周 巍，張 薇，劉 亮，劉 東，李永波，田 浩，張 巖,*，張志勝*

（1.河北農業(yè)大學食品科技學院，河北 保定 071000；2.河北省食品質量監(jiān)督檢驗研究院，河北 石家莊 050091）

嬰兒配方乳粉中阪崎克羅諾桿菌解旋酶恒溫基因擴增檢測方法的建立

周 巍1,2，張 薇2，劉 亮2，劉 東2，李永波2，田 浩2，張 巖2,*，張志勝1,*

（1.河北農業(yè)大學食品科技學院，河北 保定 071000；2.河北省食品質量監(jiān)督檢驗研究院，河北 石家莊 050091）

目的：建立一種檢測嬰兒配方乳粉中阪崎克羅諾桿菌的解旋酶恒溫基因擴增方法。方法：根據(jù)阪崎克羅諾桿菌ITS基因設計特異性引物，優(yōu)化解旋酶恒溫基因擴增法反應條件UvrD helicase、T4 gp32的濃度，人工添加阪崎克羅諾桿菌確定檢出限，多種致病菌在建立的解旋酶恒溫基因擴增體系中擴增驗證特異性，電泳檢測擴增產物。結果：解旋酶恒溫基因擴增法檢測嬰兒配方乳粉中阪崎克羅諾桿菌得到與設計序列長度一致的100 bp基因片段，檢出限為10 CFU/g，優(yōu)化反應條件UvrD helicase、T4 gp32的終濃度分別為0.1、5.0 μg。結論：解旋酶恒溫基因擴增法用于檢測嬰兒配方乳粉中阪崎克羅諾桿菌的特異性強、靈敏度高、耗時短，為嬰兒配方乳粉中阪崎克羅諾桿菌的快速檢測提供了新的方法。

解旋酶恒溫基因擴增法；嬰兒配方乳粉；阪崎克羅諾桿菌；檢測

食品安全問題是關系到人民大眾切身利益的敏感話題。嬰兒配方乳粉是針對于新生兒的特定食品，營養(yǎng)豐富，能夠滿足嬰兒生長發(fā)育的日常需要，其安全性尤為重要。阪崎克羅諾桿菌是嬰兒配方乳粉主要的微生物安全指標，其條件致病性和嬰兒免疫系統(tǒng)發(fā)育的不完全性易對嬰兒身體健康造成傷害，因此阪崎克羅諾桿菌的檢測與控制已經成為影響嬰兒食品安全的重要因素。

分子生物學技術的飛速發(fā)展，越來越多的技術已經應用于致病菌檢測領域[1-10]，主要有：聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）技術、實時熒光PCR技術、熒光探針檢測技術、基因芯片技術。依賴解旋酶恒溫基因擴增（helicase-dependent isothermal DNAamplification，HDA）方法是近年來以PCR法為基礎發(fā)展起來的體外恒溫基因擴增方法，具有所需儀器設備簡單、反應時間短、特異性強、假陽性低等優(yōu)點，能夠滿足食品中致病菌快速檢測的需求。

本研究擬將HDA方法應用于嬰兒配方乳粉中阪崎克羅諾桿菌的檢測中，利用HDA法自身的優(yōu)勢，開發(fā)嬰兒配方乳粉中阪崎克羅諾桿菌的HDA快速檢測方法，以期為檢驗檢疫部門提供更多的方法，為HDA法在其他致病菌檢測上的推廣提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗菌株

本實驗中所采用的菌株詳見表1。

表1 實驗用菌株Table 1 The strains tested in this study

1.1.2 樣品

市購嬰兒配方乳粉，經GB 4789.40—2010《食品微生物學檢驗：阪崎腸桿菌檢驗》檢驗證實不含有阪崎克羅諾桿菌。

1.1.3 試劑

DNA Marker、腺嘌呤核苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）、dNTPs、引物（正向引物、反向引物） 大連寶生物工程公司；海藻糖 美國Sigma公司；大腸桿菌UvrD解旋酶 上海富眾生物科學有限公司；Bst polymerase、MutL protein、T4 gp32 New England公司；Ezup柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒生物工程（上海）有限公司。

1.1.4 儀器與設備

DXY-33A型電泳儀 北京市六一廠；UVIpro凝膠成像系統(tǒng) 華粵企業(yè)集團有限公司；6400型恒溫金屬浴上海東升儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 阪崎克羅諾桿菌基因組DNA的提取[11-12]

