鄭 署，施文君，王曉曦，李 靜，谷 雪，閆 超,*

（1.上海交通大學(xué)藥學(xué)院，上海 200240；2.上海通微分析技術(shù)有限公司，上海 201203）

加壓毛細(xì)管電色譜-紫外法檢測復(fù)方維生素片中4 種脂溶性維生素

鄭 署1，施文君1，王曉曦1，李 靜2，谷 雪1，閆 超1,*

（1.上海交通大學(xué)藥學(xué)院，上海 200240；2.上海通微分析技術(shù)有限公司，上海 201203）

采用反相加壓毛細(xì)管電色譜-紫外檢測，建立一種高效、簡便、快速的脂溶性維生素分析方法，并用于復(fù)合維生素片中脂溶性維生素的檢測。使用C18反相毛細(xì)管色譜柱，以含0.05%三氟乙酸的95%甲醇溶液（pH 3.3）為流動相進(jìn)行等度洗脫，泵總流速為0.2 mL/min，分離電壓為15 kV，并針對脂溶性維生素樣品個體間紫外吸收波長差別較大的問題，采用波長時間程序進(jìn)行檢測。VA、VD3、VE、VK3四種脂溶性維生素可在5 min內(nèi)實現(xiàn)快速分離。各組分的最低檢出限（RSN=3）分別為1.5、3.0、15、1.5 μg/mL，線性關(guān)系良好，樣品加標(biāo)回收率在90.0%～110.0%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.53%～5.46%。將所建立方法應(yīng)用于維生素片樣品分析，取得了良好的分析結(jié)果。該方法簡單方便、重復(fù)性好、準(zhǔn)確可靠。

加壓毛細(xì)管電色譜；紫外檢測；脂溶性維生素；復(fù)合維生素片

維生素是人和動物維持正常的生理功能而必需從食物中獲得的一類微量有機(jī)物質(zhì)，在人體生長、代謝、發(fā)育過程中發(fā)揮著重要的作用。維生素是個龐大的家族，目前所知的維生素就有幾十種，大致可分為脂溶性和水溶性兩大類。脂溶性維生素主要包括VA、VD、VE和 VK。VA和VD主要儲存于肝臟，VE主要存于體內(nèi)的脂肪組織，而VK儲存較少。它們是人體所需要的微量營養(yǎng)成分，對人體的生理活動有非常重要的作用。目前，脂溶性維生素的檢測方法有膠束電動色譜法[1]、高效液相色譜法[2-3]、薄層色譜法[4]、熒光法[5-7]、電色譜法[8]等，其中高效液相色譜法是應(yīng)用最多、最廣的方法，但同時測定脂溶性維生素（VA、VD、VE、VK）的文獻(xiàn)報道較少，且常規(guī)液相色譜法的分離時間長，試劑樣品耗費多。因此，建立一種更為簡便、快速、經(jīng)濟(jì)的多組分脂溶性維生素分離檢測的方法則成為必然趨勢。

加壓毛細(xì)管電色譜（pressurized capillary electrochromatography，pCEC）是近年發(fā)展起來的一種新興微分離技術(shù)，同時具備高效液相色譜的高選擇性和毛細(xì)管電泳的高柱效。其特征是電滲流和壓力流同時驅(qū)動流動相，由于在流動相和固定相中分配系數(shù)的不同以及電泳淌度的差異，樣品被快速、高效地分離。pCEC系統(tǒng)結(jié)構(gòu)簡單，特點突出，通用性和穩(wěn)定性好，并可與多種檢測技術(shù)進(jìn)行聯(lián)用，目前已廣泛應(yīng)用于環(huán)境分析[9]、藥物分析[10-13]、食品安全檢測[14]、生命科學(xué)[15-16]等研究領(lǐng)域。

本研究基于pCEC微分離平臺，建立了波長時間程序檢測維生素片中脂溶性VA、VD3、VE、VK3的多組分同時分離檢測的加壓毛細(xì)管電色譜法，該方法簡單快速、靈敏度高、重復(fù)性好、準(zhǔn)確可靠，可為常用脂溶性維生素的分離檢測提供新的途徑。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

