楊彩玲，韓金紅，王偉新，崔衛(wèi)剛*

(1.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院口腔外科，河南衛(wèi)輝453100;2.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河南新鄉(xiāng)453003)

0 引言

鹽酸?？颂婺崾俏覈灾餮邪l(fā)的第一種表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑，可抑制人表皮細(xì)胞癌、胃腺癌細(xì)胞的生長增殖［1-2］，它能通過負(fù)性調(diào)控AKT信號(hào)通路抑制非小細(xì)胞肺癌的生長［3］，在體外可抑制人舌鱗癌Tca8113細(xì)胞的生長、增殖［4-5］，但是它對(duì)人涎腺腺樣囊性癌ACC-M細(xì)胞的作用如何，還未見相關(guān)研究報(bào)道.筆者擬通過體外研究，探討該抑制劑對(duì)體外培養(yǎng)的人涎腺腺樣囊性癌ACC-M細(xì)胞MMP-2、E-cadherin蛋白表達(dá)的影響，探討其是否可抑制ACC-M細(xì)胞的浸潤、轉(zhuǎn)移.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國，F(xiàn)orma公司)，流式細(xì)胞儀(德國，Partec公司).人癌細(xì)胞株ACC-M(人涎腺腺樣囊性癌細(xì)胞，上海，上海交通大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院)，鹽酸?？颂婺?杭州，浙江貝達(dá)藥業(yè)有限公司)，RPMI1640培養(yǎng)基(美國，Gibco公司)，新生小牛血清(杭州，杭州四季青生物工程材料公司)，MMP-2、E-cadherin(美國，Santa Cruz公司)，通用型S-P超敏試劑盒、DAB試劑盒(北京，北京中杉金橋生物技術(shù)公司).

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1)細(xì)胞培養(yǎng):人涎腺腺樣囊性癌ACC-M細(xì)胞，將含有1.0×105U·L-1鏈霉素、1.0×105U·L-1青霉素，以及含10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，放在溫度為37℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2 d換1次培養(yǎng)液，當(dāng)細(xì)胞貼壁生長密度達(dá)到80%左右時(shí)，傳代.

2)免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè):在6孔培養(yǎng)板內(nèi)進(jìn)行細(xì)胞爬片，當(dāng)細(xì)胞生長后的密度大于1.0×108個(gè)·L-1時(shí)，按照0μmol·L-1和20μmol·L-1的濃度配制鹽酸?？颂婺崛芤?，分別加入相應(yīng)標(biāo)記孔中，放在37℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48 h.MMP-2與E-cadherin蛋白一抗工作液濃度均為1∶100，在陰性對(duì)照組里，用PBS液代替一抗工作液.嚴(yán)格按照說明書的染色步驟進(jìn)行染色，并在光鏡下觀察結(jié)果:MMP-2蛋白與E-cadherin蛋白的陽性結(jié)果均表現(xiàn)為細(xì)胞質(zhì)著棕黃色顆粒，它們的陰性結(jié)果均表現(xiàn)為不著色.

3)流式細(xì)胞儀檢測(cè):在培養(yǎng)瓶中進(jìn)行細(xì)胞的平行接種，當(dāng)細(xì)胞生長后的密度大于1.0×108個(gè)·L-1時(shí)，按照0μmol·L-1、20 μmol·L-1的濃度配制鹽酸?？颂婺崛芤?，分別加入相應(yīng)培養(yǎng)瓶中，使每1個(gè)培養(yǎng)瓶中抑制劑的作用時(shí)間達(dá)到48 h，收集細(xì)胞，加入-20℃的75%乙醇固定細(xì)胞.取單細(xì)胞懸液1.0×106個(gè)·L-1，加入鼠抗人單克隆抗體工作液0.1mL(MMP-21∶100;E-cadherin 1∶100)，采用室溫孵育，30min后進(jìn)行PBS洗滌，加入100μL羊抗鼠FITCIgG二抗工作液，采用避光室溫孵育，30min后再進(jìn)行PBS洗滌，加入0.1mL的PBS進(jìn)行500目銅網(wǎng)的過濾后，上機(jī)檢測(cè).蛋白表達(dá)定量分析用Fi(熒光指數(shù))表示，當(dāng) Fi＞1.0時(shí)，結(jié)果為陽性表達(dá);當(dāng)Fi≤1.0時(shí)，結(jié)果為陰性表達(dá).實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次.

