劉建華，王 斌，鄶 鵬，蔡燕萍，丁玉庭,*

（1.浙江工業(yè)大學海洋學院，浙江 杭州 310014；2.威海市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗所，山東 威海 264209）

金槍魚暗色肉酶解工藝及其水解物營養(yǎng)價值評價

劉建華1，王 斌1，鄶 鵬2，蔡燕萍1，丁玉庭1,*

（1.浙江工業(yè)大學海洋學院，浙江 杭州 310014；2.威海市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗所，山東 威海 264209）

利用胰蛋白酶，以金槍魚暗色肉為原料、水解度和氮回收率為指標，制備蛋白水解液。通過正交試驗得到最佳酶解條件為：加酶量2 400 U/g原料、初始pH 8.0、酶解溫度55 ℃、酶解時間6 h，在此條件下制得酶解液水解度（19.89±0.10）%、氮回收率（64.88±0.72）%。通過高效液相色譜分析酶解液分子質(zhì)量分布，結(jié)果表明酶解對大分子蛋白質(zhì)有明顯的降解作用，酶解液主要由寡肽組成，降解生成的物質(zhì)分子質(zhì)量以3 kD以下為主，1 kD以下占大部分（質(zhì)量分數(shù)79.23%）。通過對酶解液氨基酸組成的分析表明，產(chǎn)物酶解液各種氨基酸種類齊全，必需氨基酸含量豐富（質(zhì)量分數(shù)42.38%），可用作食品的營養(yǎng)補充劑。

胰蛋白酶；金槍魚暗色肉；正交試驗；分子質(zhì)量分布；營養(yǎng)評價

金槍魚是一種深海魚類，具有高蛋白、低脂肪等特點，備受青睞。金槍魚產(chǎn)品以生魚片和魚罐頭為主，會產(chǎn)生很多副產(chǎn)物，例如魚皮、內(nèi)臟、魚骨等。傳統(tǒng)上魚下腳料都是直接被加工為魚餌或動物飼料，商業(yè)價值較低[1]。隨著世界魚類產(chǎn)量的增加和消費形式的多樣化，如何利用加工副產(chǎn)物逐漸成為研究熱點。近年來，酶解一度成為眾學者研究的課題之一，酶解對象涉及各種動植物蛋白資源[2-4]，研究的主要方向集中在4 個方面，分別為蛋白酶的選擇及其條件的優(yōu)化、蛋白水解物（肽）的加工功能特性、蛋白水解物（肽）的氨基酸組成和相對分子質(zhì)量分布以及營養(yǎng)價值研究、蛋白水解物（肽）的生理活性研究及其應(yīng)用。并且相關(guān)研究證明了酶解過程的可操作性、穩(wěn)定性和產(chǎn)物的功能特性[5]。

國內(nèi)外也有部分學者研究金槍魚的酶解[6-7]，但較少有暗色肉的酶解研究[8]。本實驗以金槍魚副產(chǎn)物暗色肉為原料，利用胰蛋白酶，旨在研究加酶量等因素對酶解效果的影響，利用正交試驗優(yōu)化酶解工藝同時對酶解產(chǎn)物的分子質(zhì)量分布和氨基酸組成情況進行評價，為后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)，為工業(yè)生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃鰭金槍魚暗色肉 浙江大洋世家股份有限公司；胰蛋白酶（2.5×105U/g） 北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責任公司；氫氧化鈉、濃鹽酸、濃硫酸、苯酚、硝酸銀、甲醛等均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

BS-223S型精密電子天平 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；pHS-3C型pH計 上海精密科學儀器有限公司；DHG-9070型電熱恒溫鼓風干燥箱 上海一恒科學儀器有限公司；TGL-16M高速臺式冷凍離心機 長沙湘儀離心機儀器有限公司；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器河南省予華儀器有限公司；UV-759紫外-可見分光光度計上海奧譜勒儀器有限公司；SyKAM433D氨基酸自動分析儀 德國塞卡姆公司；e2695高效液相色譜儀（紫外檢測器） 美國Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 工藝流程

