王麗娟，張彥青，王 勇，曹金燕，李 娜

（1.天津市食品生物技術(shù)重點實驗室，天津 300134；2.天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津 300134）

姬松茸多糖增強免疫作用及急性毒性研究

王麗娟1,2，張彥青1,2，王 勇2，曹金燕2，李 娜2

（1.天津市食品生物技術(shù)重點實驗室，天津 300134；2.天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津 300134）

目的：研究姬松茸多糖對小鼠免疫功能的調(diào)節(jié)作用及急性毒性作用。方法：通過觀察姬松茸多糖對小鼠免疫器官的影響及對網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)廓清血流中惰性碳粒能力的影響，分析姬松茸多糖對哺乳動物的免疫調(diào)節(jié)作用；采用改進寇氏法研究姬松茸多糖的急性毒性。結(jié)果：1）姬松茸多糖（77～150 mg/kg，灌胃，連續(xù)7 d）能促進小鼠胸腺和脾臟的增殖，120 mg/kg的姬松茸多糖能使幼鼠胸腺增長13.1%，脾臟增長8.5%，使成年鼠胸腺增長4.0%，脾臟增長18.3%；150 mg/kg姬松茸多糖使小鼠碳粒吞噬指數(shù)提高21.7%，吞噬系數(shù)增加11.8%，表明姬松茸多糖對小鼠的免疫功能有促進作用。2）靜脈注射姬松茸多糖的LD50為840.8 mg/kg，相當(dāng)于成人一次靜脈注射6.5 g，2 周后存活小鼠體質(zhì)量平均增長61.1%；灌胃給予姬松茸多糖15.0 g/kg，小鼠無一死亡，僅出現(xiàn)輕微的不適，該劑量相當(dāng)于成人一日攝入115.4 g姬松茸多糖，相當(dāng)于食入姬松茸881～1 265 g。結(jié)論：姬松茸多糖能增強小鼠的免疫調(diào)節(jié)功能，且急性毒性甚微。

姬松茸多糖；免疫調(diào)節(jié)；急性毒性；改進宼氏法

姬松茸（Agaricus blazei Murrill）又稱巴西蘑菇、小松菇，原產(chǎn)于美國加利福尼亞州南部、南美巴西等地，是當(dāng)今世界上可栽培的珍稀食用菌之一，也是一種食藥兼用的名貴真菌。姬松茸所含的多糖具有廣泛的藥理活性，在抗腫瘤活性[1-4]、增強機體免疫功能[5-6]、抗皰疹病毒[7]、影響造血功能和保護肝[8-9]等方面研究較多，而關(guān)于姬松茸多糖對哺乳動物免疫功能的影響及應(yīng)用安全性的研究甚少，其急性毒性未見明確報道。本實驗通過觀察姬松茸多糖對小鼠碳粒吞噬廓清能力的影響及對小鼠免疫器官胸腺、脾臟指數(shù)的影響，分析和判斷姬松茸多糖的免疫活性；并觀察了灌胃與靜脈給予姬松茸多糖的急性毒性作用，對姬松茸的食用安全性及姬松茸多糖的使用安全性做出初步評價，為進一步開發(fā)姬松茸提供基礎(chǔ)研究資料。

1 材料與方法

1.1 動物

昆明種健康小鼠（合格證號：SCXK津2010-0002），體質(zhì)量11～15 g，3～5 周齡；體質(zhì)量18～22 g，6～8 周齡，雌雄兼用 天津市實驗動物中心。

