王亞杰，張國(guó)文*

（南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330047）

桑色素對(duì)黃嘌呤氧化酶活性的抑制作用

王亞杰，張國(guó)文*

（南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330047）

在磷酸鹽緩沖體系（pH 7.5）中，利用紫外光譜法、熒光光譜法和圓二色譜法，結(jié)合分子模擬技術(shù)研究了桑色素對(duì)黃嘌呤氧化酶（xanthine oxidase，XO）活性的抑制機(jī)理。結(jié)果表明：桑色素是一種有效的可逆性混合型抑制劑，其半數(shù)抑制濃度（IC50）和抑制常數(shù)（Ki）分別為1.35×10–5mol/L和1.21×10–5mol/L；桑色素通過(guò)疏水作用力與XO形成基態(tài)復(fù)合物導(dǎo)致XO內(nèi)源熒光的猝滅，并誘導(dǎo)XO的二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變；分子模擬結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)桑色素主要通過(guò)疏水作用力結(jié)合到 XO的活性中心，與Phe914、Phe649、Phe1009、Leu648、Leu1014和Leu873等主要氨基酸發(fā)生作用。推測(cè)桑色素進(jìn)入XO的疏水腔，阻礙了底物黃嘌呤進(jìn)入XO活性中心并影響了XO活性中心的形成，從而抑制了XO對(duì)黃嘌呤的催化活性。

桑色素；黃嘌呤氧化酶；抑制動(dòng)力學(xué)；結(jié)合性質(zhì)；光譜技術(shù)；分子模擬

黃嘌呤氧化酶（xanthine oxidase，XO）是體內(nèi)核酸代謝中重要的酶，能催化次黃嘌呤和黃嘌呤生成尿酸[1]。當(dāng)體內(nèi)XO活性過(guò)高，會(huì)引起尿酸生成過(guò)多，過(guò)高的尿酸將導(dǎo)致高尿酸血癥，進(jìn)而引發(fā)痛風(fēng)[2]。痛風(fēng)已成為繼糖尿病之后的第二大代謝性疾病，這種疾病已被聯(lián)合國(guó)列為21世紀(jì) 20大頑癥之一[3]。最新的流行病學(xué)研究表明，由于生活水平不斷提高、飲食結(jié)構(gòu)的不合理和生活節(jié)奏的加快，我國(guó)痛風(fēng)的發(fā)病率逐年上升，已高于世界平均水平[3]。由于XO是人體內(nèi)產(chǎn)生尿酸過(guò)程中的一種關(guān)鍵性酶，因而將XO作為作用靶點(diǎn)，抑制其活性成為了臨床治療痛風(fēng)的主要途徑。目前，別嘌呤醇是用于臨床治療痛風(fēng)的主要藥物，由于會(huì)引起過(guò)敏、肝腎損傷及骨髓抑制等不良反應(yīng)，這在一定程度上限制了其臨床應(yīng)用[4]。因此，研究開(kāi)發(fā)新的XO抑制劑是一項(xiàng)重要的課題。

桑色素（morin）是一種存在于洋蔥、番石榴葉和海藻等植物中的黃酮類化合物[5]，具有抗炎、抗菌、抗病毒和抗腫瘤等生物活性[6-8]。有文獻(xiàn)報(bào)道桑色素對(duì)XO具有良好的抑制活性[9]，但其與XO的結(jié)合性質(zhì)和抑制機(jī)理尚不明確。因此，本實(shí)驗(yàn)利用紫外、熒光和圓二色譜等光譜方法并結(jié)合分子模擬技術(shù)探測(cè)桑色素與XO的結(jié)合作用及其抑制XO活性的分子機(jī)理，以期為桑色素作為XO抑制劑的開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

桑色素（分析級(jí)，純度≥98%），購(gòu)于阿拉丁試劑有限公司，用pH 7.5的磷酸鹽緩沖液配制成濃度為5.0×10－3mol/L的貯備液（含10%二甲基亞砜）。

牛乳黃嘌呤氧化酶（EC 1.17.3.2，酶活力35.7 U/mL，用pH 7.5的磷酸鹽緩沖液現(xiàn)配現(xiàn)用）、黃嘌呤和別嘌呤醇 美國(guó)Sigma公司；其他試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

