李 明 譚詩云

武漢大學人民醫(yī)院消化內(nèi)科，湖北武漢 430060

研究表明，非甾體類消炎藥（non-steroid anti-in-flammatory drugs，NSAIDs）能降低結(jié)腸癌的發(fā)生，減少家族性結(jié)腸息肉患者息肉數(shù)量和大小，并能預防結(jié)腸腺瘤的復發(fā)[1]。本室前期研究顯示[2]乙酰水楊酸能抑制結(jié)腸癌細胞系環(huán)氧合酶-2（COX-2）表達而抑制生長，并誘導細胞凋亡。 但臨床研究表明長期應用NSAIDs可引起胃潰瘍甚至胃出血及一系列心血管不良反應，限制了其在臨床上的廣泛應用。 因此尋找毒性小，而又能有效的抑制COX-2 的抑制劑， 是大腸癌化學預防的重要課題。

丹皮酚具有與非甾體類抗炎藥相似的藥理作用，包括解熱鎮(zhèn)痛、抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抑制血小板聚集、抗血栓形成和中樞抑制作用等，且其副作用小。 課題組前期[3-5]觀察了丹皮酚對大腸癌HT-29 細胞凋亡及凋亡相關基因的影響，發(fā)現(xiàn)丹皮酚可抑制大腸癌細胞的增殖生長， 調(diào)節(jié)凋亡相關基因如Bcl-2、Bax、Fas 及p53 等的表達，且丹皮酚能夠影響腫瘤細胞的生長周期，并與5-Fu 具有協(xié)同作用。丹皮酚與非甾體類抗炎藥均能有效下調(diào)COX-2 的表達量， 從而發(fā)揮抗腫瘤作用。本研究在此基礎上進一步探討了丹皮酚對人結(jié)腸癌LoVo 細胞內(nèi)Ca2+含量及RUNX-3 基因的影響。

1 資料與方法

1.1 細胞及試劑

人結(jié)腸癌細胞系LoVo 細胞購于中國科學院上海細胞庫； 丹皮酚注射液購于寧波天真制藥有限公司，純度≥99.9%；AnnexinV/PI 試劑盒購于BENDER 公司；CCK-8 試劑盒購自碧云天生物技術研究所；胎牛血清、DMEM/F12 培養(yǎng)基、DEPC 購于杭州四季青生物材料研究所；Fluo-3/AM 購于日本同仁化學研究所；Trizol 試劑、DEPC、異丙醇、氯仿、RT-PCR 試劑盒等購于武漢谷歌生物技術有限公司；RUNX-3 單克隆抗體購自Cell Signaling Technology 公司；辣根酶標記兔抗山羊IgG 購自武漢博士德生物科技有限公司。

1.2 細胞培養(yǎng)

LoVo 細胞培養(yǎng)于含10%小牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液中，置于37℃，飽和濕度，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每2～3 天傳代1 次，取對數(shù)生長期細胞用于實驗。

1.3 CCK-8 比色法檢測丹皮酚對LoVo 細胞活力的影響

取對數(shù)生長期的LoVo 細胞，以5×104/mL 的濃度接種于96 孔板，每孔200 μL，待細胞貼壁后分組，丹皮酚組加入丹皮酚終濃度分別為15.63、31.25、62.50、125、250 mg/L 的培養(yǎng)液，對照組加入等量的培養(yǎng)液。 每組設5 個復孔，分別培養(yǎng)24、48、72、96 h，實驗終止前2 h 每孔加入CKK-8 試劑20 μL，孵育2 h，酶標儀測定450 nm 處的吸光值，即A 值，細胞存活率=處理組A 值/對照組A 值×100%。

1.4 細胞形態(tài)的觀察

取對數(shù)生長期LoVo 細胞消化傳代并培養(yǎng)24 h后，換丹皮酚終濃度為15.63～250 mg/L 的培養(yǎng)液連續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h 后置于顯微鏡下觀察細胞生長情況。

1.5 流式細胞儀檢測丹皮酚對LoVo 細胞凋亡率的影響

取對數(shù)生長期的LoVo 細胞， 以1×106/mL 濃度接種于6 孔培養(yǎng)板中， 貼壁后分為實驗組和對照組，實驗組分別加入含丹皮酚（終濃度為31.25、62.50、125 mg/L）的培養(yǎng)液，對照組加入等量培養(yǎng)液，培養(yǎng)48 h后，收集細胞，離心、洗滌、固定后加入AnnexinV-FITC和PI 染色。 篩網(wǎng)過濾送流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.6 激光掃描共聚焦顯微鏡檢測丹皮酚對LoVo 細胞內(nèi)Ca2+濃度的影響

