張 睿 張 軍 趙承斌

哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院骨科，黑龍江哈爾濱 150086

周圍神經(jīng)損傷是骨科常見的疾病之一，雖然周圍神經(jīng)具有一定的再生能力，但對(duì)于較大缺損卻很難自身修復(fù)[1]。隨著組織工程學(xué)領(lǐng)域研究的深入，神經(jīng)干細(xì)胞 （NSCs） 已被公認(rèn)為是對(duì)神經(jīng)損傷修復(fù)的有效方法，通過(guò)NSCs 在神經(jīng)斷端的不斷分化，使受損的周圍神經(jīng)重新恢復(fù)連接。然而單純形態(tài)學(xué)得連接不能保證神經(jīng)的傳導(dǎo)功能，有研究表明，這與NSCs 分化過(guò)程中分化為膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元的比例有關(guān)[2]，提高神經(jīng)元的分化比例，降低膠質(zhì)細(xì)胞的表達(dá)可有效提高神經(jīng)的傳導(dǎo)速度，因此許多學(xué)者通過(guò)不同方法促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元的分化[3-5]，均取得了一定進(jìn)展。 本研究通過(guò)激活態(tài)雪旺細(xì)胞（SCs）刺激NSCs 的分化，觀察其誘導(dǎo)NSCs 分化為神經(jīng)元的能力。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

雌性SD 大鼠[中國(guó)農(nóng)科院哈爾濱獸醫(yī)研究所提供，許可證號(hào)：SYXK（黑）2006-032]；DMEM/F12 細(xì)胞培養(yǎng)基（Hyclone 公司，美國(guó)）；青-鏈雙抗，胰蛋白酶，Ⅱ型膠原酶 （碧云天， 中國(guó)）； 兔抗鼠單克隆抗體Nestin，F(xiàn)ITC 標(biāo)記的羊抗兔IgG，兔抗鼠堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（bFGF）、表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（EGF）單克隆抗體，兔抗鼠MAP-2、GFAP 單克隆抗體（武漢博士德公司）；Transwell 培養(yǎng)皿（Corning 公司，美國(guó)）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 神經(jīng)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)與鑒定 取出生24 h 內(nèi)的SD 大鼠，斷髓處死后無(wú)菌條件下取出脊髓，顯微鏡下剝離硬脊膜，剪成5 mm3組織塊，加入0.25%胰酶消化10 min，用吸管反復(fù)吹打至單細(xì)胞懸液，加入5 mL DMEM/F12 培養(yǎng)基終止消化。 1000 r/min 離心5 min，棄上清，加入含20 ng/mL 的EGF 和20 ng/mL的DMEM/F12 培養(yǎng)液，重懸后移入細(xì)胞培養(yǎng)瓶，置于37℃含5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 每6～8 天傳代1次，連續(xù)傳4 代。 取第4 代神經(jīng)球，移入含有多聚賴氨酸包被的蓋玻片的6 孔板內(nèi)，24 h 后取出蓋玻片，4%多聚甲醛固定，加入兔抗鼠Nestin（1∶100）單克隆抗體作為一抗，4℃過(guò)夜，加入異硫氰酸熒光素（FITC）標(biāo)記的羊抗兔二抗，孵育30 min，進(jìn)行觀察。

1.2.2 雪旺細(xì)胞的分離培養(yǎng) 取體重（100±5）g 的SD大鼠，10%水合氯醛3 mL/kg 腹腔麻醉后，以右側(cè)臀大肌為中心消毒， 鋪無(wú)菌孔巾， 縱行做一長(zhǎng)約1.5 cm 切口，分離暴露坐骨神經(jīng)，于近端結(jié)扎，逐層縫合。 1 周后，處死大鼠，分離雙側(cè)坐骨神經(jīng)，右側(cè)坐骨神經(jīng)由于結(jié)扎變性，SCs 受刺激而發(fā)生激活， 稱激活態(tài)SCs；左側(cè)為正常坐骨神經(jīng)，提取的SCs 稱為普通SCs。 雙側(cè)坐骨神經(jīng)均剪成5 mm 小段， 加入0.1%胰蛋白酶和0.25%的Ⅱ型膠原酶消化1 h， 反復(fù)吹打至單細(xì)胞懸液，加入5 mL DMEM/F12 培養(yǎng)基終止消化。 采用差速貼壁法，使成纖維細(xì)胞貼壁，未貼壁細(xì)胞移入含20 ng/mL EGF 和20 ng/mL 的DMEM/F12 培 養(yǎng)液中行原代培養(yǎng)。

