費(fèi)國(guó)琴，寧喜斌，李曉暉*，宋 娟，李文利

（上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心，上海 201306）

響應(yīng)面分析法優(yōu)化微生物溶菌酶微膠囊制備工藝

費(fèi)國(guó)琴，寧喜斌，李曉暉*，宋 娟，李文利

（上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心，上海 201306）

以海藻酸鈉、殼聚糖為壁材，采用響應(yīng)面法試驗(yàn)對(duì)微生物溶菌酶微膠囊制備條件進(jìn)行優(yōu)化。選取7種因素進(jìn)行Plackett-Burman篩選，得出海藻酸鈉質(zhì)量濃度、殼聚糖質(zhì)量濃度及醋酸質(zhì)量濃度是影響包埋率的3個(gè)主要因素。進(jìn)一步進(jìn)行最陡爬坡試驗(yàn)逼近中心區(qū)域。最后，通過(guò)Box-Behnken試驗(yàn)建立回歸方程，獲得主因素的最佳水平，即質(zhì)量濃度分別為：海藻酸鈉2.00 g/100 mL、殼聚糖0.35 g/100 mL、醋酸0.33 g/100 mL，預(yù)測(cè)微生物溶菌酶最高包埋率為94.635%，經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證后所得的包埋率為92.10%。

微膠囊；海藻酸鈉；殼聚糖；響應(yīng)面；微生物溶菌酶

微生物溶菌酶是由微生物分泌產(chǎn)生的，具有溶解細(xì)菌細(xì)胞壁活性的堿性蛋白質(zhì)[1]，除了具有蛋清溶菌酶的優(yōu)點(diǎn)外，其有著更為廣泛的抑菌譜及更強(qiáng)的抑菌效果[2-10]，因此正逐步受到研究者的重視，在食品、化工、醫(yī)療等領(lǐng)域具有非常廣闊的應(yīng)用前景[11]。目前文獻(xiàn)報(bào)道較肯定蛋清溶菌酶的熱穩(wěn)定性，據(jù)報(bào)道[12]，pH 3.0時(shí)，96 ℃加熱處理15 min仍能保持87%的酶活性，然而對(duì)于微生物溶菌酶，本實(shí)驗(yàn)室先前發(fā)現(xiàn)對(duì)其濕熱90 ℃處理5 min后，酶活只能保留56.2%[13]，此外報(bào)道的多數(shù)由海洋細(xì)菌發(fā)酵產(chǎn)生的溶菌酶的作用范圍為5～50 ℃[14]，說(shuō)明微生物溶菌酶的熱穩(wěn)定性較差。為拓寬微生物溶菌酶的應(yīng)用范圍，及避免某些應(yīng)用方面如飼料加工中高溫?cái)D壓過(guò)程使得酶活損失[15]，以及達(dá)到延長(zhǎng)微生物溶菌酶的儲(chǔ)存穩(wěn)定期或緩慢釋放的目的，將其微膠囊化是一種行之有效的方法。

目前，微膠囊壁材中海藻酸鈉和殼聚糖均為來(lái)源豐富、天然安全的多糖類物質(zhì)[16-17]，大量文獻(xiàn)[18-20]報(bào)道了利用此兩者靜電絡(luò)合的協(xié)同效應(yīng)來(lái)包埋各類芯材物質(zhì)。制備海藻酸鈉-殼聚糖微膠囊操作簡(jiǎn)單、成本低廉且條件溫和，不需要有機(jī)溶劑，尤其適合于有生物活性的蛋白質(zhì)類藥物[21]，因此，是包埋微生物溶菌酶良好的載體。

本實(shí)驗(yàn)即以海藻酸鈉、殼聚糖作為復(fù)合壁材，采用一步法[22]制備微生物溶菌酶微膠囊，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，通過(guò)響應(yīng)面法優(yōu)化最佳制備工藝，得到最大包埋率的條件參數(shù)，以提高微生物溶菌酶在應(yīng)用中的穩(wěn)定性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