供試品購自國大藥房有限公司。

乙腈、甲醇（均為色譜純）和磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉（均為分析純） 上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；水為二次蒸餾水；三氟乙酸（trifluoroacetic acid，TFA）（分析純） 上海安譜科學(xué)儀器有限公司；脂溶性維生素對照品：VA（批號：36952，純度＞98%）、VD3（批號：38718，純度＞98%） 阿拉丁試劑公司；D-α-VE（純度＞99%） 日本Tokyo Chemistry Industry公司；VK3（純度＞98%） 百靈威科技有限公司。

TriSepTM-2100加壓毛細(xì)管電色譜儀 美國Unimicro Technologies公司；KQ2200B型超聲波清洗器昆山超聲儀器有限公司；PB-10 pH計 北京賽多利斯儀器有限公司；FA1004電子天平 上海恒平科學(xué)儀器有限公司；AS5150A超聲波清洗機(jī) 天津奧特賽思斯儀器有限公司；HP-01無油真空泵 天津恒奧科技發(fā)展有限公司；C18毛細(xì)管電色譜柱 蘇州環(huán)球色譜有限公司。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

4 種脂溶性維生素標(biāo)準(zhǔn)儲備液的配制：分別準(zhǔn)確稱取VA、VD3、VK3、VE各100 mg，置于不同燒杯中，用適量甲醇溶解，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后，分別移入10 mL棕色容量瓶中，以甲醇定容至刻度，低溫避光保存。

4 種脂溶性維生素系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制：用甲醇溶液將上述標(biāo)準(zhǔn)儲備液逐級稀釋為5、10、50 、100、300、500、1、2 mg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)混合溶液，置于冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 樣品前處理

在避光操作條件下精密稱取供試品3 g，研磨均勻后置于100 mL燒杯中，加入適量甲醇，超聲提取15 min；經(jīng)0.22 μm濾膜過濾，將濾液轉(zhuǎn)移至10 mL棕色容量瓶中；重復(fù)上述提取操作兩次，合并濾液，搖勻后以甲醇定容至刻度，低溫避光保存。

1.2.3 pCEC-UV色譜條件

色譜柱：C18毛細(xì)管電色譜柱（100 mm×100 μm，3 μm）；流動相：甲醇-水（含0.05% TFA，pH 3.3）（95∶5，V/V）；泵總流速：0.2 mL/min；檢測波長時間程序見表1；進(jìn)樣量1 μL（分流比1∶300）；電壓施加在毛細(xì)管色譜柱的出口端，進(jìn)口端接地。

表1 波長時間程序Table1 Detection wavelength-time program for four fat-soluble vitamins

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品前處理方法的選擇

脂溶性維生素的性質(zhì)不穩(wěn)定，酸堿、氧氣、光和熱均可使其分解變質(zhì)，為保證測定結(jié)果的準(zhǔn)確性和精密度，在完成樣品制備后，應(yīng)迅速制備成分析試樣進(jìn)行色譜分析。測定脂溶性維生素常用的樣品前處理方法有固相萃取法[17]、皂化法[18-19]及溶劑直接萃取法[20]。其中皂化法分為加熱回流皂化法和室溫過夜皂化法，前者需要高溫環(huán)境，對脂溶性維生素造成破壞，而后者需要較長的處理時間，一定程度上會造成脂溶性維生素變質(zhì)，影響測定結(jié)果的準(zhǔn)確度；而固相萃取法避免了皂化法的上述缺點，但是使用成本較高，操作也較為繁瑣；綜合考慮，選擇溶劑直接萃取法作為脂溶性維生素樣品的前處理方法，該方法簡便、快捷、成本低、準(zhǔn)確度高。

圖1 4種脂溶性維生素對照品的pCEC分離色譜圖Fig.1 pCEC electrochromatogram of four fat-soluble vitamins

2.2 pCEC-UV色譜條件的選擇與優(yōu)化

本研究基于加壓毛細(xì)管電色譜平臺，實驗中主要考察了波長時間程序、流動相組成、分離電壓、緩沖鹽等色譜條件對4 種脂溶性維生素分離的影響，并進(jìn)行了條件優(yōu)化，建立4 種脂溶性維生素的pCEC-UV快速分離檢測的方法，見圖1。

2.2.1 波長時間程序

表2 4 種脂溶性維生素的最大吸收波長Table2 Maximum absorption wavelengths of four fat-soluble vitamins