4)統(tǒng)計(jì):應(yīng)用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以表示，采用析因設(shè)計(jì)方差分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05.

2 結(jié)果

2.1 免疫細(xì)胞化學(xué)染色

免疫化學(xué)染色表明:鹽酸埃克替尼作用ACC-M細(xì)胞后，MMP-2蛋白與E-cadherin蛋白的表達(dá)均發(fā)生變化.與參照組相對(duì)比，MMP-2蛋白細(xì)胞胞質(zhì)染色陽性率明顯降低(見圖1);E-cadherin蛋白細(xì)胞胞質(zhì)染色陽性率明顯增加(見圖2).

圖1 MMP-2蛋白的表達(dá)(SP，×400)

圖2 E-cadherin蛋白的表達(dá)(SP，×400)

2.2 間接免疫熒光流式定量檢測(cè)

間接免疫熒光流式定量檢測(cè)結(jié)果表明:0 μmol·L-1鹽酸?？颂婺嶙饔肁CC-M細(xì)胞48 h后，MMP-2蛋白的XMode值為7.4±0.58，E-cadherin的 XMode值為7.9 ±0.64.20 μmol·L-1鹽酸?？颂婺嶙饔肁CC-M細(xì)胞48 h后，MMP-2蛋白與E-cadherin蛋白的表達(dá)均發(fā)生變化.MMP-2蛋白的XMode值為5.7±0.43，E-cadherin的XMode值為 8.6 ±0.71.根據(jù) XMode值計(jì)算蛋白的FI值:MMP-2蛋白的FI值為0.967±0.001，E-cadherin蛋白的FI值為1.011±0.001.MMP-2蛋白呈陰性表達(dá)，E-cadherin蛋白呈陽性表達(dá).

3 討論

細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜對(duì)維持細(xì)胞外基質(zhì)蛋白結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定起著極其重要的作用.細(xì)胞間同質(zhì)粘附力下降，或者細(xì)胞對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)的異質(zhì)粘附力升高，均可導(dǎo)致腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的發(fā)生.證明基質(zhì)金屬蛋白酶幾乎能降解細(xì)胞外基質(zhì)的各種蛋白成分，在腫瘤細(xì)胞的浸潤轉(zhuǎn)移中具有關(guān)鍵性作用，其家族成員MMP-2由于定位于細(xì)胞穿透基質(zhì)的突出部位，故最易和腫瘤細(xì)胞的侵襲生長發(fā)生關(guān)聯(lián)［6］.據(jù)相關(guān)實(shí)驗(yàn)顯示，它在ACC-M(肺高轉(zhuǎn)移細(xì)胞株)中的表達(dá)高于ACC-2，表明ACC-M的肺高轉(zhuǎn)移能力可能與MMP-2的高表達(dá)有關(guān)［7］.本實(shí)驗(yàn)用20 μmol·L-1鹽酸埃克替尼作用MMP-2蛋白48 h，并分別對(duì)其進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)和流式細(xì)胞儀檢測(cè)，結(jié)果顯示，埃克替尼作用后，MMP-2蛋白表達(dá)降低，呈現(xiàn)陰性表達(dá).