海藻酸鈉、氯化鈣、冰醋酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；殼聚糖 濰坊科海甲殼素有限公司；微生物溶菌酶（酶活5000 U/mg） 沈李科貿(mào)有限公司；溶菌酶試劑盒 南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

蠕動(dòng)泵2000A1 上海杰恒有限公司；低速攪拌器GZ120-S 上海壘固有限公司；冷凍干燥機(jī)ADL-75F 科林集團(tuán)；離心機(jī)TD5A-WS 金壇市順華儀器有限公司；THZ-82恒溫水浴鍋 金壇市精達(dá)儀器有限公司；722分光光度計(jì) 上海光學(xué)儀器進(jìn)出口有限公司；SE402F電子分析天平 美國(guó)奧豪斯公司。

1.3 方法

1.3.1 微生物溶菌酶微膠囊的制備

將4 mg/mL的微生物溶菌酶溶液與一定質(zhì)量濃度的海藻酸鈉溶液按1∶1（V/V）混合成100 mL均勻溶液，通過(guò)蠕動(dòng)泵之末端針孔勻速滴入到一定質(zhì)量濃度的氯化鈣和殼聚糖的混合醋酸溶液中，待全部滴完后繼續(xù)靜置于其中固化，隨后用蒸餾水洗滌2次，用紗布瀝干，平鋪于直徑為10 cm的玻璃皿中預(yù)凍6 h后進(jìn)行冷凍干燥，將干燥后的微膠囊收集，稱質(zhì)量，4 ℃保存。

1.3.2 微生物溶菌酶的檢測(cè)

取0.1 g凍干微膠囊溶解在含40 mL磷酸緩沖液（0.1 mol/L，pH 7.5）溶液的離心管中6 h，待溶脹后充分碾碎，于1 000 r/min離心3 min，將上清液稀釋50倍，用溶菌酶試劑盒測(cè)酶活。即取0.2 mL上述樣液加入到2 mL溶壁微球菌混濁液中，另設(shè)空白管和標(biāo)準(zhǔn)管，37 ℃反應(yīng)15 min，冰浴終止反應(yīng)，于波長(zhǎng)530 nm處以蒸餾水調(diào)零，比色，測(cè)各管吸光度，按式（1）、（2）計(jì)算溶菌酶含量和包埋率。

式中：標(biāo)準(zhǔn)管質(zhì)量濃度為2.5 μg/mL，即200 U/mL；w為每0.1 g凍干微膠囊中溶菌酶含量/μg；m1為每批次凍干微膠囊總質(zhì)量/g；m2為每批次微膠囊制備前添加的溶菌酶質(zhì)量/g。

1.3.3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)[23-24]

1.3.3.1 Plackett-Burman試驗(yàn)

一步法制備海藻酸鈉-殼聚糖微膠囊工藝中涉及的參數(shù)較多，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，取N=7的Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)海藻酸鈉質(zhì)量濃度、殼聚糖質(zhì)量濃度、殼聚糖脫乙酰度、殼聚糖相對(duì)分子質(zhì)量、冰醋酸質(zhì)量濃度、氯化鈣質(zhì)量濃度、固定化時(shí)間7個(gè)因素進(jìn)行考察，每個(gè)因素分別取高、低2個(gè)水平，另設(shè)2個(gè)空白，以微生物溶菌酶的包埋率為響應(yīng)值Y，平行試驗(yàn)3次。

1.3.3.2 最陡爬坡試驗(yàn)

響應(yīng)面擬合方程只有在考察的緊接鄰域里才充分近似真實(shí)值，故只有在逼近最大包埋率后才能建立有效的響應(yīng)面擬合方程[25]。根據(jù)Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果的因素效應(yīng)設(shè)計(jì)最陡爬坡試驗(yàn)，得出響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平的中心點(diǎn)。