取對數(shù)生長期的LoVo 細胞，以1×106/mL 接種于特制培養(yǎng)皿中，分組及處理同上，培養(yǎng)48 h 后，HBSS液洗滌3 次， 加入濃度為5 μmol/L 的Fluo-3/AM 工作液300 μL，孵育60 min，用HBSS 液洗滌3 次，加入HBSS 液覆蓋細胞，孵育30 min。 置于激光掃描共聚焦顯微鏡上檢測，隨機選取5 個視野（放大100倍），每個視野隨機選取7 個細胞，利用隨機軟件測定其熒光強度。 其熒光強度與細胞內(nèi)Ca2+濃度成正相關，可準確反映細胞內(nèi)Ca2+濃度的變化。

1.7 RT-PCR 法檢測丹皮酚對LoVo 細胞RUNX-3 mRNA 的影響

細胞接種及分組同上，培養(yǎng)48 h 后，收集細胞，按Trizol 試劑說明書一步法提取總RNA， 計算出RNA 濃度，按RT 試劑盒操作說明合成cDNA，并進行聚合酶鏈反應（PCR）。 PCR 反應條件：94℃4min；94℃30 s，51℃30 s，72℃25 s；30 cycles，72℃4 min。取5 μL PCR 產(chǎn)物進行2%瓊脂糖凝膠電泳， 紫外光下觀察并拍照。 RT-PCR 采用的β-actin 及RUNX3引物由南京金瑞斯合成，RUNX3 上游引物為5'-CAGAAGCTGGAGGACCAGAC-3'，下游引物為5'-TCGGAGAATGGGTTCAGTTC-3'，β-actin 上游引物為5'-CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC-3'， 下游引物為5'-TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT-3'， 擴增片段長度分別為179 bp 和240 bp，β-actin 為內(nèi)參。

1.8 Western blot 檢測丹皮酚對LoVo 細胞RUNX-3蛋白表達的影響

細胞接種及分組同上，收集細胞，用磷酸鹽緩沖液（PBS）漂洗，參照細胞漿蛋白抽提試劑盒說明書進行操作，提取細胞總蛋白，并測定蛋白濃度，蛋白樣品加入1/5 體積的5×上樣緩沖液，沸水煮沸5 min 后離心，以每孔20 μg/孔上樣，行10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后電轉(zhuǎn)至PVDF 膜上，用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h， 加入1∶1000 稀釋的兔抗人RUNX-3 蛋白，4℃過夜，β-actin 作為內(nèi)參，TBST 洗膜3 次，加入1∶1000稀釋的辣根酶標記的兔抗山羊IgG，室溫孵育2 h，同樣洗膜3 次，ECL 顯色，觀察各條帶深淺變化。

1.9 統(tǒng)計學方法

采用統(tǒng)計軟件SPSS 17.0 對數(shù)據(jù)進行分析， 正態(tài)分布計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，多組間比較采用方差分析， 兩兩比較采用LSD-t 檢驗。 以P <0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 丹皮酚對LoVo 細胞活力的影響

丹皮酚在15.63～250 mg/L 濃度范圍內(nèi)均能有效降低結(jié)腸癌LoVo 細胞的生存率，在相同處理時間，隨著藥物濃度的增加，細胞生存率逐漸降低；同一藥物濃度，隨著作用時間的延長，細胞生存率也逐漸降低，即呈顯著的劑量和時間依賴效應， 與對照組比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P < 0. 05）。 見圖1。

圖1 丹皮酚對LoVo 細胞增殖的影響（n = 5）

2.2 細胞形態(tài)學觀察

倒置顯微鏡下可見對照組細胞生長旺盛，折光率較高，胞體大，形態(tài)成梭形或多邊形，胞質(zhì)均勻透明，隨培養(yǎng)時間延長變化不大。 實驗組細胞增殖減慢，且隨著丹皮酚濃度的增大和作用時間的延長，細胞逐漸變小、變圓，折光率減弱，核濃縮等，部分脫落漂浮于培養(yǎng)瓶中，但細胞膜完整，最后裂解。 丹皮酚濃度越高，作用時間越長，上述表現(xiàn)越明顯，漂浮細胞越多。

