羅衛(wèi)民 劉越峰 羅湘玉 張 軍▲

1.湖北醫(yī)藥學院附屬十堰市太和醫(yī)院心胸外科，湖北十堰 442000；2.湖北醫(yī)藥學院附屬十堰市人民醫(yī)院眼科，湖北十堰 442000

阿霉素 （Doxorubicin，DOX） 是一種廣泛應用于腫瘤治療的蒽環(huán)類抗生素。盡管其對包括白血病在內的多種惡性腫瘤具有抑制作用，但其蓄積性不可逆性心肌病以及充血性心衰限制了其使用[1]。 DOX 導致的毒性心肌病原因很多， 其中活性氧 （reactive oxygen species，ROS） 介導的心肌細胞凋亡是其重要機制之一[2]。 因此，在DOX 治療的同時預防性使用抗氧化藥物干預，有望降低其副作用[3]。 近年來，某些藥用植物在心血管疾病的預防過程中具有一定的預防作用[4]，金櫻子為薔薇科金櫻子（Rosa Laevigata Michx.，RLM）的果實，研究發(fā)現(xiàn)它具有強大的抗氧化和清除自由基能力[5-6]。本研究旨在觀察RLM 對DOX 誘發(fā)的心臟毒性的保護作用。

1 材料與方法

1.1 主要實驗試劑

DOX 購自意大利Pharmacia 公司（批號：8NB002-A）， 血清天冬氨酸轉氨酶 （aspartate transaminase，AST）檢測試劑盒購自Quimica Clinica Aplicada。 血清總膽固醇（total cholesterol，TC）、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）和肌酸激酶（creatine kinase，CKMB）試劑盒為Stanbio 產品。還原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）及丙二醛（myocardial lipid peroxide，MDA）檢測試劑盒購自南京建成生物技術研究所。心肌腫瘤壞死因子α（tumour necrosis factor-alpha，TNF-α）ELISA 試劑盒和caspase-3 的比色測定試劑盒購自Quantikine。 分析純試劑主要購自Sigma-Aldrich 公司。

金櫻子購于十堰市中草藥材公司，經去籽后用煎藥機進行熬煎。金櫻子的鑒定由湖北醫(yī)藥學院肖勝全教授完成，其提取液濃度為2.0 g/mL。

1.2 實驗分組

成年雄性Wistar 大鼠由湖北醫(yī)藥學院實驗動物部提供，體重（250±5）g，在SPF 環(huán)境下給予標準實驗室的水和食物飼養(yǎng)2 周。 大鼠隨機分成5 組：空白對照組（8 只），大鼠接受等體積的生理鹽水作為陰性對照；DOX 模型組（15 只）， 大鼠連續(xù)兩周每間隔48 h注射DOX（2.5 mg/kg，ip）共6 次，使其累積劑量達15 mg/kg。RLM 高、中、低劑量組（每組各30 只）：在DOX模型組的基礎上，大鼠每日給予RLM（1、2、5 g/kg）灌胃，DOX 停止后，持續(xù)RLM 灌胃4 周。

1.3 血清及心肌組織的獲取

大鼠處理結束后， 獲取血液標本，8000×g 離心10 min 獲取血清用于測定TC、AST、LDH 和CK-MB。隨后解剖大鼠，分離心臟，生理鹽水漂洗2 次。 將心臟組織剪切，制備成20%的勻漿后，二喹啉甲酸法測定其總蛋白濃度及AST、LDH、CK-MB 活性、TC 水平（mg/dL）。

1.4 心肌MDA 測定

心臟勻漿與等體積2.3%的KCl 混合，600×g，4℃離心15 min，獲取上清用于測定MDA。其原理基于脂質過氧化產物與硫代巴比妥酸發(fā)生過氧化反應，生成粉紅色的有色絡合物，從而用分光光度計以四甲氧基丙烷為標準品，532 nm 和520 nm 波長處測量其OD值。 結果用nmol/mg 表示。

1.5 心肌GSH 測定

將等體積的心臟勻漿和預冷7.5%5-磺酸基水楊酸緩沖液以沉淀蛋白。隨后4℃，600×g 離心10 min，獲取上清用于測量還原型GSH。 其原理基于還原型GSH能與5，5-二硫代雙（2-硝基苯甲酸）反應，產物在421 nm波長處能形成最大吸收峰。 含量用mg/g 組織表示。

1.6 TNF-α 和caspase-3 測定

50 mg 心肌組織加入0.8 mL pH 7.4 的裂解緩沖液中制成勻漿，10 000×g，4℃離心15 min。 獲取上清用于TNF-α 和caspase-3 測定。 其中TNF-α 根據試劑盒提供的步驟進行，采用固相夾心ELISA 法，四甲基聯(lián)苯胺（TMB）法顯色并于450 nm 波長處測量其吸光度，用pg/mg 蛋白表示。 采用間接法測定caspase-3活性，基于caspase-3 切除底物分子DEVD-pNA 中的發(fā)光基團pNA，隨后在405 nm 處用測量其吸光度，用OD 值表示，從而間接反應其活性。

1.7 統(tǒng)計學方法

應用SPSS 17.0 軟件進行統(tǒng)計學分析， 計量資料數(shù)據以均數(shù)±標準差（±s）表示，并采用單因素方差分析數(shù)據，行t 檢驗，以P < 0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠血生化指標情況

心臟功能和血脂參數(shù)顯示，DOX 注射后， 血清AST、LDH、CK-MB、TC 水平顯著增高。 而同時給予RLM 干預后，這些參數(shù)隨著RLM 濃度的增高而不斷改善，見表1。