4 種脂溶性維生素的紫外最大吸收波長（表2）差別較大，實驗中嘗試選擇280 nm作為單一檢測波長時，發(fā)現(xiàn)VA和VE的信噪比較低；而選擇295 nm作為單一檢測波長時，VK3的信噪比又變得很低。為了提高檢測靈敏度，本研究使用波長時間程序（表1）進(jìn)行檢測，結(jié)果表明各脂溶性維生素樣品均可得到滿意的信噪比。

2.2.2 流動相的選擇

分別考察甲醇-水、乙腈-水作為流動相時對樣品分離的影響，見圖2，發(fā)現(xiàn)在乙腈-水體系條件下，VD3的信噪比較低，選擇甲醇-水體系可得到更好的結(jié)果。本實驗最終確定以甲醇-水（95∶5，V/V）作為流動相進(jìn)行等度洗脫。

圖2 脂溶性維生素在不同流動相條件下的色譜圖Fig.2 pCEC electrochromatogram of four fat-soluble vitamins under different mobile phase conditions

2.2.3 流動相中緩沖鹽的選擇與優(yōu)化

加壓毛細(xì)管電色譜分離體系中需要添加可導(dǎo)電的酸堿或者緩沖鹽溶液，以保證施加電壓后形成穩(wěn)定的電場及電滲流，實驗中分別考察TFA、磷酸鹽以及Tris-HCl緩沖體系對分離的影響。結(jié)果表明，磷酸鹽以及Tris-HCl緩沖溶液體系下，加電后的電流值過高，引起的焦耳熱效應(yīng)，造成基線噪聲較大；而添加TFA后，可有效改善色譜峰形，在確保電滲流產(chǎn)生的前提下，還可以避免維生素在反相色譜柱上的吸附。同時注意到，添加過量的TFA會造成流動相體系的pH值過低，不利于電滲流的產(chǎn)生，所以本實驗最終選擇TFA體積分?jǐn)?shù)為0.05%（pH 3.3，V/V）。

2.2.4 分離電壓的影響

電壓是pCEC實驗條件中的一個重要參數(shù)，施加不同的電壓對樣品的分離會產(chǎn)生不同的影響，在本研究中主要是對分離速度和分辨度的影響。實驗中分別考察了電壓為0、5、10、15 kV和20 kV時，4 種脂溶性維生素的分離情況。由圖3可見，伴隨著施加在毛細(xì)管出口端負(fù)電壓的增加，電滲流方向和壓力流一致，且一直呈增大趨勢，整體分析速度明顯提高。但當(dāng)分離電壓超過15 kV后，過大的電壓造成電流值急劇上升，焦耳熱效應(yīng)不但使得基線波動增大，且造成了VD3的信噪比下降。

圖3 脂溶性維生素在不同電壓條件下的色譜圖Fig.3 Effect of applied voltage on pCEC separation of four fat-soluble vitamins

實驗中發(fā)現(xiàn)VA對照品存在雜質(zhì)，在不加電的情況下兩者無法實現(xiàn)基線分離，隨著分離電壓的增大，分辨度增大（表3）。在考慮不影響定量的基礎(chǔ)上，綜合各方面因素，本實驗最終選擇15 kV作為分離電壓。

表3 不同電壓條件下VA和雜質(zhì)的分辨度Table3 Resolution of vitamin A and impurities at different voltages

2.3 分析方法學(xué)驗證

2.3.1 線性范圍和檢出限

表4 4種脂溶性維生素的線性方程、線性相關(guān)系數(shù)、線性范圍、檢出限和定量限Table4 Regression equations, correlation coefficients (r), linear ranges, limits of detection and limits of quantitation for four fat-soluble vitamins

以1.2.1節(jié)配制的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液按照本實驗方法進(jìn)行測定，以4 種脂溶性維生素的色譜峰面積（Y）與其對應(yīng)的質(zhì)量濃度X/（mg/mL）進(jìn)行線性回歸，以信噪比RSN=10計算定量限，RSN=3計算檢出限，結(jié)果見表4。4 種脂溶性維生素的線性范圍均超過兩個數(shù)量級，線性關(guān)系良好，線性相關(guān)系數(shù)均大于0.999。

2.3.2 加標(biāo)回收率和精密度

取復(fù)方維生素片樣品3 g，在線性范圍內(nèi)，添加3 個不同水平的維生素標(biāo)準(zhǔn)品，按照1.2.2節(jié)的樣品前處理方法進(jìn)行處理后進(jìn)行pCEC分析，每個樣品連續(xù)進(jìn)樣3 次，結(jié)果見表5。該方法加標(biāo)回收率在90.0%～110.0%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.53%～5.46%，表明本方法具有良好的準(zhǔn)確性和精密度。