1.2 材料與試劑

姬松茸多糖（純度40%，配制成實驗所需濃度溶液） 天津市食品研究所；固體明膠 美國Sigma公司；印度墨汁 天津達科生物科技有限公司。

1.3 儀器與設(shè)備

UV-7504單光束紫外-可見分光光度計 上海欣茂儀器有限公司；AUY120電子分析天平 日本島津公司。

1.4 姬松茸多糖對小鼠免疫器官胸腺和脾臟指數(shù)的影響

取18～22 g和11～15 g小鼠各48 只，均雌雄各半；各按體質(zhì)量分層隨機分為4 組，即生理鹽水組，姬松茸多糖低、中、高劑量組（成年鼠：姬松茸多糖低、中、高劑量組分別為96、120、150 mg/（kg?d）；未成年鼠：姬松茸多糖低、中、高劑量組分別為77、96、120 mg/（kg?d）），每組12 只。各組均按20 mL/kg灌胃給藥，每天一次，連續(xù)7 d。末次給藥后1 h，處死小鼠并進行解剖，取出胸腺、脾臟，吸去表面血跡，用分析天平稱其質(zhì)量，按式（1）計算胸腺和脾臟指數(shù)。

1.5 姬松茸多糖對小鼠網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)吞噬廓清血流中惰性碳粒能力的影響

昆明小鼠48 只，體質(zhì)量18～22 g，雄性，分組與給藥同1.4節(jié)。末次給藥24 h后，小鼠尾靜脈注射4 倍稀釋的印度墨汁10 mL/kg，立即記時（注射不成功者舍棄），注射墨汁后30 s及6 min，分別于小鼠眶下采血0.05 mL，吹入4 mL 0.1% Na2CO3溶液中。處死小鼠，取肝臟、脾臟及胸腺，用分析天平稱其質(zhì)量。將溶血的Na2CO3溶液搖勻，在675 nm波長處進行比色，記錄吸光度A，按照式（2）計算吞噬指數(shù)κ、按照式（3）計算吞噬系數(shù)（校正吞噬指數(shù)）α[10]及按式（4）計算各指數(shù)的增長率。

式中：t1、t2分別表示注入墨汁30 s和6 min；c1、c2表示t1、t2時刻血液中碳粒的濃度；m表示體質(zhì)量/g；mt表示肝脾及胸腺總質(zhì)量/g。將用藥組與對照組進行比較，分析姬松茸多糖的免疫調(diào)節(jié)作用。

1.6 靜脈注射姬松茸多糖的急性毒性

采用改進寇氏法。經(jīng)預(yù)實驗探索出姬松茸多糖靜脈注射的100%致死劑量為1 200 mg/kg；0%致死量為560 mg/kg。根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果確定正式實驗分4 個劑量組，并求出對數(shù)劑量組間距為 0.110 3，符合要求。

昆明小鼠50 只，體質(zhì)量18～22 g，雌雄各半，隨機分為5 組，每組10 只。1～4 組小鼠尾靜脈注射不同劑量的姬松茸多糖，容量均為20 mL/kg，5 組注射等容量的生理鹽水。注射后密切觀察小鼠的反應(yīng)及死亡情況。第2天起，每天觀察2 次，連續(xù)觀察14 d。注射后死亡的小鼠立即進行尸檢，未死亡的小鼠14 d后進行解剖。統(tǒng)計各組小鼠的死亡數(shù)，按照式（5）～（7）計算LD50和LD50的95%可信限。

式中：Xm為最高劑量的對數(shù)；i為劑量對數(shù)的組間距；P為各組死亡概率（取小數(shù)）；n為各組例數(shù)，s （lgLD50）為lgLD50的標(biāo)準(zhǔn)誤。

1.7 灌胃給藥測定姬松茸多糖的最大耐受量

經(jīng)預(yù)實驗，灌胃給予姬松茸多糖25 mL/kg（0.2 g/mL），共3 次，僅見小鼠出現(xiàn)活動減少、呼吸略顯急促，未見其他癥狀及改變。故正式實驗測定小鼠對該劑量姬松茸多糖的耐受程度。

取小鼠20 只，雌雄各半，隨機分為2 組，第1組為生理鹽水，第2組為姬松茸多糖。各組均以25 mL/kg灌胃給藥，24 h內(nèi)給藥3 次，間隔6 h，給藥后密切觀察小鼠的反應(yīng)。第2天起每日觀察2 次，連續(xù)觀察14 d。記錄小鼠的各項反應(yīng)、死亡情況及每日攝食量，并于第7天和第14天稱量各小鼠的體質(zhì)量，按照式（8）計算食物利用率。

