王朝雯等

摘要 [目的]建立臺蘭穩(wěn)定可靠的ISSR-PCR分子標記反應體系。[方法]用改良的CTAB法提取葉片的基因組DNA，并對影響臺蘭ISSR-PCR反應體系的主要成分進行篩選和優(yōu)化。[結果]臺蘭的ISSR-PCR優(yōu)化反應體系為：25 μl PCR反應體積中，2.5 μl 10×PCR buffer，2.0 mmol/L MgCl2，100 ng模板DNA，0.5 mmol/L dNTPs，0.22 U Taq DNA 聚合酶，0.4 μmol/L 引物，15.78 μl雙蒸水。最佳擴增程序為：94 ℃預變性5 min，然后進行40個循環(huán)：94 ℃變性30 s，復性溫度根據(jù)各引物的TM值略低1～2 ℃，30 s，72 ℃延伸50 s，循環(huán)結束后72 ℃延伸7 min。[結論] 臺蘭ISSR-PCR優(yōu)化反應體系為今后利用ISSR技術進行臺蘭種質資源的遺傳多樣性分析奠定了技術基礎。

關鍵詞 臺蘭（Cymbidium floribundum var.pumilum）；ISSR分子標記；ISSR-PCR反應體系

中圖分類號 S682.1 文獻標識碼

A 文章編號 0517-6611（2014）15-04583-04

Abstract [Objective] This research aimed to establish the optimized ISSR-PCR reaction system ofCymbidium floribundum var. pumilum. [Method] The genomic DNA from fresh leaves was extracted according to the modified CTAB method. Different factors that affected ISSR amplification reaction were optimized. [Result] High-quality genomic DNA was obtained from Cymbidium floribundum var. pumilum. The 25 μl optimized ISSR-PCR reaction mixture contained 2.5 μl 10×PCR buffer， 2.0 mmol/L MgCl2， 100 ng template DNA， 0.22 U Taq DNA polymerase， 0.5 mmol/L dNTPs， 0.4 μmol/L primer and 15.78 μl ddH2O. The PCR was performed as follow： an initial step of 5 min at 94 ℃， named pre-denaturing， followed by 40 cycles of denaturing at 94 ℃ for 30 s， annealing for 30 s due to 1-2 ℃ lower than denaturing temperature of different primers， extension for 50 s at 72 ℃， and a 7 min final extension step at 72 ℃. [Conclusion] The optimal system was established and it could provide a favorable basis for further study on genetic diversity of C. floribundum var. pumilum， using ISSR molecular marker.

Key words C. floribundum var. pumilum； ISSR； ISSR-PCR reaction system

臺蘭（Cymbidium floribundum var.pumilum ）又名蜜蜂蘭、蜂子蘭、金棱邊、蒲蘭等，為蘭科 （Orchidaceae）蘭屬（Cymbidium）多年半地生性蘭科植物。蘭花的種質資源是選種育種的基礎，種質資源一旦滅絕，無法再造，從這一意義上來說，野生蘭花若再不加以保護，將會對世界蘭花的育種、研究造成不可彌補的損失，并將會直接威脅到我國蘭花經(jīng)濟的持續(xù)發(fā)展。目前，關于蘭科植物的研究主要集中在形態(tài)學、分類學、生理學、孢粉學、區(qū)系地理學和繁殖生物學等方面[1-2]，而關于居群遺傳學的研究則很少。

近年來，應用 ISSR-PCR 分子標記技術對植物進行遺傳多樣性研究已有較多報道[3-5]，而采用ISSR技術對野生臺蘭的遺傳多樣性和居群遺傳結構進行的研究鮮有報道。筆者以采自江西省贛州市齊云山的臺蘭作為試驗材料，對臺蘭ISSR-PCR反應體系進行優(yōu)化，以建立比較完善的反應條件，以期為建立為進一步利用ISSR分子標記技術進行臺蘭遺傳多樣性研究提供基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 試驗樣品采自江西省贛州市齊云山的一個自然居群，每個居群采集 15～20個樣本。記錄采集樣品的經(jīng)緯度、海拔和生境，同時對每個居群采集憑證標本供研究用。采集完成后用硅膠干燥法進行處理、保存，備用。

