糖作為碳源時，EPS產(chǎn)量最高，可達到311.1 mg/l，其次為葡萄糖，EPS產(chǎn)量為295.9 mg/l，而以甘露糖為碳源所產(chǎn)的EPS量最低。在添加的7種碳源中，除半乳糖除與葡萄糖不存在顯著性差異外（P＞0.05），它與其它5種碳源都存在顯著性差異（P＜0.05），而果糖、甘露糖、乳糖和麥芽糖這4種碳源間無顯著性差異（P＞0.05）。由于半乳糖在工業(yè)化生產(chǎn)中應(yīng)用的成本較高，因此選擇葡萄糖作為最適碳源。2.2.5 葡萄糖濃度對EPS產(chǎn)量的影響(見表7)

表7 葡萄糖濃度對EPS產(chǎn)量的影響

如表7所示，在培養(yǎng)基中添加不同濃度的葡萄糖，EPS產(chǎn)量隨葡萄糖濃度的增加而增加，當(dāng)葡萄糖濃度為30 g/l時EPS產(chǎn)量最高，但進一步增加葡萄糖的濃度時，EPS產(chǎn)量反而會降低。

2.2.6 正交試驗優(yōu)化結(jié)果

根據(jù)以上結(jié)果，以培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時間、培養(yǎng)基初始pH值、葡萄糖濃度為因素，以EPS產(chǎn)量為指標(biāo)設(shè)計L9（34）正交試驗，正交表及結(jié)果如表8。根據(jù)正交試驗極差R值可知，培養(yǎng)溫度是影響EPS產(chǎn)量最重要的因素，培養(yǎng)時間次之，葡萄糖濃度和培養(yǎng)基初始pH值影響較小，即影響EPS產(chǎn)量的因素主次順序為培養(yǎng)溫度＞培養(yǎng)時間＞葡萄糖濃度＞培養(yǎng)基初始pH值。菌株發(fā)酵產(chǎn)胞外多糖的最佳條件組合為2號試驗組，即培養(yǎng)溫度37℃，培養(yǎng)時間20 h，培養(yǎng)基初始pH值6.0，葡萄糖濃度25 g/l，在此條件下，EPS產(chǎn)量可達231.5 mg/l。然而5號試驗組（230.2 mg/l）與2號試驗組所產(chǎn)EPS的量之間并沒有顯著性差異（P＞0.05），且葡萄糖用量較少，所以選擇其合成胞外多糖的最佳條件為：培養(yǎng)基中添加20 g/l的葡萄糖，調(diào)節(jié)其pH值為6.5，在30℃培養(yǎng)20 h。

表8 EPS提取條件的正交試驗結(jié)果

3 討論

在提取EPS的過程中，蛋白清除和多糖沉淀是兩個主要的步驟。目前常用的脫除蛋白質(zhì)的方法主要有兩種，Sevag法和TCA法。但Sevag法耗時、試劑用量大，因此本試驗選擇TCA法除蛋白。本試驗發(fā)現(xiàn)提取EPS的最佳的TCA濃度為11%，這與Nikolic等和Pham等的試驗結(jié)果相似，其除蛋白時所用的TCA的濃度分別為12%和10%。

在多糖的沉淀方面，Kanmani等用2倍體積無水乙醇在4℃過夜來提取EPS。劉齊等對嗜酸乳酸桿菌EPS提取工藝進行優(yōu)化，得出在80%體積分?jǐn)?shù)的乙醇下，以1∶1.8（體積比）的料液比抽提12 h，此時得到的EPS產(chǎn)量最高。馮美琴等的試驗結(jié)果表明，植物乳酸桿菌EPS醇沉的最佳條件為：95%乙醇添加量與發(fā)酵液體積比為3.9，發(fā)酵液濃縮倍數(shù)3.54倍，醇沉?xí)r間12.56 h。本試驗確定了乳酸桿菌LGG產(chǎn)EPS的最佳醇沉條件：4倍體積95%的乙醇4℃沉淀24 h。

