黃澤華，王倩雯，張 賀，李育楠，李慶波，曹龍奎,2,*

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 大慶 163319；2.黑龍江省農(nóng)產(chǎn)品加工工程技術(shù)研究中心，黑龍江 大慶 163319）

響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化綠豆凝集素提取工藝

黃澤華1，王倩雯1，張 賀1，李育楠1，李慶波1，曹龍奎1,2,*

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 大慶 163319；2.黑龍江省農(nóng)產(chǎn)品加工工程技術(shù)研究中心，黑龍江 大慶 163319）

凝血法檢測(cè)綠豆凝集素活性，并改進(jìn)凝集活性檢測(cè)兔血紅細(xì)胞處理?xiàng)l件，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上設(shè) 計(jì)響應(yīng)面Box-Behnken試驗(yàn)，優(yōu)化綠豆凝集素提取工藝條件。結(jié)果表明，凝集活性檢測(cè)兔血紅細(xì)胞的處理最佳條件為戊二醛體積分?jǐn)?shù)0.15%、25 ℃處理血細(xì)胞20 min；胰蛋白酶添加量25 U/mL、25 ℃處理1 5 min，優(yōu)化條件下提高了兔血紅細(xì)胞凝集靈敏度且延長了兔血紅細(xì)胞保存時(shí)間。磷酸鹽緩沖溶液為綠豆凝集素最佳浸提溶液，綠豆凝集素優(yōu)化工藝條件為料液比1∶9.09（g/mL）、NaCl濃度0.3 mol/ L、浸提時(shí)間4.16 h，在此條件下最大綠豆凝集素比活力預(yù)測(cè)和驗(yàn)證值分別為134.91 U/mg和139.02 U/mg。

綠豆凝集素；響應(yīng)面法；優(yōu)化；提取

綠豆凝集素具有細(xì)胞凝集作用[1]，新鮮兔血紅細(xì)胞凝血法檢測(cè)的可重復(fù)性差，對(duì)紅 細(xì)胞進(jìn)行戊二醛固定、胰蛋白酶處理，可以提高紅細(xì)胞的感受性和穩(wěn)定性，從而增加檢測(cè)的靈敏度和可重復(fù)性[2]。綠豆凝集素是由4 個(gè)亞基構(gòu)成四聚體的糖蛋白，分子質(zhì)量約為160 kD，是綠豆中主要的抗?fàn)I養(yǎng)因子之一，由Charles等[3]分離得到。飽和硫酸銨沉淀[4]、羧甲基纖維素離子交換層析[5]和凝膠過濾[6]是綠豆凝集素的純品制備的主要方法，但是這種方法采用了兩次層析步驟，分離效率低，造成大量凝集素活性損失，成本高并且耗時(shí)。純化手段的不足限制了凝集素在生物學(xué)[7]、醫(yī)學(xué)[8]和動(dòng)物營養(yǎng)學(xué)[9]等領(lǐng)域的應(yīng)用，因此需要尋找新的簡(jiǎn)便且可整合的分離純化凝集素的方法。本研究采用響應(yīng)面法優(yōu)化了綠豆凝集素的提取工藝，并用硫酸銨雙重鹽析的方法取代一步層析操作，減小了凝集素活性的損失，起到了很好的純化效果并降低了成本。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

綠豆 大連白樺糧谷加工有限公司；兔血為健康成年大白兔耳緣靜脈血；磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉 遼寧泉瑞試劑有限公司；戊二醛50%溶液 上海生化試劑公司；胰蛋白酶 上海原葉生物科技有限公司；硫酸銨天津市大茂化學(xué)試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

T6新世紀(jì)紫外-可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；TD5A型離心機(jī) 長沙英太儀器有限公司；AR2100型電子天平 奧斯豪國際貿(mào)易有限公司；HD-9707電腦紫外檢測(cè)儀 上海精科實(shí)業(yè)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 綠豆凝集素的凝集素活力檢測(cè)