250 mg/L 丹皮酚組可見大量懸浮的細胞碎片。

2.3 丹皮酚對LoVo 細胞凋亡率的影響

流式細胞儀檢測結(jié)果顯示，丹皮酚濃度為0 mg/L時，細胞凋亡率為（2.3±0.9）%；丹皮酚濃度分別為31.25、62.50、125 mg/L 作用 細胞48 h 后， 凋亡率分別為（12.3±1.3）%、（22.4±1.5）%、（36.2±2.1）%， 與對照組[（2.3±0.9）%]比較，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05），表明丹皮酚能誘導LoVo 細胞凋亡。 見圖2。

2.4 丹皮酚對LoVo 細胞內(nèi)Ca2+含量的影響

圖2 丹皮酚對細胞凋亡率的影響

鈣離子熒光劑Fluo-3/AM 能特異性與Ca2+結(jié)合，本研究所測的熒光強度反映的是細胞內(nèi)Ca2+含量的相對水平，并不代表實際細胞內(nèi)Ca2+含量。 如圖3 所示， 丹皮酚作用后人結(jié)腸癌LoVo 細胞內(nèi)Ca2+熒光強度明顯增強，且隨著濃度的升高而增強。 圖像分析結(jié)果顯示，對照組（丹皮酚濃度為0 mg/L）細胞內(nèi)游離Ca2+熒光強度為 （24.45±3.74）， 丹皮酚濃度分別為31.25、62.50、125 mg/L 時作用LoVo 細胞48 h 后，熒光強度分別為（41.36±4.62），（57.51±3.83）和（69.43±3.76）；丹皮酚組與對照組比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。 見圖3。

2.5 丹皮酚對LoVo 細胞RUNX-3 mRNA 表達的影響

瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，RUNX-3 基因的擴增產(chǎn)物條帶為179 bp， 內(nèi)參β-actin 條帶為240 bp，與所設計的片段大小一致， 丹皮酚處理人結(jié)腸癌LoVo細胞48 h 后，RUNX-3 基因的表達均上調(diào)，且隨藥物濃度的升高，LoVo 細胞RUNX-3 基因的表達量亦升高，呈明顯劑量依賴效應。 見圖4。

2.6 丹皮酚對RUNX-3 蛋白表達的影響

丹皮酚處理LoVo 細胞48 h 后，結(jié)果顯示隨著丹皮酚濃度的升高，RUNX-3 蛋白表達量也逐漸升高。見圖5。

3 討論

細胞凋亡是維持多細胞機體平衡的一個重要生理機制，細胞凋亡與細胞增殖之間的平衡在結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展中起重要作用[6]，細胞凋亡是程序化、多基因調(diào)控的細胞死亡過程，通過誘導細胞凋亡已經(jīng)成為抗腫瘤研究的熱點。 有研究證實，丹皮酚在體內(nèi)外均能抑制多種腫瘤細胞的增殖生長并誘導細胞凋亡[7-8]。本研究發(fā)現(xiàn)，丹皮酚在15.63～250 mg/L 濃度范圍，對人結(jié)腸癌LoVo 細胞的增殖均有抑制作用， 隨著藥物濃度的升高和作用時間的延長，抑制細胞增殖的作用亦逐步增強，呈現(xiàn)明顯的濃度效應及時間效應關系。 丹皮酚處理人結(jié)腸癌LoVo 細胞后， 在倒置顯微鏡下均可見到凋亡細胞的形態(tài)；流式細胞儀檢測其細胞凋亡率隨著藥物濃度的增加而升高， 呈明顯的劑量依賴效應， 表明丹皮酚可抑制結(jié)腸癌LoVo 細胞的增殖及誘導其發(fā)生凋亡。