溫度是影響細(xì)菌生長繁殖和發(fā)酵合成EPS的重要因素之一。大部分乳酸菌是在低于其最適生長溫度的亞適生長條件下或最適生長溫度下EPS產(chǎn)量達到最大值的。羅伊氏乳酸桿菌（Lactobacillus reuteri ATCC 55730）在43℃時生長速率最快，而EPS產(chǎn)量達到最大值的培養(yǎng)溫度卻是37℃。當(dāng)發(fā)酵溫度在31～33℃時，藏靈菇源干酪乳桿菌KL1合成EPS的產(chǎn)量最高，溫度高于33℃時EPS產(chǎn)量迅速下降，在最適生長溫度37℃時EPS產(chǎn)量卻較低。在以葡萄糖或乳糖為碳源時，15℃和25℃最有利于于Lactobacillus sakei 0-1的生長和EPS的產(chǎn)生；30℃時菌株的生長狀態(tài)不好，EPS的產(chǎn)量也較低；42℃時無論以葡萄糖或乳糖為碳源都沒有EPS的產(chǎn)生，因為在此較高的溫度下基本上沒有細(xì)菌的生長。培養(yǎng)溫度為30℃與40℃時，Lactobacillus delbrueckii ssp.bulgaricus RR在培養(yǎng)基SDM中所產(chǎn)的EPS量基本上是相同的(220 mg/l)，但是EPS在40℃的產(chǎn)生速率（11.95 mg/h）卻高于在30℃時的產(chǎn)生速率（8.04 mg/h）。本試驗中LGG產(chǎn)EPS的最佳培養(yǎng)溫度為30℃，低于其最適生長溫度37℃。推測認(rèn)為溫度較低時，菌體生長速度較慢，細(xì)胞壁合成亦較慢，從而使較多的類異戊二烯脂質(zhì)載體（也參與細(xì)胞壁多聚物如肽聚糖、磷壁酸、脂多糖等的生物合成）被用于合成EPS。

EPS屬于菌體產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物，根據(jù)菌株來源的不同，它可以在不同的生長階段產(chǎn)生。德氏乳酸桿菌保加利亞亞種EPS產(chǎn)量在18 h為最高，24 h后EPS產(chǎn)量顯著降低。乳酸桿菌Lactobacillus sakei 0-1在生長的早期階段就開始產(chǎn)生EPS，對數(shù)期EPS的產(chǎn)生速率達到最大值，而當(dāng)達到穩(wěn)定期時EPS的產(chǎn)生即停止。Pham等報道鼠李糖乳酸桿菌R以葡萄糖為碳源時，EPS產(chǎn)量在36 h達到最大值后開始下降；以乳糖為碳源，21 h后EPS產(chǎn)量開始下降。本試驗發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)溫度為25℃時，隨著時間的延長，EPS產(chǎn)量逐漸增加，24 h達到最大值；在30℃和37℃的條件下均是在培養(yǎng)16 h EPS產(chǎn)量達到最大值。

EPS合成的過程是一系列酶促反應(yīng)的過程，發(fā)酵液pH值的變化影響發(fā)酵過程中各種酶的活性。前人研究發(fā)現(xiàn)EPS生物合成量最大的pH范圍都是在中性偏酸的條件下，該條件下參與EPS生物合成的類異戊二烯脂質(zhì)載體的活力最強。本試驗中，pH為6.0時，EPS生物合成量最大，這與前人的研究結(jié)果相似。

培養(yǎng)基組分是影響EPS產(chǎn)量的重要因素，尤其是碳源。在葡萄糖、乳糖和半乳糖中，葡萄糖最利于Lactobacillus sakei 0-1的生長，同時以它為碳源，EPS產(chǎn)量也最高。Ismail報道在以乳糖（40 g/l）為碳源時，植物乳酸桿菌MTCC9510 EPS產(chǎn)量最高。Cerning等研究了不同濃度的半乳糖、葡萄糖、乳糖、蔗糖、麥芽糖和蜜二糖對Lactobacillus casei CG11產(chǎn)胞外多糖的影響，發(fā)現(xiàn)不同的碳源及其濃度都對多糖的產(chǎn)量有很大的影響，且該菌的最佳碳源為葡萄糖（20 g/l），而以乳糖和半乳糖為碳源時EPS產(chǎn)量最低。本試驗結(jié)果顯示半乳糖為鼠李糖乳酸桿菌LGG合成EPS的最佳碳源，葡萄糖其次。

4 結(jié)論

試驗結(jié)果表明鼠李糖乳酸桿菌LGG產(chǎn)生胞外多糖的最佳條件為：在MRS肉湯中添加20 g/l的葡萄糖，調(diào)節(jié)其初始pH值為6.5，于30℃培養(yǎng)20 h。EPS最佳的提取條件為：用11%的三氯乙酸除蛋白，4倍體積95%的乙醇沉淀24 h，EPS產(chǎn)量可達230.2 mg/l。

（參考文獻22篇，刊略，需者可函索）