UV-2450型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 日本島津公司；F-7000型熒光光度計(jì) 日本日立公司；MOS-450型圓二色譜儀 法國(guó)Bio-Logic公司；pHS-3C型酸度計(jì) 上海雷磁儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 桑色素對(duì)XO的抑制作用

參考Yan Jiakai等[10]的實(shí)驗(yàn)方法，將7.5×10－8mol/L XO和不同濃度的桑色素于37 ℃條件下孵化2.5 h，放至室溫后加入一定濃度（5.0×10－5mol/L）的底物黃嘌呤，測(cè)定295 nm波長(zhǎng)處的光密度值，計(jì)算含不同濃度桑色素體系中XO的相對(duì)活性。

固定底物濃度（5.0×10－5mol/L），測(cè)定不同濃度桑色素條件下，酶活力（用’OD295nm表示，下同）隨XO濃度的變化，根據(jù)其相關(guān)性判斷桑色素對(duì)XO的抑制可逆性。

固定XO濃度（7.5×10－8mol/L），測(cè)定不同濃度桑色素條件下，’OD295nm隨底物濃度的變化，以Lineweaver-Burk雙倒數(shù)方程作圖，判斷桑色素對(duì)XO的抑制類型，并計(jì)算抑制常數(shù)（Ki）。

1.2.2 桑色素與XO作用的熒光光譜和圓二色譜研究

在2 mL反應(yīng)體系中，固定XO濃度，逐次加入一定體積（5 ?L/次）桑色素溶液，混合均勻后靜置5 min，分別掃描XO和桑色素-XO體系的熒光光譜（激發(fā)波長(zhǎng)為280 nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫均為5 nm）。

在190～250 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)，分別測(cè)定不同濃度比的桑色素-XO體系的圓二色譜。通過(guò)在線Dichroweb軟件（http://dichroweb.cryst.bbk.ac.uk/html/home.shtml）計(jì)算與桑色素作用前后XO的二級(jí)結(jié)構(gòu)含量。

1.2.3 分子 模擬

根據(jù)文獻(xiàn)[11]下載XO的晶體模型（PDB ID: 3ETR），并利用Chem3D Ultra 8.0軟件獲得桑色素的3D結(jié)構(gòu)。通過(guò)AutoDock4.2軟件結(jié)合Lamarckian Genetic Algorithm算法[12]進(jìn)行處理分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 桑色素對(duì)XO的抑制率

圖1 桑色素對(duì)XO的抑制作用Fig.1 Inhibitory effect on XO of morin

如圖1所示，隨著桑色素的加入，XO的相對(duì)活性不斷降低，桑色素對(duì)酶的抑制作用呈現(xiàn)一定的濃度依賴關(guān)系；桑色素和別嘌呤醇（陽(yáng)性對(duì)照）的IC50分別為1.35×10–5mol/L和1.79×10–6mol/L，表明桑色素對(duì)XO具有一定的抑制效果，其IC50與Yu Zhifeng等[9]得到的IC50值為（1.80±0.25）×10–5mol/L一致。

2.2 桑色素對(duì)XO的抑制類型分析

圖2 桑色素對(duì)XO的抑制可逆性Fig.2 Inhibitory reversibility of morin on XO

由圖2可逆性實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，不同濃度桑色素存在下，’OD295nm與XO濃度變化為線性關(guān)系且都經(jīng)過(guò)原點(diǎn)，表明桑色素對(duì)XO的抑制作用是可逆的[13]。

根據(jù)Lineweaver-Burk雙倒數(shù)方程作圖（圖3）得一組相交于第二象限的直線，桑色素的存在引起酶的Km值增大，Vm值減小，表明桑色素對(duì)XO抑制類型為混合抑制[14]。以直線的斜率和截距對(duì)桑色素濃度作圖（圖3插圖），均呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，表明桑色素在XO上只有一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)[15]。計(jì)算出Ki和抑制系數(shù)（α）分別為1.21×10–5mol/L和1.94。