1.2.3 細(xì)胞的分組與聯(lián)合培養(yǎng) 將細(xì)胞隨機(jī)分為3 組，A 組為激活態(tài)SCs 與NSCs 聯(lián)合培養(yǎng)，B 組為普通SCs 與NSCs 聯(lián)合培養(yǎng)，C 組NSCs 單獨(dú)培養(yǎng)， 作為對(duì)照。 細(xì)胞的聯(lián)合培養(yǎng)采用0.2 μm 的6 孔Transwell 培養(yǎng)皿，上室為SCs，下室為NSCs。 培養(yǎng)基采用不含任何營(yíng)養(yǎng)因子的DMEM/F12 培養(yǎng)基。于培養(yǎng)的第2、4、6天分別對(duì)下室細(xì)胞行MTT 染色，檢測(cè)細(xì)胞活性。

1.2.4 Western blot 檢測(cè)激活態(tài)雪旺細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)因子的表達(dá)水平 聯(lián)合培養(yǎng)1 周后， 取A、B 兩組上室細(xì)胞，提取總蛋白，進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，分別加入兔抗鼠EGF（1∶100）、bFGF（1∶200）單克隆抗體，4℃過(guò)夜，加入AP 顯色液顯色。 用Image-ProPlus 專業(yè)圖像分析系統(tǒng)測(cè)定平均光密度值，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.2.5 神經(jīng)干細(xì)胞分化的免疫熒光檢測(cè) 聯(lián)合培養(yǎng)1周后，將多聚賴氨酸包被的蓋玻片放入下室，24 h 后取出蓋玻片，4%多聚甲醛固定， 分別加入兔抗鼠MAP-2（1∶200）、GFAP（1∶200）單克隆抗體作為一抗，4℃過(guò)夜，加入FITC 標(biāo)記的羊抗兔IgG 二抗（1∶200），室溫孵育30 min。 在100 倍熒光顯微鏡下隨機(jī)選取6 個(gè)不同視野， 計(jì)數(shù)抗原陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)與全部細(xì)胞數(shù)，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)在全部細(xì)胞中的比值，公式為：陽(yáng)性細(xì)胞比值=陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 18.0 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析， 正態(tài)分布計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用方差分析， 兩兩比較采用LSD-t 檢驗(yàn)。 以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)與鑒定

NSCs 在培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)懸浮生長(zhǎng)，呈圓形，核較大，折光性強(qiáng)。于培養(yǎng)第5 天開始聚集成團(tuán)，呈球樣生長(zhǎng)，第7 天左右可見部分神經(jīng)球出現(xiàn)貼壁， 并發(fā)出短小突起。傳4 代后，NSCs 形態(tài)穩(wěn)定，未見異型性改變。熒光染色可見聚集成球的NSCs 發(fā)出綠色熒光，可見因貼壁而發(fā)出的短促突起。

2.2 激活態(tài)雪旺細(xì)胞的分離培養(yǎng)

結(jié)扎SD 大鼠右側(cè)坐骨神經(jīng)后，大鼠出現(xiàn)右下肢跛行，1 周后有足部有潰瘍形成。 分離雙側(cè)坐骨神經(jīng)，可見結(jié)扎遠(yuǎn)端坐骨神經(jīng)明顯較對(duì)側(cè)增粗。細(xì)胞經(jīng)差速貼壁以后可見胞體較大的成纖維細(xì)胞得以去除，去除后細(xì)胞呈梭形，3 d 后，胞體增長(zhǎng)，發(fā)出突起，至7 d 細(xì)胞大量增殖呈旋渦狀排列，激活態(tài)SCs 生長(zhǎng)速度較普通SCs 的生長(zhǎng)速度快。

2.3 各組神經(jīng)干細(xì)胞的分化狀態(tài)

A 組NSCs 在培養(yǎng)5 d 后即開始發(fā)出較長(zhǎng)突起，出現(xiàn)貼壁細(xì)胞，細(xì)胞形態(tài)增長(zhǎng)，細(xì)胞間借突起形成網(wǎng)狀連接。 B 組細(xì)胞在8 d 后開始出現(xiàn)分化，但細(xì)胞發(fā)出的突起較A 組短小。 C 組細(xì)胞仍呈球形生長(zhǎng)，少見貼壁細(xì)胞。 應(yīng)用MTT 法檢測(cè)三組細(xì)胞的平均光密度值，可見第2、4 天三組細(xì)胞的活性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05），第6 天C 組活細(xì)胞比例開始降低，A、B 組與C 組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P < 0.05），A 組與B組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。 見圖1。

圖1 MTT 法對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞活性的檢測(cè)

2.4 激活態(tài)雪旺細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)因子的表達(dá)水平

A、B 兩組上室細(xì)胞提取的蛋白經(jīng)電泳后，條帶清晰，兩組相同蛋白密度有差異，管家基因GAPDH 作為內(nèi)參，電泳條帶亮度一致。應(yīng)用Image-ProPlus 專業(yè)圖像分析系統(tǒng)測(cè)定平均光密度值，根據(jù)公式：相對(duì)量=產(chǎn)物電泳條帶密度/GAPDH×100%，計(jì)算各組蛋白量，可見A 組細(xì)胞EGF、bFGF 的表達(dá)水平均高于B 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。 見表1。