1.3.3.3 Box-Behnken試驗(yàn)

采用Box-Behnken的中心組合設(shè)計(jì)原理，對(duì)Plackett-Burman設(shè)計(jì)篩選出的重要因素和最陡爬坡設(shè)計(jì)的試驗(yàn)結(jié)果得到的中心點(diǎn)，進(jìn)行三因素三水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)，共12個(gè)析因點(diǎn)和3個(gè)區(qū)域中心點(diǎn)（零點(diǎn)），每組平行試驗(yàn)3次，獲得最優(yōu)制備工藝。通過(guò)Minitab 16.0軟件完成本試驗(yàn)設(shè)計(jì)、數(shù)據(jù)分析和模型建立。

2 結(jié)果與分析

2.1 Plackett-Burman法篩選重要因素

取7個(gè)因素的高水平及低水平值，以微生物溶菌酶包埋率為響應(yīng)值Y，試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1，各水平取值見表2。

表1 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)表Table 1 Experimental design for Plackett-Burman design

表2 Plackett-Burman試驗(yàn)因素及分析結(jié)果Table 2 Analysis of variance for the experimental results of Plackett-Burman dessiiggnn

由表2可知，海藻酸鈉質(zhì)量濃度、殼聚糖質(zhì)量濃度、冰醋酸質(zhì)量濃度此3個(gè)因素對(duì)包埋率影響顯著（P＜0.05），因此作為重要因素進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化。其他因素對(duì)結(jié)果影響不大，在進(jìn)一步研究中，取脫乙酰度為90%、相對(duì)分子質(zhì)量為5×105的殼聚糖，氯化鈣質(zhì)量濃度取2 g/100 mL，固定化時(shí)間取45 min。

2.2 最陡爬坡試驗(yàn)

基于Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果的因素效應(yīng)設(shè)計(jì)最陡爬坡試驗(yàn)，得出響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平的中心點(diǎn)。

表3 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Experimental design of steepest ascent and corresponding results

由表3可知，第3組試驗(yàn)微生物溶菌酶的包埋率最大，說(shuō)明最優(yōu)點(diǎn)在第3組試驗(yàn)附近，故以試驗(yàn)3的條件為響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平的中心點(diǎn)，即海藻酸鈉質(zhì)量濃度、殼聚糖質(zhì)量濃度、冰醋酸質(zhì)量濃度分別為2.1、0.3、0.3 g/100 mL，進(jìn)行下一步研究。

2.3 應(yīng)用響應(yīng)面分析法確定重要因素的最佳水平

表4 Box-Behnken試驗(yàn)參數(shù)水平Table 4 Factors and levels used in Box-Behnken design

表5 響應(yīng)面分析方案及試驗(yàn)結(jié)果Table 5 Experimental design and results for response surface analysis

根據(jù)最陡爬坡試驗(yàn)確定的響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平的中心點(diǎn)，進(jìn)行Box-Behnken試驗(yàn)，因素水平編碼如表4所示，試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表5。以微生物溶菌酶包埋率為響應(yīng)值Y，對(duì)表5試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸擬合后，得到預(yù)測(cè)值Y對(duì)編碼自變量X1、X2和X3的二次多項(xiàng)回歸方程：

Y=93.047－3.219X1＋5.819X2＋5.637X3－5.668X1

2－8.463X2

2－12.071X32＋5.285X1X2＋3.973X1X3－5.798X2X3

為檢驗(yàn)方程有效性，利用分析軟件進(jìn)一步對(duì)其進(jìn)行分析，其系數(shù)顯著性結(jié)果見表6，方差分析見表7。

表6 回歸系數(shù)顯著性分析Table 6 Results of regression analysis

表7 模型方差分析Table 7 Analysis of variance for the regression model

由表6中一次項(xiàng)回歸系數(shù)的絕對(duì)值大小可以到各自變量對(duì)響應(yīng)值的影響程度依次為：殼聚糖質(zhì)量濃度＞醋酸質(zhì)量濃度＞海藻酸鈉質(zhì)量濃度。海藻酸鈉質(zhì)量濃度和殼聚糖質(zhì)量濃度、殼聚糖質(zhì)量濃度和醋酸質(zhì)量濃度交互顯著（P＜0.05），海藻酸鈉質(zhì)量濃度和醋酸質(zhì)量濃度交互不顯著（P＞0.05）。