圖3 激光共聚焦顯微鏡檢測丹皮酚對LoVo [Ca2+]i 的影響

圖4 丹皮酚對LoVo 細胞RUNX3 mRNA 表達的影響

圖5 Western blot 檢測丹皮酚對LoVo 細胞RUNX3 蛋白表達的影響

細胞內(nèi)Ca2+廣泛參與細胞的增殖、分化、運動及凋亡等病理生理過程[9]，鈣離子在誘導細胞凋亡中的重要作用已經(jīng)有大量實驗證實[10]，研究顯示，在細胞凋亡早期和晚期階段細胞內(nèi)Ca2+均增加， 細胞內(nèi)Ca2+濃度升高被認為是細胞凋亡的啟動環(huán)節(jié)[11]。 本研究發(fā)現(xiàn)丹皮酚處理后，LoVo 細胞內(nèi)Ca2+熒光強度均明顯增強，且隨著藥物濃度的升高而增強，呈明顯的劑量效應關系，與對照組比較，有顯著差異性（P < 0.05）。LoVo 細胞內(nèi)Ca2+含量的增加與細胞凋亡率呈平行關系， 且這種效應隨著藥物濃度的增加而增強。 提示LoVo 細胞內(nèi)Ca2+含量增多與藥物作用有關，表明Ca2+升高在丹皮酚抑制腫瘤細胞生長和誘導細胞凋亡機制中可能起重要作用，提示調(diào)節(jié)細胞內(nèi)Ca2+含量從而抑制結(jié)腸癌細胞增殖及誘導其凋亡可能是其作用機制之一。 因此，增加細胞內(nèi)Ca2+含量可能成為結(jié)腸癌治療的一個作用靶點。 丹皮酚具體參與Ca2+通道運輸系統(tǒng)的調(diào)控及丹皮酚誘導細胞凋亡的信號通路還需進一步研究。

此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，丹皮酚能上調(diào)LoVo 細胞中人類相關轉(zhuǎn)錄因子3（human runt-related transcription factor 3，RUNX3）基因表達，且表達量隨著藥物濃度的升高而增加，呈明顯濃度效應。大量研究證明，轉(zhuǎn)錄生長因子-β （transforming growth factor，TGF-β）和Wnt 信號通路在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用[12-13]。 RUNX3 參與TGF-β 信號通路誘導生長抑制的過程[14]。 研究證實，RUNX3 基因在多種腫瘤如乳腺癌、胃癌、大腸癌、肝癌及肺癌等腫瘤中表達下調(diào)甚至缺失，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用[15-16]。有證據(jù)表明，恢復RUNX3 基因的表達能通過誘導細胞凋亡、調(diào)節(jié)細胞周期及下調(diào)cyclin D1 的表達而顯著抑制腫瘤細胞增殖及轉(zhuǎn)移[17-18]。本研究發(fā)現(xiàn)，丹皮酚能抑制腫瘤細胞向G1期行進和G1/S 轉(zhuǎn)換 （結(jié)果待發(fā)）。 并且RUNX3 基因表達上調(diào)趨勢與流式細胞儀檢測的凋亡率增升高趨勢是一致的。 因此，推測丹皮酚能通過上調(diào)RUNX3 基因表達影響細胞周期促進細胞凋亡，進而發(fā)揮抗腫瘤作用。

本研究還發(fā)現(xiàn)， 經(jīng)丹皮酚處理后，LoVo 細胞內(nèi)Ca2+含量與RUNX3 基因表達均升高， 即丹皮酚一方面能增加細胞內(nèi)Ca2+含量， 另一方面又能促進RUNX3 基因表達， 表明兩者可能處于同一條信號轉(zhuǎn)導通路上。 研究表明，細胞內(nèi)Ca2+含量增加參與包括基因轉(zhuǎn)錄及細胞凋亡在內(nèi)的多種生物反應過程[19-20]，提示細胞內(nèi)Ca2+含量與RUNX3 基因相互協(xié)調(diào)抑制結(jié)腸癌細胞增殖及誘導細胞凋亡。丹皮酚能有效抑制結(jié)腸癌細胞增殖并誘導細胞凋亡，增加細胞內(nèi)Ca2+含量及上調(diào)RUNX3 基因的表達。 由此推測，丹皮酚和阿司匹林可能通過增加細胞內(nèi)Ca2+含量， 上調(diào)LoVo 細胞RUNX3 基因的表達，恢復了TGF-β 信號通路生理功能，并抑制了Wnt 信號通路，抑制LoVo 細胞增殖并促進腫瘤細胞凋亡，從而發(fā)揮抗腫瘤作用。

腫瘤的凋亡是一個復雜而又精確調(diào)控的網(wǎng)絡系統(tǒng)，Ca2+含量與RUNX3 基因之間相關信號通道，是下一步要進行的工作。

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