凝血法測(cè)定綠豆凝集素活性[10]。兔血紅細(xì)胞的處理參考Turner[11]、彭建宗[12]等的報(bào)道，并改進(jìn)25 ℃時(shí)戊二醛及胰蛋白酶對(duì)兔血紅細(xì)胞處理的濃度和時(shí)間，以適用于綠豆凝集素的檢測(cè)。在96 孔凝血板上系列倍比稀釋（從前一孔吸取25 μL液體，放入下一孔內(nèi)，充分混合后取25 μL液體放入下一孔內(nèi)，如此操作至倒數(shù)第2個(gè)孔)，每一排第一孔稀釋兩倍（21），留下每一排的最后一空，作為對(duì)照。凝集活性滴度，指在96孔凝血板上使兔血紅細(xì)胞凝集的最小稀釋倍數(shù)，2n。凝集素活力單位和比活力計(jì)算見公式（1）、（2）。

1.3.2 蛋白質(zhì)含量測(cè)定

采用Lowry法，以牛血清蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)[13]。

1.3.3 最佳浸提緩沖溶液的確定

采用0.2 mol/L、pH 7.2 磷酸鹽緩沖液浸提，0.9%生理鹽水浸提，0.1 mol/L、pH 6.0檸檬酸緩沖溶液，0.1 mol/L、pH 9.51碳酸緩沖溶液浸提以及蒸餾水在相同條件下浸提，分別測(cè)定提取液凝集活性，確定最佳提取緩沖溶液[14]。

1.3.4 綠豆凝集素浸提條件單因素試驗(yàn)

依據(jù)參考文獻(xiàn)[15-16]，對(duì)凝集素提取過程影響較大的因素有料液比（g/mL）、NaCl濃度、浸提時(shí)間等[17]，通過實(shí)驗(yàn)探討其對(duì)綠豆凝集素凝集凝集活性的影響，設(shè)計(jì)三因素三水平響應(yīng)面試驗(yàn)；并通過單因素試驗(yàn)確定綠豆粉碎粒度、浸提溫度最佳參數(shù)。準(zhǔn)確稱取5 g 綠豆粉（60～80 目），以料液比1∶10，采用最佳浸提緩沖溶液，在20 ℃條件下100 r/min搖床振蕩浸提4 h，測(cè)定浸提液凝集活性。固定其他條件，分別對(duì)綠豆粉碎粒度（40～120目及120 目以上）、浸提溫度（5～50 ℃）、料液比（1∶4～1∶12）、NaCl濃度（0～0.6 mol/L）及浸提時(shí)間（2～10 h）進(jìn)行考察。

1.3.5 綠豆凝集素浸提響應(yīng)面優(yōu)化

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上采用三因素三水平的響應(yīng)面分析方法[18-19]，分別以A、B、C代表料液比、NaCl濃度、浸提時(shí)間3個(gè)因素，試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1。采用Design-Expert設(shè)計(jì)Box-Behnken試驗(yàn)。17 個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)可分為兩類：一類為析因點(diǎn)，自變量取值在A、B、C所構(gòu)成的三維頂點(diǎn)，共有12 個(gè)析因點(diǎn)；另一類為零點(diǎn)，為區(qū)域的中心點(diǎn)，零點(diǎn)試驗(yàn)重復(fù)5 次，用以估計(jì)試驗(yàn)誤差。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table1 Coded levels for independent variables used in response surface analysis (RSA)

1.3.6 綠豆凝集素的鹽析提取

對(duì)綠豆凝集素浸提液進(jìn)行兩次30%～70%的梯度硫酸銨鹽析[20]。第1次鹽析分別收集30%～40%、40%～50%、50%～60%和60%～70%硫酸銨飽和度鹽析沉淀，測(cè)定凝集活性，將凝集活性最高的硫酸銨鹽析沉淀混合后，同樣方法進(jìn)行第2次硫酸銨鹽析。收集凝集活性最高的鹽析沉淀物用于層析純化。

1.3.7 葡聚糖凝膠層析對(duì)綠豆凝集素浸提液進(jìn)行純化

將雙重硫酸銨鹽析后的蛋白質(zhì)沉淀配成10 mg/mL溶液1 mL，上已經(jīng)平衡好的Sephadex G-75層析柱，以流速0.7 mL/min生理鹽水進(jìn)行洗脫，用核酸蛋白檢測(cè)儀進(jìn)行檢測(cè)，自動(dòng)收集器進(jìn)行接樣，4 min/管[21]。

2 結(jié)果與分析

2.1 兔血紅細(xì)胞處理方法優(yōu)化

圖1 戊二醛處理兔血紅細(xì)胞對(duì)其4 ℃保存穩(wěn)定性的影響Fig.1 Effect of glutaraldehyde treatment on the stability rabbit red blood cells stored at 4 ℃