將金槍魚暗色肉用打漿機絞碎，用保鮮袋分裝，并放入冰箱中凍存。酶解時，將原料取出，流水解凍，以一定的液固比調(diào)節(jié)pH值和溫度，加酶水解。水解完成后升溫至80 ℃保溫20 min滅酶，8 000 r/min轉(zhuǎn)速離心10 min，取上清液即得酶解液。流程見圖1。

圖1 金槍魚暗色肉酶解流程圖Fig.1 Flow chart for the preparation of tuna dark muscle hydrolysates

1.3.2 指標檢測

1.3.2.1 理化指標測定[9]

水分含量：直接干燥法；灰分含量：高溫灼燒法；脂肪含量：索式抽提法；總糖含量：苯酚-濃硫酸比色法；氨基態(tài)氮含量的測定：甲醛滴定法；總氮、粗蛋白含量：凱氏定氮法。

1.3.2.2 水解度（degree of hydrolysis，DH）的計算[10-11]

1.3.2.3 氮回收率（nitrogen recovery，NR）的計算[11-12]

1.3.3 酶解工藝條件參數(shù)的確定

分別考察加酶量、酶解時間、初始pH值、酶解溫度以及液固比5 個因素對DH和NR的影響。并在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選定加酶量、酶解時間、初始pH值以及酶解溫度4 個影響因素，每個因素相應(yīng)取3 個試驗水平，進行正交試驗分析，優(yōu)化胰蛋白酶水解金槍魚暗色肉的工藝參數(shù)。胰蛋白酶水解四因素三水平正交試驗因素水平表L9（34）如表1所示。

表1 酶解正交試驗因素水平表Table1 Factors and levels used in orthogonal array design for enzymatic hydrolysis of tuna dark muscle

1.3.4 酶解液分子質(zhì)量分布分析

分析最優(yōu)條件下得到的酶解液，使用Waters高效液相色譜儀，配有紫外檢測器；分析柱為TSKGEL G2000PWXL；流速0.5 mL/min；流動相為0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液，pH 7.2；檢測波長220 nm。

1.3.5 酶解液氨基酸組成成分分析

酶解液用6 mol/L HCl溶液水解并稀釋后，用氨基酸自動分析儀進行定量分析。色氨酸經(jīng)過堿水解后，用相同方法進行分析。酶解蛋白營養(yǎng)價值評價采用聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織/世界衛(wèi)生組織（FAO/WHO）推薦的蛋白質(zhì)模式。

2 結(jié)果與分析

2.1 原料基本成分分析

表2 金槍魚暗色肉副產(chǎn)物主要成分測定Table2 Major components of tuna dark muscle

如表2所示，金槍魚暗色肉水分質(zhì)量分數(shù)為67.67%。金槍魚暗色肉含有豐富的蛋白質(zhì)，其粗蛋白質(zhì)量分數(shù)高達25.66%，這與洪鵬志等[13]報道黃鰭金槍魚背部肌肉粗蛋白的26.2%基本一致。但各種報道在金槍魚肌肉粗脂肪含量上差異較大，質(zhì)量分數(shù)波動范圍在0.2%～2%[7,13-14]，這可能是由于金槍魚品種不同所造成的，但都遠低于王鳳祥[15]報道的羅非魚的粗脂肪含量。充分體現(xiàn)了金槍魚高蛋白低脂肪的特點。