表1 雪旺細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)因子表達(dá)的平均光密度值（±s）

表1 雪旺細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)因子表達(dá)的平均光密度值（±s）

注：EGF：表皮生長(zhǎng)因子，bFGF：堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子

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2.5 神經(jīng)干細(xì)胞分化的免疫熒光檢測(cè)

對(duì)三組細(xì)胞分別進(jìn)行MAP-2 和GFAP 染色，計(jì)算每高倍視野陽(yáng)性細(xì)胞的比例。A 組細(xì)胞MAP-2 染色陽(yáng)性率明顯高于B、C 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；B 組MAP-2 染色陽(yáng)性率明顯高于C 組， 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。A 組GFAP 陽(yáng)性率明顯低于B 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）；C 組GFAP 陽(yáng)性率明顯低于A、B 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。 見表2。

表2 免疫熒光染色陽(yáng)性細(xì)胞在分化細(xì)胞中的比例（%，±s）

表2 免疫熒光染色陽(yáng)性細(xì)胞在分化細(xì)胞中的比例（%，±s）

注：與A 組比較，*P ＜0.05；與C 組比較，▲P ＜0.05

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3 討論

各種外傷或病變所致的周圍神經(jīng)損傷一直以來(lái)都是顯微外科研究的重點(diǎn)內(nèi)容。雖然周圍神經(jīng)具有自我修復(fù)能力， 但是如果缺損大于10 mm 以上則很難使近端神經(jīng)纖維長(zhǎng)入[6]，從而造成永久性的功能喪失。為此有學(xué)者研制出干細(xì)胞結(jié)合導(dǎo)管支架的技術(shù)[7-10]，使得周圍神經(jīng)的斷端得以重連，然而單純的形態(tài)學(xué)重建卻難以恢復(fù)神經(jīng)的傳導(dǎo)速度。 有研究指出NSCs 在體內(nèi)主要分化為膠質(zhì)細(xì)胞，而膠質(zhì)細(xì)胞則會(huì)影響神經(jīng)元的傳導(dǎo)速度[11-12]，因此NSCs 如何高效分化出神經(jīng)元就成為研究關(guān)鍵。

周圍神經(jīng)損傷后， 損傷遠(yuǎn)端軸突發(fā)生華勒變性，繼而壞死溶解，周圍的SCs 此時(shí)會(huì)發(fā)生增殖，一方面吞噬溶解的軸突，另一方面分泌大量神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子促進(jìn)近端軸突的長(zhǎng)入[13-14]。 本研究利用雪旺細(xì)胞這一特點(diǎn)，于體外建立SCs，使其持續(xù)分泌多種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，誘導(dǎo)NSCs 的分化。有研究指出，NSCs 的生長(zhǎng)分化需要多種營(yíng)養(yǎng)因子的協(xié)同作用[15-16]，盡管某一因子的濃度較低，但卻是不可或缺的。 體外添加營(yíng)養(yǎng)因子則難以滿足干細(xì)胞分化的要求[17-18]。 本研究運(yùn)用細(xì)胞聯(lián)合培養(yǎng)的方式，通過(guò)細(xì)胞間的旁分泌作用，克服這一不足。 同時(shí)，應(yīng)用Transwell 培養(yǎng)皿，借助聚碳酸酯膜的作用使細(xì)胞間不發(fā)生接觸，排除了細(xì)胞間的相互干擾。

本研究的結(jié)果可以看出，與普通SCs 相比，激活態(tài)SCs 對(duì)NSCs 的誘導(dǎo)作用存在時(shí)間短、神經(jīng)元分化率高等優(yōu)點(diǎn)。 但是從MTT 染色可以看出，由于各組只應(yīng)用單純DMEM/F12 培養(yǎng)基培養(yǎng)，活細(xì)胞比例隨時(shí)間呈下降趨勢(shì)，說(shuō)明單純?cè)隗w外依靠雪旺細(xì)胞分泌的營(yíng)養(yǎng)因子難以滿足NSCs 的生長(zhǎng)需求，從而解釋了體內(nèi)移植神經(jīng)干細(xì)胞死亡率高的原因[19-20]。 這就需要進(jìn)一步探索能夠保持體內(nèi)高濃度營(yíng)養(yǎng)因子的方法，從而維持NSCs 的體內(nèi)生長(zhǎng)狀態(tài)。

由于條件限制， 本實(shí)驗(yàn)尚存在一些不足之處，對(duì)SCs 分泌的因子只進(jìn)行了較為重要的EGF 和bFGF的檢測(cè)， 如果能檢測(cè)出全部營(yíng)養(yǎng)因子的表達(dá)水平，將有助于進(jìn)一步的詳細(xì)分析。

綜述所述，激活態(tài)雪旺細(xì)胞能夠促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元的分化進(jìn)程，提高神經(jīng)元的分化比例。

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