圖3 桑色素對(duì)XO的抑制類型Fig.3 Inhibitory type of morin on XO

2.3 桑色素猝滅XO的熒光光譜

圖4 桑色素-XO體系的熒光猝滅圖和Stern-Volmer圖Fig.4 Fluorescence quenching spectra and Stern-Volmer plot (inset) of morin-XO system

圖4 顯示XO在342 nm波長(zhǎng)處有一強(qiáng)的熒光發(fā)射峰（主要由色氨酸和酪氨酸產(chǎn)生）。隨著溶液中桑色素濃度不斷增加，XO的熒光峰強(qiáng)度逐漸降低，但峰的位置沒(méi)有發(fā)生移動(dòng)，表明桑色素與XO發(fā)生了相互作用，但對(duì)色氨酸和酪氨酸微環(huán)境的極性沒(méi)有明顯的影響[16]。

表1 不同溫度下桑色素-XO體系的猝滅常數(shù)（Ksv）、結(jié)合常數(shù)（Ka）、結(jié)合位點(diǎn)數(shù)（n）及熱力學(xué)參數(shù)Table 1 Quenching constant (Ksv), association constant (Ka), the number of binding sites (n) and thermodynamic parameters of morin-XO system at different temperatures

根據(jù)Stern-Volmer及其修正方程[17]：F0/F = 1+Kqτ0[Q] = 1+Ksv[Q]，F(xiàn)0/（F0－F） = （1/”aKa[Q]）+1/”a，lg[（F0－F）/F]= lgKb+nlg[Q]，分別求得3 個(gè)溫度（298、304、310 K）條件下的猝滅常數(shù)（Ksv）、結(jié)合常數(shù)（Ka）和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)（n），列于表1中。Ksv隨著溫度的升高而減小且猝滅速率常數(shù)Kq值遠(yuǎn)大于生物分子的最大擴(kuò)散速率常數(shù)值（2×1010L/（mol·s））[18]，表明桑色素對(duì)XO熒光猝滅為形成桑色素-XO復(fù)合物的靜態(tài)猝滅過(guò)程。不同溫度下結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n≈1，表明桑色素在XO上存在唯一的結(jié)合位點(diǎn)，與抑制類型分析結(jié)果一致。

由熱力學(xué)關(guān)系式：l g Ka=－’H/2.3 0 3 R T+’S/2.303R，’G = ’H－T’S，求得焓變（’H）、熵變（’S）和生成自由能變（’G），結(jié)果如表1所示?！疓＜0，表明桑色素與XO的作用過(guò)程是一個(gè)Gibbs自由能降低的自發(fā)過(guò)程，’H＞0、’S＞0，表明桑色素與XO的結(jié)合是一個(gè)吸熱和熵驅(qū)動(dòng)過(guò)程[19]，疏水作用力是桑色素與XO結(jié)合的主要驅(qū)動(dòng)力[20]。

2.4 桑色素對(duì)XO二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響

圖5 桑色素-XO體系的圓二色譜圖Fig.5 CD spectra of morin-XO system

圖5 顯示XO在216 nm波長(zhǎng)處有明顯的負(fù)峰（β-折疊特征峰）[21]，當(dāng)加入桑色素后峰強(qiáng)度減?。ㄏ蛄闼揭苿?dòng)），但峰位置未發(fā)生變化，表明桑色素誘導(dǎo)XO結(jié)構(gòu)發(fā)生一定的變化。通過(guò)在線SELCON3程序計(jì)算出XO與桑色素作用前后的二級(jí)結(jié)構(gòu)含量（表2）。桑色素的加入引起XO的α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角含量有稍許升高，而β-折疊和無(wú)規(guī)則卷曲含量顯示一定的降低，表明桑色素與XO結(jié)合導(dǎo)致XO的二級(jí)結(jié)構(gòu)更加緊密，抑制了酶活性中心的形成[10]。

表2 桑色素存在下XO的二級(jí)結(jié)構(gòu)含量Table 2 Secondary structure contents of XO in the presence of morin