1.2 基因組 DNA 的提取 采用改良的 CTAB 法提取臺蘭基因組DNA，步驟如下：①取0.05 g硅膠干燥的臺蘭葉片材料，置于1.5 ml離心管中加液氮研磨成粉末后，加入0.75 ml 65 ℃預熱的2×CTAB抽提緩沖液（ pH8.0），20 μl β-硫基乙醇，輕輕搖動使溶液分散均勻，65 ℃水浴1 h，水浴過程每隔10 min輕輕搖動。②冷卻至室溫，加等體積的氯仿∶異戊醇（ 24∶1），混合均勻，12 000 r/min離心10 min。③吸取上層液相轉入新的1.5 ml離心管，加等體積氯仿異戊醇，搖勻。④12 000 r/min離心10 min。取上層液相，加1/10體積3 mol/L的冰醋酸鈉，2倍體積-20 ℃的無水乙醇，-20 ℃保存20 min。⑤勾出 DNA。⑥加70 %乙醇洗滌2 次，用無水乙醇洗滌1 次，風干。⑦用40 μl 0.1TE溶解 DNA，-20 ℃長期保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 DNA 樣品的檢測 用1.0%瓊脂糖電泳檢測DNA質量；用分光光度計測定其純度和濃度，DNA純度以OD260/OD280的比值來估算，濃度估算法為：DNA 濃度 （ng/μl） =OD260×50×稀釋倍數(shù)。計算DNA獲得率（ DNA量/所用葉片量×100%）為1.8%。

1.4 ISSR-PCR 擴增反應

1.4.1 ISSR-PCR 條件篩選。反應體系為25 μl，其中10×buffer 2.5 μl，引物濃度為0.4 μmol/L，雙蒸水15.78 μl。為確定 PCR 反應中其他4項因素 （ DNA模板、Taq DNA聚合酶、Mg2+和dNTPs ） 的最佳水平，試驗用引物對 ISSR-PCR 反應的這4項影響因素逐個進行5個水平的研究，各反應參數(shù)變化量見表 1。反應總體積為25 μl （含2.5 μl 10×buffer和15.78 μl ddH2O）。

1.4.3 PCR 擴增步驟及參數(shù)。取1.5 ml已滅菌eppendorf管，依擴增的樣本數(shù)計算各成分的量，依次加入ddH2O→10×buffer→dNTPs →Taq酶，混勻后分裝到各擴增薄壁管中，依次加入模板，按循序放入 PCR 擴增儀樣本中，按以下程序進行擴增。擴增完畢，將樣本取出，置于4 ℃ 冰箱保存，等待電泳。反應條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，50～60 ℃退火30 s，72 ℃延伸50 s，共40個循環(huán)；72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，并回收純化目的條帶。

1.5 電泳與拍照 PCR 擴增結束后，以 GeneRuler 100 bp DNA Ladder Plus（上海生物工程公司產(chǎn)品SM0321 ）為分子量標記，用含有0.1% EB的1.5%瓊脂糖凝膠電泳（0.6 g瓊脂糖，40 ml 1×TAE緩沖液），電泳緩沖液為1×TAE 電泳緩沖液100 V穩(wěn)壓100 mA電泳45～60 min，凝膠成像儀下成像拍照并保存。

2 結果與分析

2.1 Taq DNA 聚合酶對 ISSR-PCR 反應的影響 試驗設計了 Taq DNA 聚合酶5個濃度梯度為0.18、0.20、0.22、0.25和0.28 U，同時對5個引物18291、18294、18295、18297和18298進行篩選。圖1表明，當 Taq DNA 聚合酶濃度為0.18和0.20 U 時，擴增譜帶模糊不清；濃度為0.20、0.25、0.28 U時，擴增譜帶較弱，且數(shù)量相對較少；濃度為0.22 U時擴增條帶較多且較亮，效果最好，故確定為最佳濃度。同時可以看出引物18257和18297的條帶較為清晰而且數(shù)量較多，篩選出效果較好的引物為18257和18297。

2.2 dNTPs 濃度對 ISSR- PCR 反應的影響 圖2表明，當濃度為0.3 mmol/L時，幾乎無擴增產(chǎn)物；在0.4 mmol/L時，雖有擴增產(chǎn)物，但譜帶較弱不易辨認；濃度為0.5～0.7 mmol/L時，均能擴增出清晰的譜帶，但在0.6～0.7 mmol/L，擴增產(chǎn)物不穩(wěn)定且有非特異性擴增；在0.6 mmol/L時，擴增譜帶較弱或一些大的片段擴增缺失?？紤]到結果的穩(wěn)定性和減少試驗成本，選用0.5 mmol/L 的dNTPs濃度，在此濃度下，擴增產(chǎn)物穩(wěn)定、重復性強。同時對引物18262、18265、18266、18268和18269進行篩選，得出18265和18269擴增效果較好。