取已經預熱至44 ℃、滅菌的緩沖蛋白胨水培養(yǎng)基100 mL接種阪崎克羅諾桿菌（CICC21560），（36±1） ℃培養(yǎng)（18±2）h。取1 mL緩沖蛋白胨水培養(yǎng)液與10 mL改良月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯-萬古霉素混合，于（44±0.5） ℃培養(yǎng)（24±2）h，然后取1 mL增菌液用Ezup柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒提取阪崎克羅諾桿菌基因組DNA，－20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物設計

通過分析阪崎克羅諾桿菌基因序列，確定以16S rDNA和23S rDNA之間的ITS基因序列為靶標序列，利用Primer Premier 5.0設計引物，并通過Oligo 6.0進行驗證，再進行BLAST在線比對后，經實驗驗證，最終確定引物。

表2 引物序列與目的擴增產物大小Table 2 The primer sequences and the size of the PCR products

1.2.3 HDA反應體系的優(yōu)化及建立

采用一步法HDA反應體系：反應體系為：5 μL 10×buffer（100 mmol/L二硫蘇糖醇、350 mmol/L Tris-HAc、100 mmol/L MgSO4、1 mg/mL BSA），0.04 μmol dNTPs，0.16 μmol ATP，10U Bst ploymerase，0.1 μg UvrD helicase，5.0 μg T4 gp32，25 μmol/L海藻糖，2 μL模板DNA，20 pmol引物，用ddH2O補至50 μL。其中對反應體系中UvrD helicase（0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30 μg）、T4 gp32（1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 μg）的終濃度進行優(yōu)化，最終建立HDA法檢測阪崎克羅諾桿菌的反應體系。

將反應體系放入金屬浴中65 ℃恒溫2 h。2%的瓊脂糖凝膠電泳（100 V）45 min檢測產物。

1.2.4 HDA法檢測阪崎克羅諾桿菌的檢出限

嬰兒配方乳粉購自當?shù)爻?，在人工添加阪崎克羅諾桿菌前，該乳粉按標準方法檢測證實不含有阪崎克羅諾桿菌。將阪崎克羅諾桿菌人工添加到乳粉中，使樣品中阪崎克羅諾桿菌濃度依次為100～108CFU/g，直接提取人工添加的乳粉中阪崎克羅諾桿菌的基因組DNA進行HDA法檢測。

1.2.5 HDA法檢測阪崎克羅諾桿菌的特異性

將表1中所涉及的菌種按照試劑盒法進行提取基因組DNA，按照1.2.3節(jié)建立的方法同時進行HDA檢測，2%的瓊脂糖凝膠電泳（100 V、45 min）檢測產物。

2 2 結果與分析

2.1 HDA反應體系的優(yōu)化結果

圖1 阪崎克羅諾桿菌HDA法UvrD helicase優(yōu)化結果Fig.1 Optimization results of final UvrD helicase concentration by Cronobacter sakazakii by HDA

圖2 阪崎克羅諾桿菌HDA法T4 gp32優(yōu)化結果Fig.2 Optimization results of final T4 gp32 concentration by Cronobacter sakazakii by HDA

由圖1、2可見，針對建立的阪崎克羅諾桿菌HDA檢測體系，對反應體系中UvrD helicase（0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30 μg）、T4 gp32（1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 μg）的終濃度進行優(yōu)化，最終確定UvrD helicase、T4 gp32的終濃度分別為0.1、5.0 μg。

2.2 HDA法檢測阪崎克羅諾桿菌的檢出限

通過對嬰兒配方乳粉人工添加阪崎克羅諾桿菌，濃度梯度為100～106CFU/g，進行HDA法檢測。由圖3可以看出，101～106CFU/g均能夠獲得100 bp的電泳條帶，且清晰無非特異性條帶，100CFU/g則沒有電泳條帶，可以得出，HDA法檢測阪崎克羅諾桿菌的檢出限為101CFU/g。

圖3 阪崎克羅諾桿菌HDA法檢出限Fig.3 Sensitivity of detection of Cronobacter sakazakii by HDA

2.3 HDA法檢測阪崎克羅諾桿菌的特異性結果

對表1中所有菌種按照HDA法進行檢測，驗證該方法的特異性，通過圖4可以看出，表1中4種阪崎克羅諾桿菌均能被有效地擴增出100 bp長度的目的片段，而且電泳條帶清晰，無非特異性擴增；表1中其他11種菌種均未產生電泳條帶，說明沒有基因擴增。因此，可以證明該方法檢測阪崎克羅諾桿菌的特異性較好。

圖4 阪崎腸桿菌HDA法特異性Fig.4 Specificity of HDA system in detection of Cronobacter sakazakii