2.2 酶解時間對酶解效果的影響

圖2 酶解時間對酶解效果的影響Fig.2 Effect of hydrolysis time on DH and NR

酶解條件為液固比3∶1（mL/g）、加酶量2 500 U/g原料、初始pH 8.0、酶解溫度50 ℃。由圖2可知，隨著酶解時間的延長，在1～5 h，肽類的含量呈顯著上升趨勢，而在5 h之后，肽類蛋白質(zhì)的含量增加較緩慢。而氨基酸態(tài)氮的含量隨著酶解時間延長呈不斷升高趨勢，但由于內(nèi)切酶在酶切過程中氨基酸態(tài)氮占酶解液中總氮的比例較小，所以DH和NR先顯著增加而后緩慢增加[16]。根據(jù)趙梅[17]的研究結(jié)果，隨著時間的延長，胰蛋白酶的水解度在4 h之后增加較緩慢，這與本研究的結(jié)果相一致。所以綜合DH和NR兩個指標，最后將最佳酶解時間確定為4～6 h，并選擇4、5、6 h為正交試驗的水平條件。

2.3 加酶量對酶解效果的影響

圖3 加酶量對酶解效果的影響Fig.3 Effect of enzyme dosage on DH and NR

酶解條件為液固比3∶1、初始pH 8.0、酶解時間5 h、酶解溫度50 ℃。如圖3所示，隨著加酶量的增加DH先增大，在加酶量為2 500 U/g原料時達到最大值，隨后下降。原因為隨著加酶量的增加，酶解液中氨基酸態(tài)氮含量顯著增加，當加酶量達到2 500 U/g原料之后，氨基酸態(tài)氮含量增加趨勢緩慢，這與郝記明等[18]利用中性蛋白酶水解吉尾魚所得的趨勢一致，黃龍鳥等[19]在酶解烏雞血的過程中也發(fā)現(xiàn)的類似的現(xiàn)象；同時酶解液中的非氨基酸態(tài)氮的含量不斷增大。NR一直呈增大趨勢，這可能是由于胰蛋白酶屬內(nèi)切酶，酶量的增大導致更多的酶作用于蛋白質(zhì)[15]，從而使原料中的蛋白更多的被酶解，回收率增大?？紤]到酶量加大的同時會增加生產(chǎn)成本，所以選擇加酶量為1 000～2 500 U/g原料，并選取1 200、1 800、2 400 U/g為正交試驗的水平條件。

2.4 初始pH值對酶解效果的影響

圖4 初始pH值對酶解效果的影響Fig.4 Effect of initial pH on DH and NR

酶解條件為液固比3∶1、加酶量2 500 U/g原料、酶解時間5 h、酶解溫度50 ℃。由圖4可知，在不調(diào)節(jié)pH值情況下進行酶解（pH 6.0），氮回收率很低；隨著pH值的升高，NR顯著增大，pH 8～9時達到最大值；pH值繼續(xù)增大，過堿的環(huán)境不利于酶的作用，NR下降。DH的變化趨勢與NR基本一致，隨著pH值的升高而升高，在pH 8.0時最大，而后明顯降低。由此可以得出所用酶的最適pH值在8左右，并選擇7.5、8.0、8.5為正交試驗的水平條件。

2.5 酶解溫度對酶解效果的影響

圖5 酶解溫度對酶解效果的影響Fig.5 Effect of hydrolysis temperature on DH and NR

胰蛋白酶由動物肝臟提取而來，選取體溫（37 ℃）、50、60 ℃為試驗溫度。其他酶解條件為：液固比3∶1、加酶量2 500 U/g原料、酶解時間5 h、初始pH 8.0。結(jié)果如圖5所示，在試驗選取的溫度范圍內(nèi)，DH和NR均呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢。50 ℃時的DH和NR呈現(xiàn)出明顯優(yōu)勢；而60 ℃條件下，可能由于溫度過高，DH和NR均有顯著下降。所以最適溫度在50 ℃附近，選取45、50、55 ℃為正交試驗水平件。

2.6 液固比對酶解效果的影響

酶解條件為酶解溫度50 ℃、加酶量2 500 U/g原料、酶解時間5 h、初始pH 8.0。如圖6所示，酶解液的NR隨著液固比的增大先顯著增大，到4∶1后增加緩慢；DH則先增大后降低，在4∶1時最大。所以4∶1是較適合的液固比。但液固比較高，也增加了用水的成本和之后濃縮工藝的負擔，所以生產(chǎn)上可以考慮在液固比上有所調(diào)整。