從圖1可知，未經(jīng)戊二醛固定處理的新鮮兔血紅細(xì)胞及以體積分?jǐn)?shù)為0.05%～0.10%的戊二醛處理的兔血紅細(xì)胞在4 ℃保存時(shí)，10 d內(nèi)均發(fā)生溶血，凝集活性失去或降低，說明溶液中的戊二醛的醛基不能與全部兔血紅細(xì)胞表面的氨基發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)使紅細(xì)胞得以固定，戊二醛添加量不 足。以0.15%戊二醛處理的在第10天依然沒有凝集活性降低，事實(shí)上在第30天依然具有良好的凝集活性，說明0.15%戊二醛能夠使全部的紅細(xì)胞得以固定，延長了其保存時(shí)間；但當(dāng)戊二醛達(dá)到0.20%時(shí)，處理20 min會(huì)使兔血紅細(xì)胞泥的顏色變黑，并且紅細(xì)胞間黏著性增強(qiáng)，不易分 散成細(xì)胞懸浮液。這可能是因?yàn)槲於┑膬蓚€(gè)醛基與兔血紅細(xì)胞蛋白質(zhì)間是以雙鍵的形式結(jié)合，而使細(xì)胞組織得以固定的，當(dāng)大量的戊二醛滲透到細(xì)胞組織內(nèi)部時(shí)，破壞了蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)[4,22]。因此，本實(shí)驗(yàn)采用0.15%戊二醛25 ℃處理新鮮兔血紅細(xì)胞20 min。

圖2 胰蛋白酶添加量對(duì)兔血紅細(xì)胞凝集活性滴度的影響Fig.2 Effect of trypsin treatment on the agglutinating activity of rabbit red blood cells

從圖2可知，不同量胰蛋白酶處理兔血紅細(xì)胞，其凝集活性滴度呈先增加后降低趨勢(shì)。說明當(dāng)胰蛋白酶處理時(shí)間一定，胰蛋白酶只有達(dá)到一定濃度（16 U/mL），才能提高兔血紅細(xì)胞的凝集活性滴度；并且具有最佳胰蛋白酶添加量范圍，超過這個(gè)范圍（25～28 U/mL），反而使兔血紅細(xì)胞的凝集活性滴度下降。分析認(rèn)為，由于凝集素具有糖結(jié)合專一性，胰蛋白酶處理兔血紅細(xì)胞，使細(xì)胞表面被包埋在膜的脂質(zhì)雙分子層中的糖蛋白的糖基暴露出來，從而與凝集素特異性結(jié)合，而提高了其凝集活性；當(dāng)胰蛋白酶濃度過大時(shí)，紅細(xì)胞表面的糖蛋白被過度水解，糖基被剝離紅細(xì)胞表面，而使凝集活性降低。綜合分析，采用25 U/mL胰蛋白酶處理戊二醛固定后的兔血紅細(xì)胞15 min。

2.2 最佳浸提緩沖溶液的確定

圖3 不同浸提液提取綠豆凝集素的凝集反應(yīng)現(xiàn)象Fig.3 Coagulation phenomenon of mung bean lectin extracted with different solvents

從圖3可以看出，在相同的浸提條件下，PBS浸提的綠豆凝集素粗提液的凝集活性滴度最大，達(dá)到24，能夠最大限度的提取綠豆凝集素。因此本實(shí)驗(yàn)采用PBS作為浸提綠豆凝集素的緩沖溶液。

2.3 不同條件對(duì)綠豆凝集素浸提的影響

2.3.1 粉碎粒度對(duì)綠豆凝集素浸提 的影響

圖4 粉碎粒度對(duì)綠豆凝集素比活力的影響Fig.4 Effect of mung bean granularity on the activity of mung bean lectin

如圖4所示，當(dāng)粉碎粒度從20～40 目增加到80～100 目時(shí)，綠豆凝集素凝集活性不斷增強(qiáng)，從25.0 U/mg增加到109.8 U/mg；粉碎粒度在80～100 目左右時(shí)，提取液凝集活性達(dá)到最大，因此浸提綠豆凝集素時(shí)，將綠豆粉碎至80～100 目。