表5 復(fù)方維生素片中4 種脂溶性維生素的加標(biāo)量、回收率及其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=3）Table5 Recoveries and relative standard deviations (RSD) of four fatsoluble vitamins in spiked vitamin tablets (n=3)

2.4 復(fù)方維生素片的分析

準(zhǔn)確稱取復(fù)合維生素片3 g，按照1.2.2節(jié)的樣品前處理方法進(jìn)行處理后，按照1.2.3節(jié)的pCEC色譜條件進(jìn)行分析，見圖4。

圖4 復(fù)合維生素片樣品中4種脂溶性維生素的pCEC色譜圖Fig.4 pCEC electrochromatogram of four fat-soluble vitamins in vitamin tablets

該品牌復(fù)方維生素片產(chǎn)品所標(biāo)注的脂溶性VA、VD3、VK3和VE均被準(zhǔn)確的檢出，根據(jù)線性方程計算其含量見表6。

表6 復(fù)方維生素片中4 種脂溶性維生素的含量Table6 Contents of four fat-soluble vitamins in vitamin tablets

3 結(jié) 論

本實驗以pCEC為平臺，在5 min內(nèi)可以完成常用4 種脂溶性維生素的同時測定。該方法簡單方便，準(zhǔn)確可靠，靈敏度較高，借助pCEC電滲流和壓力流的雙重推動力，顯著提高了分析速度和分離效能。且pCEC作為一種微分離技術(shù)，實際分析流速只在微升級甚至納升級，大大節(jié)省了檢測成本，具有實用推廣價值。

[1] DELGADO-ZAMARRENO M M, GONZALEZ-MAZA I, SANCHEZ-PEREZ A, et al. Separation and simultaneous determination of water-soluble and fat-soluble vitamins by electrokinetic capillary chromatography[J]. Journal of Chromatography A, 2002, 953(1): 257-262.

[2] 徐軍, 張慧芬, 邵裕坤, 等. 高效液相色譜法測定人血中脂溶性維生素的含量[J]. 中國藥學(xué)雜志, 2006, 41(2): 147-149.

[3] 盧燕, 許群, 陳靜, 等. 高效液相色譜多閥多柱技術(shù)同時分析水溶性和脂溶性維生素[J]. 環(huán)境化學(xué), 2012, 31(9): 1442-1447.

[4] 方海順, 周遠(yuǎn)華, 蘇廣海. 薄層色譜法快速檢測注射用脂溶性維生素(Ⅰ)[J]. 中國醫(yī)藥工業(yè)雜志, 2013, 44(5): 483-486.

[5] DUGGAN D E. Spectrofluorometric determination of tocopherols[J]. Archives of Biochemistry and Biophysics, 1959, 84(1): 116-122.

[6] HANSEN L G, WARWICK W J. A fluorometric micro method for serum tocopherol[J]. Technical Bulletin of the Registry of Medical Technologists, 1966, 36(6): 131-136.

[7] 闞健全. 熒光法同時測定食品中維生素A和維生素E的含量[J]. 營養(yǎng)學(xué)報, 1990, 12(1): 46.

[8] ATURKI Z, D’ORAZIO G, FANALI S. Rapid assay of vitamin E invegetable oils by reversed-phase capillary electrochromatography[J]. Electrophoresis, 2005, 26(4/5): 798-803.

[9] GU Congying, LIN Li, LI Bin, et al. Rapid separation and determination of microcystins using monolithic columns in isocratic elution mode by pressurized capillary electrochromatography[J]. Electrophoresis, 2008, 29(18): 3887-3895.

[10] WU Kongxian, GU Xue, YAN Chao. Study on fingerprint of ginkgo leaves by pressurized capillary electrochromatography[J]. Chinese Journal of Analytical Chemistry, 2009, 37(4): 581-584.

[11] CHENG Zhongyi, XIA Zongling, HU Chunqi, et al. Chiral separation of bisoprolol, atenolol, clenteral and terbutaline by capillary chromatography[J]. Chinese Journal of Analytical Chemistry, 2007, 35(2): 181-186.

[12] YANG Juniao, SU Xiulan, FANG Ping, et al. Analysis of resveratrol by pressurized-capillary electrochromatography[J]. Chinese Journal of Chromatography, 2004, 22(3): 270-272.