圖6 液固比對酶解效果的影響Fig.6 Effect of liquid-to-solid ratio on DH and NR

2.7 酶解條件正交試驗

表3 正交試驗方案及結(jié)果Table3 Arrangement and results of orthogonal array design

圖7 正交試驗的因素水平與DH趨勢圖Fig.7 Tendency chart of factors and levels

通過單因素試驗分析可知，加酶量、初始pH值、酶解時間、酶解溫度對酶解效果有重要影響。所以本實驗以DH為指標，進行正交試驗，結(jié)果見表3。4 個因素對DH的影響從大到小依次為酶解時間（C）＞加酶量（A）＞初始pH值（B）＞酶解溫度（D），酶解時間對DH的影響最為顯著，這與已有研究[17,20]結(jié)果相一致，可以通過控制酶解時間來控制水解度的大小。由圖7可知，最佳方案為A3B2C3D3，即加酶量2 400 U/g原料、初始pH 8.0、酶解時間6 h、酶解溫度55 ℃。為進一步驗證最佳方案，在最佳條件下對金槍魚暗色肉進行酶解，測得水解度為（19.89±0.10）%，高于試驗組的水解度；氮回收率為（64.88±0.72）%。

2.8 酶解液分子質(zhì)量分布的變化

蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量分布是酶解產(chǎn)物的重要指標。研究表明，蛋白酶解產(chǎn)物的多樣性由多肽的相對分子質(zhì)量和氨基酸序列組成決定，因此研究酶解過程中蛋白分子質(zhì)量分布的變化對了解酶解作用規(guī)律有重要意義[21]。

表4 酶解前后多肽分子質(zhì)量分布Table4 Molecular weight distribution of the hydrolysate

由表4可知，金槍魚暗色肉中蛋白質(zhì)以大分子為主。酶解產(chǎn)物以分子質(zhì)量3 kD的成分為主，這與Ren Jiaoyan等[22]的結(jié)論相同。酶解產(chǎn)物分子質(zhì)量大于3 kD的組分僅占3.77%，百分含量比未酶解時下降了56.25%；小于3 kD的組分百分含量顯著增加，尤其是0.5～1 kD范圍內(nèi)小肽含量明顯增加。說明酶解對大分子蛋白質(zhì)有明顯的降解作用，而且產(chǎn)物酶解液主要成分為寡肽。但是值得一提的是，蛋白質(zhì)的酶解是一個動態(tài)變化過程，酶解產(chǎn)物的分布比例僅反映體系中宏觀整體的分子質(zhì)量情況[23]，所以酶解液中寡肽的具體組成需進一步分離鑒定。已有研究顯示，寡肽（＜3 kD）組分會表現(xiàn)出更好的抗氧化性[22,24]等功能活性，本實驗后續(xù)將對酶解產(chǎn)物的活性進行進一步探討。

2.9 酶解產(chǎn)物酶解液的氨基酸組成及營養(yǎng)評價

酶解產(chǎn)物中氨基酸總量為5 689.80 mg/100 mL，必需氨基酸含量占總氨基酸的42.38%。同時，含豐富的呈味氨基酸，例如呈鮮味氨基酸（Glu和Asp）占15.01%，呈甜味氨基酸（Gly、Ala、Ser、Thr）占14.32%，具體氨基酸組成見表5。

與FAO/WHO推薦的必需氨基酸模式相比較，結(jié)果見表6。表明金槍魚暗色肉酶解液的必需氨基酸種類齊全，含量豐富，與成人模式相比，第一限制氨基酸為色氨酸（Trp），氨基酸評分為193.20，這與任明[25]研究的梅魚水解液結(jié)果相似；相對于學齡兒童模式的第一限制氨基酸為亮氨酸（Leu），評分為88.00。日常所食用的谷類食物的第一限制性氨基酸一般是Lys[26]，而相對來講，金槍魚酶解液中Lys含量較豐富。因此該酶解液可作為成人、兒童的營養(yǎng)補充劑添加于食品中，通過氨基酸的互補作用，提高食品中蛋白質(zhì)的營養(yǎng)價值。同時根據(jù)童彥等[26]的研究，Arg、Lys和Tyr是參與鳙魚肉蛋白水解液美拉德反應(yīng)的主要氨基酸，金槍魚暗色肉酶解液中這幾種氨基酸都較豐富，因此該酶解液可能也較適合作為美拉德風味反應(yīng)的反應(yīng)基液。