1.8 統(tǒng)計分析方法

2 結(jié)果與分析

2.1 姬松茸多糖對小鼠免疫器官胸腺和脾臟指數(shù)的影響

表1 姬松茸多糖對幼年小鼠胸腺指數(shù)及脾臟指數(shù)的影響（x±s，n=12）Table 1 Effects of Agaricus blazei polysaccharide on the proliferationn of thymus and spleen in juvenile mice (x ±s, n=12)

表2 姬松茸多糖對成年小鼠胸腺指數(shù)及脾臟指數(shù)的影響（x±s，n=12）Table 2 Effects of Agaricus blaazzeeii polysaccharide on the proliferation of thymus and spleen in adult mice （x±s，n=12）

由表1、2可知，姬松茸多糖能不同程度地促進小鼠胸腺和脾臟的增殖（與生理鹽水組比，均無顯著性差異），等劑量的姬松茸多糖對幼年小鼠胸腺指數(shù)增長的影響比較明顯，而對成年小鼠則主要影響脾臟的增殖。

2.2 姬松茸多糖對小鼠網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)吞噬廓清血流中惰性碳粒能力的影響

表3 姬松茸多糖對小鼠碳粒廓清能力的影響（x±s，n=12）Table 1 Effects of Agaricus blazzeeii polysaccharide on the ability of the reticuloendothelial system to clear inert carbon particles from bloodstreeaamm （x±s，n=12）

由表3可知，各劑量組姬松茸多糖對吞噬指數(shù)和吞噬系數(shù)的影響均呈規(guī)律性增加，具有較明顯的劑量依賴性，表明姬松茸多糖能促進小鼠網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的增殖，提高機體的非特異性免疫功能。

2.3 靜脈注射姬松茸多糖的急性毒性

2.3.1 急性毒性反應(yīng)

尾靜脈注射姬松茸多糖后，出現(xiàn)顫抖、抽搐、呼吸急促、大小便失禁等反應(yīng)，在注射10 s～1 min內(nèi)死亡。將死亡小鼠解剖，肉眼觀察小鼠的肝、腎、心臟、脾、腎上腺、胸腺等臟器，均未見異常改變。其余小鼠先出現(xiàn)活動減少、呼吸急促、對刺激反應(yīng)遲鈍、嗜睡等現(xiàn)象，但持續(xù)十幾秒至10 min后逐漸恢復(fù)，其余各項觀察指標(biāo)未見異常。觀察14 d后，各劑量組存活小鼠體質(zhì)量平均增長59.7%，與生理鹽水組相近。解剖后，各主要臟器未見明顯改變，臟器指數(shù)各組無明顯差別。

2.3.2 LD50及LD50的95%可信限

表4 姬松茸多糖靜脈注射LD測定結(jié)果Table 4 Results of LDD5500by intravenous injection of Agaricus blazzeeii polysacchaarriiddee

由表4可知，小鼠靜脈注射姬松茸多糖的LD50為840.8 mg/kg，LD50的95%可信限為780.5～906.1 mg/kg。生理鹽水組小鼠未見任何不良反應(yīng)。

2.4 姬松茸多糖灌胃給藥的最大耐受量

表5 灌胃給予姬松茸多糖小鼠體質(zhì)量及食物利用情況（x ±s，n=10）Table 5 Body weight and food utilization ratio affected by orally administeerreedd Agaricus blazzeeii polysacchariiddee (x ±s,n=10)