2.5 臺蘭優(yōu)化體系的建立 通過對以上各種影響因素的分析優(yōu)化，建立了反應穩(wěn)定、重復性好的臺蘭ISSR-PCR 反應體系：在25 μl 反應體系中含2.5 μl 10×buffer，0.5 mmol/L dNTPs，2.0 mmol/L MgCl2，0.4 μmol/L引物，0.22 U Taq DNA 聚合酶，100 ng模板 DNA，雙蒸水15.78 μl。PCR 擴增程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，50～60 ℃退火（退火溫度隨引物不同而定，根據(jù)各引物的Tm值略低1～2 ℃）30 s，72 ℃延伸50 s，40個循環(huán)；72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。

為了檢測優(yōu)化的效果，試驗利用建立的優(yōu)化體系，選用UBC822引物，在復性溫度為50 ℃條件下，對12個篩選的引物進行批量擴增。圖5表明，優(yōu)化后的反應體系是比較理想的。

3 結論與討論

3.1 ISSR 反應體系主要成分對ISSR-PCR反應穩(wěn)定性的影響 ISSR是基于PCR反應的一種分子標記技術，具有DNA用量少、操作簡單、快速靈敏、成本低等優(yōu)點[6]，但ISSR-PCR擴增反應容易受許多因素的影響，如：Taq DNA聚合酶、Mg2+濃度、dNTPs用量、DNA模板的濃度和純度等，而且這些因素之間存在相互作用。因此，不同物種的最佳擴增條件各有不同，為確保 ISSR 分析結果的可靠性和重復性，獲得較高的 ISSR-PCR擴增譜帶，提高分析的準確性，針對不同物種相應的反應體系中各種影響因子進行優(yōu)化，篩選出最適宜的ISSR-PCR擴增反應條件非常重要。

在ISSR-PCR反應體系中，Taq DNA聚合酶的用量直接決定著實驗的成功與否，量多不僅增加試驗成本而且容易產(chǎn)生非特異性擴增產(chǎn)物；量少則會使酶過早地消耗完，產(chǎn)物合成效率低[7]。試驗中Taq DNA聚合酶用量低于0.22 U時條帶數(shù)量少且比較暗，用量多于0.22 U時條帶雖然沒有減少，但是出現(xiàn)了非特異性擴增產(chǎn)物，結果表明0.22 U是臺蘭ISSR-PCR反應的最佳條件。

dNTPs是ISSR-PCR反應的原料，通常dNTPs濃度范圍為0.02～0.20 mmol/L[8]。dNTPs為Taq DNA聚合酶提供底物，使產(chǎn)物得以延伸。當dNTPs濃度過高，則導致Taq DNA聚合酶的錯誤摻入，會導致PCR錯配，從而使擴增出現(xiàn)非特異性擴增，影響擴增的準確性；濃度過低，又會影響合成效率，甚至會因過早的消耗而使產(chǎn)物單鏈化，影響擴增效果[9]。試驗中dNTPs濃度為0.3和0.4 mmol/L時，因濃度太低而擴增產(chǎn)物過少，濃度為0.5、0.6和0.7 mmol/L時都有較多擴增產(chǎn)物，但后兩者非特異性擴增相對較多，結果表明0.5 mmol/L為dNTPs最佳濃度。

Mg2+濃度是影響ISSR-PCR結果的一個重要因素，Mg2+濃度不僅影響Taq酶的活性[10]，還能與反應液中的dNTPs、模板DNA及引物結合，影響引物與模板的合效率、模板與產(chǎn)物的解鏈溫度以及產(chǎn)物的特異性和引物二聚體的形成[11]。試驗中Mg2+濃度對反應無明顯影響，所設置的幾個濃度都有較多擴增產(chǎn)物，但濃度為2.0 mmol/L時條帶較亮，結果表明2.0 mmol/L為Mg2+ 最佳濃度。

DNA模板濃度也是影響ISSR-PCR擴增效果的因素之一，濃度過低，擴增產(chǎn)物不穩(wěn)定或無擴增產(chǎn)物；濃度過高，又會相應增加非特異性產(chǎn)物的擴增。最佳的模板濃度范圍取決于研究的物種和模板純度，在DNA模板不純的情況下，寧可使用有效濃度范圍內(nèi)的最低濃度，使抑制Taq DNA 聚合酶的影響降到最小。試驗中隨著DNA模板濃度升高，擴增產(chǎn)物也相應增加，但同時非特異性產(chǎn)物也在增加，因此，考慮到穩(wěn)定性和節(jié)約成本，試驗采用的最佳DNA模板濃度為100 ng/L。