表5 酶解液氨基酸組成分析Table5 Amino acid composition of the hydrolysate

表6 金槍魚暗色肉酶解液必需氨基酸與FAO/WHO推薦模式比較Table6 Comparison of essential amino acid pattern of tuna dark muscle hydrolysate and the FAO/WHO recommended pattern

3 結(jié) 論

本研究考察了加酶量、酶解時間、初始pH值、溫度以及液固比對金槍魚暗色肉DH和NR的影響，并選取出加酶量、酶解時間、初始pH值、溫度為影響酶解效果的主要因素。利用正交試驗，確定出胰蛋白酶酶解金槍魚暗色肉的最佳工藝為：加酶量2 400 U/g原料、初始pH 8.0、酶解時間6 h、酶解溫度55 ℃。在最佳條件下酶解金槍魚暗色肉得到的酶解液DH為19.89%，NR為64.88%。酶解液的成分以寡肽為主，主要生成的物質(zhì)分子質(zhì)量在3 kD以下，尤以1 kD以下為主要成分，且氨基酸組成比例合理，必需氨基酸含量豐富。正交試驗得出酶解時間對水解度的影響最大，將以時間為變量，對金槍魚暗色肉酶解過程的蛋白質(zhì)動態(tài)特性及多肽釋放規(guī)律、以及酶解過程產(chǎn)物的功能特性進行進一步研究。

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Enzymatic Hydrolysis of Dark Muscle from Yellowfin Tuna (Thunnus albacares) and Nutritional Evaluation of Hydrolysates

LIU Jian-hua1, WANG Bin1, KUAI Peng2, CAI yan-ping1, DING yu-ting1,*
(1. College of Ocean, Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310014, China; 2. Weihai Supervision and Inspection Institute of Product Quality, Weihai 264209, China)

This study investigated the preparation of protein hydrolysates from dark muscle from yellowfi n tuna as an edible fi sh by-product with trypsin. By using orthogonal array design, the optimal enzymatic hydrolysis conditions were determined as 2 400 U/g, 8.0, 55 ℃, and 6 h for enzyme dosage, initial pH, temperature, and hydrolysis time, respectively, resulting in a degree of hydrolysis (DH) of (19.89±0.10)% and a nitrogen recovery of (64.88±0.72)%. The molecular weight distribution of the hydrolysate as determined by high performance liquid chromatography (HPLC) suggested that signifi cant degradation of macromolecular proteins produced the hydrolysate mostly consisting of oligopeptides below 3 kD with molecules less than 1 kD accounting for the majority (79.23%) of the total oligopeptides. The hydrolysate contained all the common amino acids and was rich in eight essential amino acids (accounting for 42.38% of the total amino acids), and thus could be used as a nutritional supplement.

trypsin; yellowfi n tuna dark muscle; orthogonal array design; molecular weight distribution; nutritional evaluation

TS254.9

A

1002-6630（2014）20-0001-05

10.7506/spkx1002-6630-201420001

2014-02-20

國家自然科學基金青年科學基金項目（31301437）；浙江省自然科學基金青年科學基金項目（LQ13C200003）

劉建華（1982—），男，副教授，博士，研究方向為功能性食品研究和水產(chǎn)品加工。E-mail：jhliu@zjut.edu.cn

*通信作者：丁玉庭（1963—），男，教授，博士，研究方向為水產(chǎn)品加工、貯藏和保鮮。E-mail：dingyt@mail.hz.zj.cn