[13] 董潔瑩, 歐陽小琨, 曹國洲, 等. 加壓毛細(xì)管電色譜法測定鰻魚中5 種磺胺類藥物殘留[J]. 浙江海洋學(xué)院學(xué)報: 自然科學(xué)版, 2011, 30(5): 392-396.

[14] GARCíA-CAMPA?A A M, GáMIZ-GRACIA L, LARA F J, et al. Applications of capillary electrophoresis to the determination of antibiotics in food and environmental samples[J]. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 2009, 395(4): 967-986.

[15] 謝國祥, 邱明豐, 趙愛華, 等. 加壓毛細(xì)管電色譜法測定肥胖大鼠尿液中內(nèi)源性代謝物[J]. 分析化學(xué), 2007, 35(8): 1111-1115.

[16] WEI Juan, GU Xue, WANG Yan, et al. Two-dimensional separation system by coupling capillary isoelectric focusing to pressurized capillary electrochro-matography for peptides separation[J]. Chinese Journal of Analytical Chemistry, 2011, 39(2): 188-192.

[17] 劉紅菊, 閆沖. 固相萃取RP-HPLC同時測定復(fù)合維生素注射液中的VA棕櫚酸酯VD3和VE醋酸酯[J]. 藥學(xué)實踐雜志, 2007, 25(3): 162-164.

[18] 張戈, 張虹, 馬麗英. 乳粉維生素A, D, E的高效液相色譜測定[J]. 哈爾濱醫(yī)科大學(xué)學(xué)報, 2002, 36(2): 171; 174.

[19] 李東, 顧鵬, 蔣淑梅. 高效液相色譜法測定食品中維生素E的研究進(jìn)展[J]. 食品科學(xué), 2000, 21(6): 57-59.

[20] 海沙爾, 塔依爾. 液相色譜水-異丙醇體系測定脂溶性維生素A, D, E[J]. 光譜學(xué)與光譜分析, 2002, 22(4): 693-694.

Determination of Four Fat-Soluble Vitamins in Vitamin Tablets by Pressurized Capillary Electrochromatography with UV Detection

ZHENG Shu1, SHI Wen-jun1, WANG Xiao-xi1, LI Jing2, GU Xue1, YAN Chao1,*
(1. School of Pharmacy, Shanghai Jiaotong University, Shanghai 200240, China; 2. Unimicro (Shanghai) Technologies Co. Ltd., Shanghai 201203, China)

An effective, convenient and fast method for the analysis of fat-soluble vitamins in vitamin tablets was developed using pressurized capillary electrochromatography (pCEC) with ultra violet (UV) detection. The separations was performed on a reversed-phase C18capillary column with a certain detection wavelength-time program. The mobile phase was 95% (V/V) methanol containing 0.05% TFA (pH 3.3) at a flow rate of 0.2 mL/min with a separation voltage of 15 kV. Four fatsoluble vitamins (vitamin A, vitamin D3, vitamin E, and vitamin K3) were baseline separated within 5 min in an isocratic pCEC mode. The detection limits for vitamin A, vitamin D3, vitamin E, and vitamin K3(RSN= 3) were 1.5, 3.0, 15 and 1.5 μg/mL with good linearity, respectively. The interference on the analysis of vitamin tablets was effectively eliminated. The recoveries of spiked fat-soluble vitamin samples were 90.0%-110.0% with RSD ranging from 0.53% to 5.46%. This method is simple, rapid, repeatable and accurate.

pressurized capillary electrochromatography (pCEC); ultra-violet (UV) detection; fat-soluble vitamin; vitamin tablets

O657

A

1002-6630（2014）20-0105-05

10.7506/spkx1002-6630-201420021

2013-11-10

國家自然科學(xué)基金面上項目（21175092）；國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項目（21105064）；國家重大科學(xué)儀器設(shè)備開發(fā)專項（2011YQ150072；2011YQ15007204；2011YQ15007207；2011YQ15007210）；上海市自然科學(xué)基金項目（12ZR1413600）

鄭署（1989—），女，碩士研究生，研究方向為加壓毛細(xì)管電色譜體系的優(yōu)化及其在食品添加劑中的應(yīng)用。

E-mail：zs559618@163.com

*通信作者：閆超（1956—），男，教授，博士，研究方向為色譜分析。E-mail：chaoyan@unimicrotech.com