2.5 分子模擬

為了直觀地展現(xiàn)桑色素與XO的結(jié)合模式和空間結(jié)構(gòu)，利用分子模擬技術(shù)進(jìn)行分析。圖6A是進(jìn)行100次分子對(duì)接所產(chǎn)生的39 個(gè)結(jié)合區(qū)域（能量簇），每個(gè)柱形表示在該區(qū)域結(jié)合的次數(shù)，其中結(jié)合次數(shù)最多的區(qū)域結(jié)合可能性最大，且結(jié)合能量越低復(fù)合物結(jié)構(gòu)越穩(wěn)定，因此將結(jié)合次數(shù)最多（27 次）且結(jié)合能最低（-3.66 kcal/mol）時(shí)的結(jié)合姿態(tài)作為桑色素與XO結(jié)合的分析模型，如圖6B所示。桑色素分子進(jìn)入XO的疏水空腔，其B環(huán)插入到疏水性氨基酸殘基Phe914、Phe1014和Phe649之間，與它們形成π—π共軛體系，這在XO識(shí)別配體過(guò)程中起重要作用[22]。此外，桑色素的苯并呋喃環(huán)與活性中心（含Mo區(qū)域）周圍的其他主要氨基酸殘基Ser1075、Pro1076、Asn768、Lys771、Leu648和Leu1014等發(fā)生作用。表明桑色素主要通過(guò)疏水作用力與活性中心附近的氨基酸殘基發(fā)生作用，這與熱力學(xué)分析結(jié)果一致。

圖6 桑色素與XO的分子對(duì)接Fig.6 The molecular docking of morin and XO

3 結(jié) 論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，桑色素是一種可逆的混合型抑制劑，其半數(shù)抑制濃度和抑制常數(shù)分別為1.35×10–5mol/L和1.21×10–5mol/L。桑色素進(jìn)入XO的疏水腔，通過(guò)疏水作用力與XO活性中心周圍的主要氨基酸殘基發(fā)生作用，并誘導(dǎo)XO的二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。推測(cè)桑色素進(jìn)入XO的疏水腔，占據(jù)了底物黃嘌呤進(jìn)入活性中心的通道，并使XO的結(jié)構(gòu)更加緊密不利其形成活性中心，從而有效地抑制了XO對(duì)黃嘌呤的催化活性。

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Inhibition Effect of Morin on Xanthine Oxidase Activity

WANG Ya-jie, ZHANG Guo-wen*
(State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047, China)

The inhibition mechanism of morin on xanthine oxidase (XO) in phosphate buffer (pH 7.5) was investigated by UV-vis absorption, fluorescence and circular dichroism spectroscopy combined with molecular simulation technique. The results showed that morin could be a good reversible XO inhibitor in a mixed-type manner with an inhibitory oncentrationleading to a 50% loss in the activity (IC50) and an inhibition constant (Ki) of 1.35 × 10–5mol/L and 1.21 × 10–5mol/L,respectively. Strong fluorescence quenching and secondary str ucture changes of XO were observed due to the formation of a complex with morin. The results from molecular simulation have further confirmed that morin was mainly bound to the active site of XO where it interacted with some primary amino acid residues such as Phe914, Phe649, Phe1009, Leu648, Leu1014, Leu873, etc. by hydrophobic force. It could be concluded that morin inhibited XO catalytic activity by entering into XO’s hydrophobic cavity, blocking the insertion of substrate xanthine and influencing the formation of active center.

morin; xanthine oxidase; inhibition kinetics; binding characteristics; spectroscopic techniques; molecular simulation

TS207.3

A

1002-6630（2014）13-0143-04

10.7506/spkx1002-6630-201413027

2014-05-09

國(guó)家自然科學(xué)基金地區(qū)科學(xué)基金項(xiàng)目（31060210）；江西省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（20142BAB204001）；

食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目（SKLF-ZZB-201305；SKLF-ZZA-201302；SKLF-KF-201203）

王亞杰（1988—），男，碩士，研究方向?yàn)楣δ苁称烽_(kāi)發(fā)與利用。E-mail：1025579088@qq.com

*通信作者：張國(guó)文（1966—），男，教授，博士，研究方向?yàn)槭称钒踩c食品化學(xué)。E-mail：gwzhang@ncu.edu.cn