從表7可知，海藻酸鈉質(zhì)量濃度、殼聚糖質(zhì)量濃度、醋酸質(zhì)量濃度的一次項(xiàng)和二次項(xiàng)對(duì)微生物溶菌酶微膠囊中的包埋率的影響是極顯著的（P＜0.01），表明試驗(yàn)因素對(duì)響應(yīng)值不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系。另外，此模型的P＜0.05，響應(yīng)面回歸模型達(dá)到顯著水平。模型的調(diào)整確定系數(shù)R2=0.924 4，表明92.44%的數(shù)據(jù)可以由這個(gè)方程解釋。失擬項(xiàng)P=0.116（P＞0.05），表明該模型穩(wěn)定性好。因此，該二次方程能夠較好地?cái)M合真實(shí)的響應(yīng)面，來(lái)預(yù)測(cè)微生物溶菌酶微膠囊的包埋率的變化。

2.4 響應(yīng)曲面及等高線分析

將表5的試驗(yàn)結(jié)果經(jīng)分析軟件處理，繪制其響應(yīng)面曲線及等值線圖，由圖1可以看出，當(dāng)醋酸質(zhì)量濃度在0.3 g/100 mL不變時(shí)，海藻酸鈉質(zhì)量濃度在1.5～2.7 g/100 mL之間，微膠囊的包埋率呈現(xiàn)先升高后降低趨勢(shì)，海藻酸鈉質(zhì)量濃度和殼聚糖質(zhì)量濃度兩者交互顯著。

圖1 包埋率與海藻酸鈉質(zhì)量濃度、殼聚糖質(zhì)量濃度的曲面圖與等值線圖Fig.1 Response surface and contour plots for the effect of alginate and chitosan concentration on microencapsulation efficiency

圖2 包埋率與海藻酸鈉質(zhì)量濃度、醋酸質(zhì)量濃度的曲面圖與等值線圖Fig.2 Response surface and contour plots for the effect of alginate and acetic acid concentration on microencapsulation efficiency

由圖2可以看出，當(dāng)殼聚糖質(zhì)量濃度保持在0.3 g/100 mL時(shí)，醋酸質(zhì)量濃度在0.1～0.5 mg/100 mL間，微膠囊包埋率先上升后下降。海藻酸鈉質(zhì)量濃度和醋酸質(zhì)量濃度交互不顯著。

圖3 包埋率與殼聚糖質(zhì)量濃度、醋酸質(zhì)量濃度的曲面圖與等值線圖Fig.3 Response surface and contour plots for the effect of chitosan andacetic acid concentration on microencapsulation efficiency

由圖3可知，當(dāng)海藻酸鈉質(zhì)量濃度保持在2.1 g/100 mL時(shí)，殼聚糖在0.1～0.5 g/100 mL間，微膠囊包埋率先上升后下降。殼聚糖質(zhì)量濃度和醋酸質(zhì)量濃度交互顯著。

2.5 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

為了進(jìn)一步確證計(jì)算機(jī)模擬得到最佳點(diǎn)的值，對(duì)所得的回歸方程取一階偏導(dǎo)等于零并整理得：

聯(lián)立求解，得X1=－0.110，X2=0.257，X3=0.154。代入回歸方程得Y=94.635%。又由各因素編碼與其真實(shí)值之問(wèn)的關(guān)系，可求得當(dāng)包埋率為94.635%時(shí)，海藻酸鈉、殼聚糖、醋酸的真實(shí)質(zhì)量濃度分別為2.034、0.3514、0.330 8 g/100 mL。