由表5可知，小鼠灌胃后，各組均未見死亡。姬松茸多糖組部分小鼠的表現(xiàn)與靜脈注射后相似，出現(xiàn)活動減少，呼吸急促，但僅持續(xù)數(shù)分鐘，其余未見異常，2 周后體質(zhì)量平均增長61.1%，與生理鹽水組（67.2%）相近（P＞0.05），兩組小鼠的食物利用率相等。24 h內(nèi)灌胃姬松茸多糖15.0 g，相當(dāng)于70 kg成人24 h內(nèi)食入姬松茸多糖115.4 g，小鼠僅出現(xiàn)輕度不適反應(yīng)，未見死亡，機體可耐受此劑量。

3 討 論

3.1 姬松茸多糖對小鼠免疫功能的調(diào)節(jié)作用

胸腺和脾臟為機體主要的免疫器官。胸腺為初級淋巴器官，游走的造血干細(xì)胞進入胸腺，在此分化增殖成T淋巴細(xì)胞（T細(xì)胞），與細(xì)胞免疫有關(guān)。脾臟為次級淋巴器官，免疫活性細(xì)胞移行于此，并在此處因受免疫過程中異體抗原刺激而進一步增殖分化和成熟，脾臟中有T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞（B細(xì)胞），與體液免疫、細(xì)胞免疫均有密切關(guān)系。一些多糖可使胸腺或脾臟增重[10-11]。

網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)（reticuloendothelial system，RES）是機體最重要的防御系統(tǒng)，它具有強大而迅速的吞噬廓清異體顆粒或某些可溶性異物的能力。當(dāng)靜脈注射特定大小的惰性碳粒后，它即可被RES細(xì)胞吞噬而從血流中廓清。因此，可以借助測定血流中碳粒的消失速度來反映RES吞噬異物的能力[10]。

本實驗觀察了姬松茸多糖對小鼠免疫器官指數(shù)及對網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)吞噬功能的影響。結(jié)果顯示，給小鼠灌胃姬松茸多糖77.0～150.0 mg/（kg?d），連續(xù)7 d可促進小鼠胸腺和脾臟的增殖，對未成年小鼠主要影響胸腺，對成年小鼠主要影響脾臟。90.0～150.0 mg/（kg?d）姬松茸多糖連續(xù)灌胃7 d，能促進小鼠網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)吞噬處理血流中惰性碳粒的能力。上述影響均具有較明顯的劑量依賴性，反映了姬松茸多糖對小鼠的非特異性免疫功能與特異性免疫功能均有增強作用。

在日本、中國和韓國，許多食用菌類被用于治療疾病，如抗腫瘤、抗炎等已有了幾百年的歷史。蘑菇多糖通過刺激免疫效應(yīng)細(xì)胞，如造血干細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等，調(diào)節(jié)細(xì)胞因子如TNF-α等的分泌，增加信使NO的產(chǎn)生，直接或間接產(chǎn)生抗腫瘤、抗菌消炎等作用；姬松茸多糖還可通過調(diào)節(jié)激素的水平而抑制腫瘤組織的生長[12-15]。本實驗研究結(jié)果也為姬松茸多糖的應(yīng)用提供了一定依據(jù)。

3.2 姬松茸多糖的急性毒性

文獻報道，腹腔注射姬松茸多糖1 g/kg，連續(xù)7 d，小鼠精神狀態(tài)、飲食良好，無異常反應(yīng)[9]。將含姬松茸多糖水提取物的飼料（相當(dāng)于姬松茸2 654～2 965 mg/（kg·d））喂飼大鼠90 d，大鼠無一死亡，未引起明顯的毒性[16]。

本實驗中，給小鼠靜脈注射一定劑量的姬松茸多糖后，部分小鼠出現(xiàn)抽搐、呼吸困難、大小便失禁等，并在1 min內(nèi)死亡。死亡小鼠尸檢，主要臟器肉眼未見病理改變，臟器指數(shù)與生理鹽水組無明顯差別。生存小鼠僅在注射后的短時間內(nèi)出現(xiàn)活動減少、呼吸急促、對輕微刺激反應(yīng)遲鈍等，10 min內(nèi)恢復(fù)正常。觀察期內(nèi)，小鼠體質(zhì)量增長與生理鹽水組相近。存活小鼠主要臟器未見病理改變。該實驗結(jié)果顯示，姬松茸多糖的LD50為840.8 mg/kg，相當(dāng)于70 kg成人一次靜脈注射姬松茸多糖6.5 g。

