■ 趙 燕 朱將偉 黃 嶸 劉 軍，3 李 凌

(1.上海市質(zhì)量監(jiān)督檢驗技術(shù)研究院，上海200233；2.上海市浦東新區(qū)農(nóng)產(chǎn)品安全檢測中心，上海201202；3.上海交通大學農(nóng)業(yè)與生物學院，上海200240；4.首都醫(yī)科大學公共衛(wèi)生與家庭醫(yī)學學院，北京100069)

氨基甲酸酯類農(nóng)藥是一類應(yīng)用廣泛的廣譜性殺蟲劑，在當前的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中發(fā)揮了重要作用，但其應(yīng)用所導致的農(nóng)藥殘留給農(nóng)產(chǎn)品安全和環(huán)境生態(tài)造成諸多負面影響，相關(guān)污染事件屢有報道，因此對其殘留量進行監(jiān)測就尤為重要[1,2]。目前多采用色譜法、色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法、酶聯(lián)免疫吸附分析法等方法對氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留進行檢測，其中應(yīng)用最為廣泛的方法是HPLC法，但該法在應(yīng)用時需先將樣品衍生，然后再使用熒光檢測器分析，操作步驟比較繁瑣[3-4]。采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)對氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留進行分析，可顯著簡化分析步驟，并且LC-MS/MS法具有靈敏度高、選擇性強、檢測結(jié)果一般不需再次確證等優(yōu)點。在本實驗中研究了玉米中滅多威等5種氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留分析的樣品前處理方法和液-質(zhì)聯(lián)用分離檢測條件。結(jié)果表明，本方法操作簡便、靈敏度高、凈化效果好，可用于分析玉米等糧谷中的氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留量。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Agilent1260/6430高效液相色譜-三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國）；Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱（3.0×100 mm，1.8-Micron），氨基固相萃取柱（500 mg/6 ml），粉碎機，勻漿機，氮吹儀等。

乙腈（HPLC，德國 Merck），甲醇（HPLC，德國Merck），二氯甲烷（HPLC，美國J.T.Baker），氯化鈉（分析純）。農(nóng)藥標樣：滅多威、3-羥基克百威、涕滅威、克百威、異丙威（購自上海市農(nóng)藥研究所，濃度為1 000 mg/l）。

1.2 色譜與質(zhì)譜條件

色譜柱：Agilent C18柱(3.0×100 mm，1.8-Micron)；流動相：0.1%甲酸水溶液(A相)和乙腈(B相)；柱溫：40 ℃；進樣量：5 μl。

梯度洗脫程序：0 min（20%B）→0.5 min（20%B）→4.0 min（90%B）→9.0 min（90%B）→9.1 min（20%B）→11.0 min（20%B）。流速：0.3 ml/min。

質(zhì)譜條件及參數(shù)：電噴霧離子源，多反應(yīng)監(jiān)測掃描，正離子模式，離子源參數(shù)（干燥氣溫度325℃，干燥氣流速10 L/min,霧化氣壓力45 psi，毛細管電壓4 000 V）；質(zhì)譜主要采集參數(shù)見表1。

表1 5種農(nóng)藥的LC-MS/MS采集參數(shù)

1.3 樣品處理

1.3.1 試樣制備

取1 000 g待測玉米樣品，過篩去除塵土及沙石等雜物，進行粉碎后備用。1.3.2 提取

準確稱取20.0 g經(jīng)粉碎混勻的樣品于250 ml三角瓶中，加入約20 ml蒸餾水浸泡15 min，再加入40 ml乙腈，用勻漿機高速勻漿2 min后用濾紙過濾，濾液收集于裝有7 g氯化鈉的100 ml具塞量筒中，劇烈震蕩1 min，在25℃下靜置30 min，使乙腈和水相分層[5]。

1.3.3 凈化

從100 ml具塞量筒中吸取10 ml乙腈溶液（上層）于25 ml刻度離心管中,于70℃水浴上氮氣吹至近干，加入2 ml甲醇+二氯甲烷（1+99）溶解殘渣，蓋上鋁箔，待凈化。

將氨基柱用5 ml甲醇+二氯甲烷（1+99）預(yù)淋洗，當溶劑液面到達柱吸附層表面時，立即加入上述待凈化的溶液，用試管收集洗脫液，再用2 ml甲醇+二氯甲烷（1+99）洗離心管后過柱，并重復一次。將收集有洗脫液的試管置于50℃水浴上氮氣吹至近干，然后用甲醇定容至5 ml。最后用漩渦混合器混勻，過0.2 μm濾膜，裝入進樣瓶中待測。

1.4 標準曲線與樣品測定

將農(nóng)藥標準物質(zhì)配制成系列濃度的混合標準溶液，進行LC-MS/MS分析，以質(zhì)譜響應(yīng)值對應(yīng)濃度分別制作5種農(nóng)藥的標準曲線。經(jīng)過處理的樣品提取物在上述色譜-質(zhì)譜條件下進行分析，參照標準曲線用外標法計算樣品中各種農(nóng)藥的濃度。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取過程及溶劑的優(yōu)化

由于玉米含水量很低，若直接用乙腈提取玉米中的氨基甲酸酯類農(nóng)藥，回收率很低（低于50%）；在加入乙腈前加水浸泡可顯著提高提取效率，但過多的水會影響后續(xù)處理過程中水分的去除，從而影響最終的定量分析。通過比較優(yōu)化，確定加水量為20 ml，并浸泡樣品15 min。

在氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留分析中常用的提取溶劑有乙腈、乙酸乙酯、丙酮、二氯甲烷、石油醚等。本實驗分別比較了丙酮、乙腈、乙酸乙酯和二氯甲烷作為提取溶劑的效果。實驗結(jié)果表明,當用丙酮或乙酸乙酯作提取溶劑時，溶出的油脂類雜質(zhì)較多，影響后續(xù)凈化和上機分析；而用二氯甲烷提取時，由于其比水重而處于下層，不便于操作，且容易發(fā)生乳化。而用乙腈作為提取溶劑時，其提取效率高，操作簡便，其脂肪類溶出物和溶出雜質(zhì)均較少，有利于后續(xù)的鹽析和凈化，因此最終選擇乙腈作為提取溶劑。

另外，在用氨基柱進行凈化的過程中，比較了3種不同洗脫溶液[①甲醇+二氯甲烷(1+99)；②甲苯+乙腈(75+25)；③丙酮+乙醚(20+80)]的效果，結(jié)果表明甲醇+二氯甲烷(1+99)作為洗脫溶液時，可有效地除去色素、脂肪等雜質(zhì)，并顯著減少干擾，回收率也更好，綜合效果明顯優(yōu)于另外兩種洗脫溶液。

2.2 儀器分析條件的優(yōu)化

流動相的選擇：本實驗采用Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱，比較了不同體系的流動相[①甲醇-甲酸水溶液(0.1%)；②乙腈-甲酸水溶液(0.1%)；③甲醇-乙酸銨水溶液(2 mmol/l)；④乙腈-乙酸銨水溶液(2 mmol/l)]。結(jié)果表明不同的流動相對待測農(nóng)藥的離子化產(chǎn)生較大的影響，乙腈-甲酸水溶液體系對3-羥基克百威影響較大，其峰形差，響應(yīng)值也不夠高；在甲醇-乙酸銨水溶液體系中5種待測農(nóng)藥的響應(yīng)值均顯著低于甲醇-甲酸水溶液體系，而采用乙腈-乙酸銨水溶液體系時，其響應(yīng)值也不高，另外還影響到涕滅威、克百威和異丙威三種農(nóng)藥的色譜分離度，并且通過優(yōu)化梯度洗脫程序也未能有效改善。因此，最終選擇甲醇-甲酸水溶液作為流動相，同時也對甲酸濃度進行了優(yōu)化，流動相中的甲酸能有效促進離子化，但濃度高于0.1%時會導致質(zhì)譜基線噪聲顯著增加，進而導致靈敏度下降，故選定甲酸水溶液的濃度為0.1%。

為了獲得最佳的檢測效果，在優(yōu)化了萃取方式、流動相以及梯度洗脫程序等條件后，對各項質(zhì)譜參數(shù)也進行了優(yōu)化（表1）。圖1為5種氨基甲酸酯類農(nóng)藥標準品混合液的總離子流。

圖1 5種氨基甲酸酯類農(nóng)藥混合標準品總離子流

2.3 線性關(guān)系與檢出限

在上述經(jīng)優(yōu)化的測試條件下，取一系列濃度的標準品混合液進行分析，以各農(nóng)藥組分的質(zhì)譜響應(yīng)值對其濃度作出曲線，得到各農(nóng)藥的線性回歸方程，各農(nóng)藥在1～100 μg/l范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。當樣品中待測的氨基甲酸酯農(nóng)藥被檢出，且其濃度超過該線性范圍時，需在稀釋處理后再次測定。5種氨基甲酸酯農(nóng)藥的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量下限等見表2，其中檢出限以3倍信噪比進行計算得出，以4倍檢出限作為定量下限（參考:美國環(huán)保署EPA SW-846）。

2.4 回收率測定以及與其它標準方法測定結(jié)果的比較

向兩組空白玉米樣品中加入混合農(nóng)藥標準溶液，使第1組玉米中各農(nóng)藥濃度為5.0 μg/kg，第2組中各農(nóng)藥濃度為20.0 μg/kg。按上述方法流程及選定的參數(shù)測定5種農(nóng)藥的含量并計算回收率(n=5)，其回收率范圍為81.7%～93.1%，RSD為3.7%～6.9%，均能滿足方法學要求。這兩組玉米樣品同時還按照出入境檢驗檢疫行業(yè)標準SN/T 2085-2008進行了測定(n=5)，測定結(jié)果見表3，經(jīng)比較發(fā)現(xiàn)，兩種方法的測定結(jié)果基本相當（SN/T 2085-2008的回收率略高），按SN/T 2085-2008測定時的回收率為84.5%～94.9%。

表2 LC-MS/MS法測定5種農(nóng)藥的回歸方程、相關(guān)系數(shù)及檢出限和定量下限

表3 5種農(nóng)藥的回收率和精密度試驗結(jié)果

3 結(jié)語

本文所述方法較SN/T 2085-2008(進出口糧谷中多種氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留量檢測方法-液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法)等標準方法更為簡便，極大地簡化了樣品的前處理過程，縮短了分析時間，各項技術(shù)指標也均能達到實際檢測工作的要求。運用該檢測方法，玉米樣品經(jīng)簡便易行的前處理流程處理后，利用LC-MS/MS進行分析，能對玉米中的多種氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留進行定性和定量檢測，方法快速、簡便，擁有滿意的靈敏度和準確度，方法的定量限均低于GB2763-2005(食品中農(nóng)藥最大殘留限量)所規(guī)定的農(nóng)殘限量值，適合玉米等糧谷中氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留的測定。