為了對(duì)預(yù)測(cè)的結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，用以上得到的最優(yōu)條件進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表8。

表8 試驗(yàn)結(jié)果的驗(yàn)證Table 8 Validation of the optimized conditions

為方便操作，分別取海藻酸鈉、殼聚糖、醋酸質(zhì)量濃度為2.00、0.35、0.33 g/100 mL進(jìn)行驗(yàn)證，所得包埋率測(cè)量值為92.10%，與理論值接近，可見該模型可以較好的預(yù)測(cè)實(shí)際包埋情況。

3 結(jié) 論

實(shí)驗(yàn)首先通過(guò)Plackett-Burman設(shè)計(jì)確定出影響微生物溶菌酶微膠囊包埋率的主要工藝參數(shù)，即海藻酸鈉質(zhì)量濃度、殼聚糖質(zhì)量濃度及醋酸質(zhì)量濃度，再通過(guò)最陡爬坡試驗(yàn)和響應(yīng)面分析法對(duì)此三因素三水平得出的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，建立響應(yīng)面的二次回歸擬合方程，得出最大響應(yīng)值及對(duì)應(yīng)的自變量編碼值，即得到海藻酸鈉、殼聚糖、醋酸的最優(yōu)質(zhì)量濃度分別為2.034 0、0.351 4、0.330 8 g/100 mL，包埋率為94.635%。為方便操作，質(zhì)量濃度分別取海藻酸鈉2.00 g/100 mL、殼聚糖0.35 g/100 mL、醋酸0.33 g/100 mL，進(jìn)行3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，結(jié)果得出實(shí)際包埋率為92.10%，與理論預(yù)測(cè)值基本吻合。經(jīng)過(guò)優(yōu)化后，微生物溶菌酶包埋率有一定提高，在實(shí)際應(yīng)用中具有一定的指導(dǎo)意義。

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Optimization of Preparation Conditions for Microbial Lysozyme Microcapsule by Response Surface Methodology

FEI Guo-qin, NING Xi-bin, LI Xiao-hui*, SONG Juan, LI Wen-li
(Shanghai Engineering Research Center of Aquatic-Product Processing & Preservation, College of Food Science and Technology, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China)

In this work, response surface methodology (RSM) was applied to optimize the conditions for preparing microbial lysozyme microcapsule by using sodium alginate and chitosan as coating materials. First, Plackett-Burman design (PBD) was used to evaluate the effects of seven preparation conditions on the microencapsulation efficiency of microbial lysozyme, and the concentrations of sodium alginate, chitosan and acetic acid were identified as main affecting factors. Then the steepest ascent method was adopted to access the optimal region of the significant factors. At last, the optimal conditions for microcapsule preparation were obtained from the regression equation established using Box-Behnken experimental design as follows: sodium alginate, 2.00 g/100 mL; chitosan, 0.35 g/100 mL; and acetic acid, 0.33 g/100 mL. Under these optimal conditions, the maximum predicted microencapsulation efficiency was 94.635% and the experimentally measured value was 92.10%.

microcapsule; alginate; chitosan; response surface method; microbial lysozyme

TS201.3

A

1002-6630（2014）04-0011-05

10.7506/spkx1002-6630-201404003

2013-03-03

上海市教育委員會(huì)科研創(chuàng)新項(xiàng)目（10YZ126）；上海市科委工程中心建設(shè)項(xiàng)目（11DZ2280300）；上海海洋大學(xué)博士啟動(dòng)基金項(xiàng)目（A-2400-09-0146）

費(fèi)國(guó)琴（1988—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。E-mail：feiguoqin0528@163.com

*通信作者：李曉暉（1975—），女，副教授，博士，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。E-mail：xhli@shou.edu.cn