2.3.2 浸提溫度對(duì)綠豆凝集素浸提的影響

圖5 浸提溫度對(duì)綠豆凝集素比活力的影響Fig.5 Effects of extraction temperature on the activity of mung bean lectin

從圖5可知，隨著溫度的升高，浸提液中綠豆凝集素活性呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)。從實(shí)驗(yàn)的方便性出發(fā)，選擇25 ℃提取綠豆凝集素。

2.3.3 浸提時(shí)間對(duì)綠豆凝集素浸提的影響

圖6 浸提時(shí)間對(duì)綠豆凝集素比活力的影響Fig.6 Effect of extraction time on the activity of mung bean lectin

由圖6可見，隨著浸提時(shí)間的延長，凝集素比活力不斷增加，浸提6 h達(dá)到最高值，然后開始下降。

2.3.4 料液比對(duì)綠豆凝集素浸提的影響

由圖7可以發(fā)現(xiàn)，不同的料液比對(duì)浸提液凝集素比活力有顯著影響，當(dāng)料液比1∶4時(shí)，由于浸提液濃度較高使浸提溶液具有較大凝集活性；當(dāng)料液比不斷降低，浸提溶液凝集活性先升高后降低，在料液比1∶10左右時(shí)達(dá)到最大。

圖7 料液比對(duì)綠豆凝集素比活力的影響Fig.7 Effect of solid-liquid ratios on the activity of mung bean lectin

2.3.5 NaCl濃度對(duì)綠豆凝集素浸提的影響

圖8 NaCl濃度對(duì)綠豆凝集素比活力的影響Fig.8 Effect of NaCl concentration on the activity of mung bean lectin

由圖8可見，當(dāng)緩沖溶液中不添加NaCl時(shí)，綠豆凝集素比活力很低，隨著NaCl濃度的升高，綠豆凝集素比活力開始升高，并在NaCl濃度0.3 mol/L時(shí)到到最大值，然后逐步降低并保持綠豆凝集素比活力的穩(wěn)定，如圖8所示。

2.4 響應(yīng)面法優(yōu)化綠豆凝集素提取工藝條件

2.4.1 模型方程的建立與顯著性檢驗(yàn)

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)分析方案及結(jié)果Table2 Program and experimental results of RSA

利用Design-Expert軟件，通過表2中葉綠豆凝集素比活力試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，獲得綠豆凝集素比活力對(duì)編碼自變量料液比、NaCl濃度和浸提時(shí)間的回歸方程為：Y=134.21＋6.82A－0.31B＋9.73C－0.48AB＋1.77AC＋0.24BC－38.91A2－47.45B2－60.90C2?；貧w方差分析顯著性檢驗(yàn)（表3）表明，整體模型的P值小于0.01，表明該二次方程模型極顯著，失擬項(xiàng)不顯著，表明模型擬合有效，可以較好地描述各因素與響應(yīng)值的真實(shí)關(guān)系。料液比和浸提時(shí)間的P值均小于0.01，對(duì)綠豆凝集素浸提影響極顯著，而NaCl濃度對(duì)綠豆凝集素浸提影響不顯著。由回歸方程的各項(xiàng)方差分析結(jié)果表明，一次項(xiàng)和二次項(xiàng)都有顯著性因素，表明選取的3因素對(duì)綠豆凝集素比活力的影響不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系，平方項(xiàng)對(duì)響應(yīng)值也有很大影響。

表3 回歸模型方程的方差分析Table3 Analysis of variance for the regression model

2.4.2 影響綠豆凝集素浸提比活力的主要因素分析

利用Design-Expert軟件對(duì)表2的數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸擬合，所得到的二次回歸方程的響應(yīng)面及其等高線見圖9。由圖9a可知，當(dāng)固定NaCl濃度不變時(shí)，隨著料液比的減小，浸提液中綠豆凝集素比活力呈現(xiàn)增加的趨勢(shì)；等高曲線較密集，說明料液比對(duì)綠豆凝集素浸提影響顯著，這一點(diǎn)從響應(yīng)曲面陡峭程度上也可以直觀的觀察到，并在編碼值0.089附近達(dá)到最大響應(yīng)值最高點(diǎn)，而后略有下降；當(dāng)固定浸提時(shí)間，由圖9b分析亦可得出相同結(jié)論；這與本研究的單因素試驗(yàn)料液比對(duì)綠豆凝集素浸提影響的結(jié)果一致。浸提液較少時(shí)，浸提液不足以完全將綠豆粉中的凝集素浸出，還會(huì)增加其他雜質(zhì)的浸出濃度；浸提液較多時(shí)，增加的浸提緩沖溶液將浸出的凝集素稀釋，從而造成凝集活性的降低，且后期凝集素純化制備時(shí)將增加濃縮成本。