小鼠24 h內(nèi)灌胃給予姬松茸多糖15.0 g/kg（分3 次，間隔6 h），在灌胃后的1 h內(nèi)，個別小鼠出現(xiàn)輕度的不適。連續(xù)觀察14 d，小鼠無一死亡，14 d后體質(zhì)量平均增長61.1%。灌胃姬松茸多糖15.0 g/kg相當(dāng)于70 kg成人24 h食入純姬松茸多糖115.4 g。

有文獻報道，從姬松茸中提取多糖的得率為9.12%～13.10%[17-18]。據(jù)此分析，成人攝入115.4 g純姬松茸多糖相當(dāng)于食入姬松茸約881～1 265 g，無明顯毒性反應(yīng)；靜脈注射姬松茸多糖的LD50為840.8 mg/kg，相當(dāng)于6.418～9.219 g姬松茸中多糖的含量。

根據(jù)實驗結(jié)果推測，姬松茸與姬松茸多糖的毒性屬實際無毒級別[19]，食用安全、可靠，具有進一步研究與開發(fā)價值。

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Immune-Enhancing Effects and Acute Toxicity of Agaricus blazei Polysaccharide in Mice

WANG Li-juan1,2, ZHANG Yan-qing1,2, WANG Yong2, CAO Jin-yan2, LI Na2
(1. Tianjin Key Laboratory of Food Technology, Tianjin 300134, China; 2. School of Biotechnology and Food Science, Tianjin University of Commerce, Tianjin 300134, China)

Objective: This study aimed to examine the immune-regulatory effect and acute toxicity of Agaricus blazei polysaccharide in mice. Methods: The effects of Agaricus blazei polysaccharide on immunological organs in mice and the ability of the reticuloendothelial system to clear inert carbon particles from bloodstream were observed in order to explore the immunoregulatory effect on mammals. By using an improved Karber’s method, the acute toxicity of Agaricus blazei polysaccharide was studied. Results: Agaricus blazei polysaccharide (77–150 mg/kg, ig, 7 d) could promote cell proliferation in the thymus and spleen. Agaricus blazei polysaccharide at 120 mg/kg caused an increase in proliferation rates of thymus and spleen of 13.1% and 8.5% for juvenile mice and of 4.0% and 18.3% for adult mice, respectively. Agaricus blazei polysaccharide at 150 mg/kg increased the phagocytic index by 21.7% in the carbon particle clearance test, and enhanced the corrected phagocytic index by 11.8% in mice, indicating that Agaricus blazei polysaccharide can promote immune function in mice. The LD50of Agaricus blazei polysaccharide by intravenous injection was 840.8 mg/kg, equivalent to intravenous injection of 6.5 g of Agaricus blazei polysaccharide into an adult one time. After two weeks, the body weight of the survived mice was increased by 61.1% on average. After oral administration of Agaricus blazei polysaccharide at 15.0 g/kg, only mild discomfort occurred and all mice were alive. This dose is relatively equivalent to an intake of 115.4 g of Agaricus blazei polysaccharide for adults per day, and is also equivalent to an ingestion of 881–1 265 g of Agaricus blazei. Conclusion: Agaricus blazei polysaccharide can enhance immune function in mice with minimal acute toxicity.

Agaricus blazei polysaccharide; immunoregulation; acute toxicity; improved Karber’s method

R151.1

A

1002-6630（2014）13-0258-04

10.7506/spkx1002-6630-201413051

2013-09-23

天津市科技支撐計劃重點項目（12ZCZDNC01400）

王麗娟（1961—），女，教授，碩士，主要從事功能食品與食品毒理學(xué)研究。E-mail：wljuan@tjcu.edu.cn