E-cadherin是一種鈣依賴性跨膜糖蛋白，可通過細(xì)胞接觸抑制阻礙腫瘤細(xì)胞的去分化與惡性增殖，還可通過保持細(xì)胞黏附性，抑制腫瘤細(xì)胞的浸潤或轉(zhuǎn)移.E-cadherin蛋白在人類的許多腫瘤中如肺癌、口腔鱗狀細(xì)胞癌等表達(dá)異常［8-9］，表現(xiàn)為不表達(dá)或異位表達(dá)，表達(dá)強(qiáng)度與惡性腫瘤的組織分級(jí)呈負(fù)相關(guān)［9-10］.E-cadherin蛋白的表達(dá)可以預(yù)測(cè)酪氨酸激酶抑制劑的敏感性和臨床療效［11-12］.本實(shí)驗(yàn)用20 μmol·L-1鹽酸?？颂婺嶙饔?E-cadherin 蛋白48 h，并分別對(duì)其進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)和流式細(xì)胞儀檢測(cè)，結(jié)果顯示，鹽酸?？颂婺嶙饔煤螅珽-cadherin蛋白表達(dá)增高，呈現(xiàn)陽性表達(dá).

綜上所述，鹽酸?？颂婺嵬ㄟ^降低MMP-2蛋白的含量，增加E-cadherin蛋白的含量，可能抑制腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移，但關(guān)于其中更深入的作用機(jī)制尚需進(jìn)一步的深入研究.

［1］ Gao Zhenzhen，Chen Wei，Zhang Xiaohua，et al.Icotinib，a potent and specific EGFR tyrosine kinase inhibitor，inhibits growth of squamous cell carcinoma cell lineA431 through negatively regulatingAKT signaling［J］.Biomed Pharmacother，2013，67(5):351-356.

［2］Camidge D R.Icotinib:kick-starting the Chinese anticancer drug industry［J］.Lancet Oncol，2013，14(10):913-914.

［3］Shi Yuankai，Zhang Li，Liu Xiaoging，et al.Icotinib versus gefitinib in previously treated advanced non-small-cell lung cancer(ICOGEN):a randomised，double-blind phase 3 non-inferiority trial［J］.Lancet Oncol，2013，14(10):953-961.

［4］楊彩玲，韓新光.鹽酸?？颂婺釋?duì)人舌鱗狀細(xì)胞癌Tca8113細(xì)胞增殖的影響［J］.鄭州大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版，2008，43(4):701-703.

［5］楊彩玲，韓新光，于春亞.鹽酸?？商婺釋?duì)人舌鱗狀細(xì)胞癌Tca8113細(xì)胞周期及CyclinD1、P27表達(dá)的影響［J］.鄭州大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版，2011，46(1):82-85.

［6］Taniwaki K，F(xiàn)ukamachi H，Komori K，et al.Stroma-derivedmatrixmetalloproteinase(MMP)-2 promotesmembrane type 1-MMP-dependent tumor growth inmice［J］.Cancer Res，2007，67(9):4311-4319.

［7］盧友光，周鴻鷹，丁林燦，等.涎腺腺樣囊性癌高、低轉(zhuǎn)移細(xì)胞系基因表達(dá)譜及基質(zhì)金屬蛋白酶表達(dá)差異［J］.中華醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)雜志，2006，23(5):505-510.

［8］Eimoneim H M，Zaghloul N M.Expression of E-cadherin，N-cadherin and snail and their correlation with clinicopathological variants:an immunohistochemical study of 132 invasive ductal breast carcinomas in Egypt［J］.Clinics(Sao Plaulo)，2011，66(10):1765-1771.

［9］Hashimoto T，Soeno Y，Maeda G，et al.Progression of oral squamouscellcarcinoma accompanied with reduced e-cadherin expression but not cadherin switch［J］.Plos One，2012，7(10):e47899.

［10］WellsA，Yates C，Shepard C R，et al.E-cadherin as an indicator ofmesenchymal to epithelial reverting transitions during themetastatic seeding of disseminated carcinomas［J］.Clin Exp Metastasis，2008，25(6):621-628.

［11］Yauch R L，Januaro T，Eberhard DA，et al.Epithelial versusmesenchymal phenotype determines in vitro sensitivity and predicts clinical activity of erlotinib in lung cancer patients［J］.Clin Cancer Res，2005，11(24):8686-8698.

［12］Witta S E，Gemmill R M，Hirsch F R，et al.Restoring Ecadherin expression increases sensitivity to epidermal growth factor receptor inhibitors in lung cancer cell lines［J］.Cancer Res，2006，66(2):944-950.