當(dāng)固定料液比、NaCl濃度時(shí)，由圖9b、c分析可知，隨著浸提時(shí)間的延長，比活力呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢(shì)，等高曲線在料液比增加（圖9b）時(shí)比NaCl濃度增加（圖9c）時(shí)更為密集，說明浸提時(shí)間、料液比之間的交互作用與浸提時(shí)間、NaCl濃度之間的交互作用相比更為明顯，但是二者均不顯著；綠豆凝集素比活力在A編碼值0.089，B編碼值－0.004附近取得最大響應(yīng)值。與本研究的單因素試驗(yàn)浸提時(shí)間對(duì)綠豆凝集素浸提影響的結(jié)果一致。這可能是因?yàn)殡S著浸提時(shí)間的延長，綠豆凝集素不斷浸提至溶液中，使比活力增加；但是浸提時(shí)間達(dá)到一定范圍時(shí)，凝集素已經(jīng)完全浸出到溶液中或達(dá)到一種浸出平衡狀態(tài)，此時(shí)再延長浸提時(shí)間，將會(huì)使凝集素與空氣接觸時(shí)間延長，溶液中微生物的繁殖以及提取過程中的不斷攪拌震動(dòng)，使綠豆凝集素被氧化或者空間結(jié)構(gòu)被生物、物理因素破壞而降解失活。

固定料液比和浸提時(shí)間，分析圖9a、b，可以發(fā)現(xiàn)隨著NaCl濃度的增加，綠豆凝集素的比活力呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)，從等高曲線分析NaCl濃度、料液比之間的交互作用和浸提時(shí)間、料液比之間的交互作用均不顯著，綠豆凝集素比活力在A編碼值0.5，B編碼值0附近達(dá)到響應(yīng)值最高點(diǎn)，這與本研究的單因素試驗(yàn)NaCl濃度對(duì)綠豆凝集素浸提影響的結(jié)果一致?？赡苁且?yàn)榫G豆凝集素時(shí)鹽溶蛋白，在PBS緩沖溶液中，提高NaCl濃度，會(huì)增加綠豆凝集素的溶出，使凝集活性增加；而NaCl濃度繼續(xù)提高時(shí)，導(dǎo)致綠豆凝集素提取液中蛋白質(zhì)與其他物質(zhì)形成不溶性的蛋白復(fù)合物。

圖9 各因素間等高線及響應(yīng)曲面圖Fig.9 Response surface and contour plots showing the effects of extraction conditions on the activity of mung bean lectin

利用Design-Expert軟件對(duì)表2的數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸擬合，所得到的二次回歸方程的響應(yīng)面及其等高線見圖9。通過軟件Design-Expert求解方程，可以得出模型的極值點(diǎn)：A =0.089；B=－0.004；C =0.081。經(jīng)過轉(zhuǎn)換得出最優(yōu)提取條件為料液比1∶9.09、NaCl濃度0.3 mol/L、浸提時(shí)間4.16 h，最大綠豆凝集素比活力134.91 U/mg。使用優(yōu)化最佳條件進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，凝集素比活力為139.02 U/mg，與預(yù)測(cè)值很接近，說明模型可以起到一定的預(yù)測(cè)作用。

2.4.3 硫酸銨雙重鹽析結(jié)果

第1次鹽析當(dāng)硫酸銨飽和度分別為40%、50%、60%和70%時(shí)，所獲得的蛋白質(zhì)沉淀的凝集活性比活力分別為131.66、 340.14、536.37 U/mg和95.37 U/mg，因此收集40%～60%的硫酸銨飽和度范圍鹽析蛋白質(zhì)沉淀進(jìn)行第二次硫酸銨分級(jí)鹽析。

圖11 硫酸銨分級(jí)鹽析結(jié)果Fig.11 Ammonium sulfate salting-out of mung bean lectin

從圖11可知，兩次鹽析在硫酸銨飽和度為60%左右得到最高凝集素比活力，第1次鹽析 和第2次鹽析與驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)相比純化倍數(shù)分別達(dá)到3.86和5.80。