3 討 論

阪崎克羅諾桿菌作為嬰兒配方乳粉中主要的致病菌已經引起了高度的重視，但是檢測時間長成為制約其檢測效率的重要因素，目前，基于PCR技術的檢測方法被廣泛的開發(fā)出來，范宏英等[1]建立阪崎克羅諾桿菌環(huán)介導等溫擴增快速檢測技術，并與PCR檢測方法進行比較，最終確定LAMP檢測限為10 CFU/mL，PCR檢測限為102CFU/mL，同時對36株近源菌進行特異性檢測，LAMP和PCR兩種方法均有很好的特異性。

阪崎克羅諾桿菌的ITS序列是其基因檢測技術的主要目的序列[13-14]，Baron等[15]通過分析阪崎克羅諾桿菌的基因序列，采用了ITS序列和其他的表征序列完成的阪崎克羅諾桿菌的篩選和分型工作。Roy等[16]利用ITS間區(qū)序列完成了病毒和致病菌的同體系檢測，實現(xiàn)了阪崎克羅諾桿菌和侵染病毒的快速檢測工作。

HDA方法即賴HDA方法在致病菌檢測的應用已有相關報道，王建廣等[17]利用HDA法對沙門氏菌進行了檢測，最低檢測限為460 pg/tube，與普通PCR相當；石琰璟等[18]通過HDA法對副溶血性弧菌進行了檢測，最低檢測限為19.9 ng/mL，與普通PCR相當。因此，HDA法對于致病菌檢測是有一定的應用前景的。同時，HDA法有其自身的優(yōu)勢和劣勢，首先，相比較普通PCR和熒光PCR，該方法不需要昂貴的設備，一般實驗室就能夠滿足實驗要求，但是HDA法不具備定量檢測的能力；其次，相比環(huán)介導等溫擴增技術，雖然兩者均不需要昂貴的儀器設備，在等溫的條件下就能夠完成實驗，但是環(huán)介導等溫擴增技術對實驗設計的要求較高，引物的靈敏度較高，這就很容易造成實驗結果的假陽性，而HDA法不存在這一現(xiàn)象，但是昂貴的UvrD helicase、T4 gp32確實是制約該方法推廣的主要因素，但隨著現(xiàn)代化工業(yè)生產的推進，HDA法的應用前景還是非常廣泛的，可成為現(xiàn)代化檢測技術中的重要組成部分。

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Detection of Cronobacter sakazakii in Infant Formula Powder by Helicase-Dependent Isothermal DNA Amplification Assay

ZHOU Wei1,2, ZHANG Wei2, LIU Liang2, LIU Dong2, LI Yong-bo2, TIAN Hao2, ZHANG Yan2,*, ZHANG Zhi-sheng1,*
(1. College of Food Science and Technology, Agricultural University of Hebei, Baoding 071000, China; 2. Hebei Institute of Food Quality Supervision Inspection and Research, Shijiazhuang 050091, China)

Objective: The aim of this study was to establish a helicase-dependent isothermal DNA amplification (HAD) method for rapid and accurate detection of Cronobacter sakazakii in infant formula powder. Methods: A pair of oligonucleotide primers exclusively targeting the internal transcribed spacer (ITS) gene of Cronobacter sakazakii was designed, and the final concentration of UvrD helicase and T4 gp32 were optimized. Cronobacter sakazakii in infant formula powder was then directly detected by this method and amplification products were separated and detected by agarose gel electrophoresis. Results: An amplicon of 100 bp in length was obtained, which was the same as the designed gene fragment by HDA. The sensitivity of HDA was 101CFU/g, the optimized concentration of UvrD helicase was 0.1 μg, and T4 gp32 was 5.0 μg. Conclusion: The helicase-dependent isothermal DNA amplification assay provides a new, specific, sensitive and fast for the detection of Cronobacter sakazakii in infant formula powder.

helicase-dependent isothermal DNA amplification (HDA); infant formula powder; Cronobacter sakazakii; detection

TS201.3

A

1002-6630（2014）04-0155-04

10.7506/spkx1002-6630-201404032

2013-08-01

河北省質量技術監(jiān)督局科技計劃項目（100108）

周?。?983—），男，工程師，博士研究生，研究方向為農產品加工及貯藏工程。E-mail：zhouwei0311@163.com

*通信作者：張巖（1979—），男，教授級高級工程師，博士，研究方向為食品安全。E-mail：snowwinglv@126.com

張志勝（1970—），男，教授，博士，研究方向為畜產品加工原理及技術。E-mail：13833035679@139.com