2.4.4 葡聚糖凝膠層析對(duì)綠豆凝集素粗提液進(jìn)行純化

對(duì)硫酸銨雙重鹽析后的凝集素粗品采用葡聚糖凝膠G-75進(jìn)行分子篩層析，用電腦紫外檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)。在20 min和44 min分別出現(xiàn)峰1和峰2，收集樣品進(jìn)行凝集活性檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，峰1具有凝集活性，活 性達(dá)到1 611.82 U/mg，純化倍數(shù)達(dá)11.59；峰2不具有凝集活性。

圖12 葡聚糖凝膠層析譜圖Fig.12 Gel filtration chromatography of mung bean lectin on Sephadex G-75 column

3 討論與結(jié)論

實(shí)驗(yàn)確定了綠豆凝集素凝集活性檢測(cè)最佳兔血紅細(xì)胞處理?xiàng)l件，戊二醛體積分?jǐn)?shù)0.15%，25 ℃固定25 min；胰蛋白酶添加量20 U/mL，25 ℃處理15 min；改進(jìn)后的兔血紅細(xì)胞處理方法具有更靈敏的凝集活性反應(yīng)，并能保持凝集活性30 d以上。

采用響應(yīng)面法對(duì)綠豆凝集素提取方法進(jìn)行優(yōu)化，得到擬合方程Y=134.21＋6.82A－0.31B＋9.73C－0.48AB＋1.77AC＋0.24BC－38.91A2－47.45B2－60.90C2，以及提取最優(yōu)條件為料液比1∶9.09、NaCl濃度0.3 mol/L、浸提時(shí)間4.16 h，最大綠豆凝集素比活力139.02 U/mg。

在最優(yōu)條件下浸提的綠豆凝集素粗品經(jīng)雙重硫酸銨分級(jí)鹽析，在40%～60%飽和度范圍內(nèi)有最大凝集活性，經(jīng)過葡聚糖凝膠G-75過濾，得到綠豆凝集素比活力達(dá)1 611.82 U/mg，凝集活性提高11.59 倍。

本研究優(yōu)化了綠豆凝集素浸提方法，采用硫酸銨雙重鹽析之后進(jìn)行葡聚糖分子篩層析的分離方法，減小了綠豆凝集素純化過程中的活性損失，具有一定的應(yīng)用前景。

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Response Surface Methodology to Optimize the Extraction Process of Mung Bean Lectin

HUANG Ze-hua1, WANG Qian-wen1, ZHANG He1, LI Yu-nan1, LI Qing-bo1, CAO Long-kui1,2,*
(1. College of Food Science, Heilongjiang Bayi Agricultural University, Daqing 163319, China; 2. Agri-Food Processing and Engineer ing Technology Research Center of Heilongjiang Province, Daqing 163319, China)

The experiment was designed to use erythrocytes for assaying the agglutinating activity of mung bean lectin, and to improve the processing conditions for glutaraldehyde- and trypsin-treated rabbit red blood cells. Rabbit red blood cells (RBC) were fixed with 0.15% (V/V) glutaraldehyde at 25 ℃ for 20 min, and the RBC were treated with trypsin (25 U/mL) at 25 ℃ for 15 min to increase the assay activity and extend their preservation time. In the investigation, we found that the most suitable extraction solvent for mung bean lectin was phosphate buffer solution. Based on the results of single-factor experiments, a Box-Behnken design (BBD) of three variables at three levels each was carried out to obtain maximum activity of mung bean lectin by response surf ace analysis. The maximum activity of mung bean lectin was predicted to be 134.91 U/mg and observed to be 139.02 U/mg under the optimum extraction conditions: solid-to-liquid ratio, 1:9.09 (g/mL); NaCl concentration, 0.3 mol/L; and extraction time, 4.16 h.

mung bean lectin; response surfac e analysis; optimization; extraction

R284.2

A

1002-6630（2014）20-0031-06

10.7506/spkx1002-6630-201420007

2013-10-31

“十二五”國家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2012BAD34B0205）

黃澤華（1988—），男，碩士研究生，研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品加工。E-mail：huangzehua1988@163.com

*通信作者：曹龍奎（1965—），男，教授，博士，研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品加工。E-mail：caolongkui2013@163.com