表1 不同濃度金櫻子處理對阿霉素心肌損傷大鼠血生化指標的影響（±s）

表1 不同濃度金櫻子處理對阿霉素心肌損傷大鼠血生化指標的影響（±s）

注：與空白對照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與DOX 模型組比較，#P <0.05；AST：血清天冬氨酸轉氨酶；LDH：乳酸脫氫酶；TC：血清總膽固醇；CK-MB：肌酸激酶；RLM：金櫻子；DOX：阿霉素

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2.2 不同濃度RLM 對心肌DOX 處理后MDA 含量的影響

與空白對照組相比，DOX 處理組能誘導心肌MDA明顯增加（P<0.01），給予不同濃度RLM 處理后，心肌MDA 含量隨之降低，其中DOX+5 g/kg RLM 處理后，MDA 含量降低最多[（0.82±0.14） nmol/mg]。 見圖1。

圖1 RLM 對血清丙二醛含量的影響

2.3 不同濃度RLM 對DOX 心肌毒性大鼠GSH 含量的影響

與空白對照組相比，DOX 組大鼠血清總GSH 含量顯著降低（P < 0.01）。而同時給予不同濃度RLM 處理后，GSH 含量隨之升高。 5 g/kg RLM 處理大鼠后，GSH 含量[（1.06±0.11） pg/g]接近對照組水平（圖2）。

圖2 RLM 對血清還原型谷胱甘肽含量的影響

2.4 RLM 干預對大鼠血清TNF-α 含量的影響

空白對照組大鼠血清中TNF-α 含量較低，DOX處理后TNF-α 顯著增高（P ＜0.01）。 RLM 干預能以劑量依賴性方式降低血清中TNF-α 的含量， 其中DOX+5 g/kg RLM 處 理 后，TNF-α 含 量 降 低 最 多[（3.49±0.05） pg/mg]，見圖3。

圖3 RLM 對血清TNF-α 含量的影響

2.5 RLM 抑制caspase-3 活性

DOX 處理后，caspase-3 活性增加了近50%。 同時經1～5 g/kg RLM 處理后，caspase-3 活性逐漸降至正常水平， 其中DOX+5 g/kg RLM 處理后，caspase-3活性降低最多（0.83±0.02）。 見圖4。

圖4 RLM 對caspase-3 活性的影響

3 討論

DOX 是一種抗腫瘤抗生素，可抑制RNA 和DNA的合成，對RNA 的抑制作用最強，抗瘤譜較廣，對多種腫瘤均有作用，屬周期非特異性藥物，對各種生長周期的腫瘤細胞都有殺滅作用。主要適用于急性白血病， 對急性淋巴細胞白血病及粒細胞白血病均有效，一般作為第二線藥物，即在首選藥物耐藥時可考慮應用此藥。 惡性淋巴瘤， 可作為交替使用的首選藥物。DOX 和其他奎寧蒽環(huán)類藥物一樣， 主要的毒性反應有： 白細胞和血小板減少，60%～80%的患者可發(fā)生；100%的患者有不同程度的毛發(fā)脫落， 停藥后可以恢復生長；心臟毒性，表現(xiàn)為心律失常，ST-T 改變，多出現(xiàn)在停藥后的1～6 個月[7]。本研究通過DOX 建立心肌毒性模型發(fā)現(xiàn)，血清AST、LDH 和CK-MB 顯著增加，這可能是由于DOX 損傷心肌細胞膜后，AST、LDH 和CK-MB 漏出所致。 本研究還發(fā)現(xiàn)，DOX 還可以導致TC 含量增高，這可能是由于DOX 導致腎病綜合征所致[8]。 RLM 屬薔薇科薔薇屬常綠蔓性灌木野生果樹，其果實中總糖含量達24%，其中多糖含量約為金櫻子果實的8.73%。 研究顯示，RLM 的抗氧化能力與丁基羥基甲苯相當， 并能顯著清除超氧陰離子自由基、抑制羥自由基對細胞膜的破壞而引起的溶血和脂質過氧化產物的形成，從而具有顯著的抗氧化作用[9]。 此外，RLM 金櫻子能減輕糖尿病腎病大鼠的氧化損傷，減少過氧化質，升高抗氧化酶活性，機制可能與干預氧化應激、抑制核因子-κB、TNF-α 表達有關。 本研究顯示通過RLM 灌胃后， 大鼠的血清指標得到了顯著的改善[10-13]。 同時，本研究還觀察了RLM 對氧化應激的影響。 結果發(fā)現(xiàn)，DOX 能顯著增加心肌中MDA 含量，同時顯著降低GSH 水平。 這可能是DOX 導致氧化應激，大量氧自由基的產生導致GSH 減少。 脂質過氧化導致心肌細胞損傷后引起AST、LDH 和CK-MB漏出至循環(huán)系統(tǒng)是由于心臟損傷[14]。 口服RLM 能明顯降低脂蛋白過氧化物酶而提高GSH，這表明這些藥物能清除自由基和減少細胞損傷。 另一方面，氧化應激可激活p38 絲裂原激活的蛋白激酶和核因子-κB，從導致TNF-α 大量合成， 反過來加重氧化應激狀態(tài)而使線粒體膜通透性發(fā)生改變，隨后導致自由基和細胞色素C 從線粒體中釋放到細胞質， 激活caspase-3而引起凋亡發(fā)生[15-17]。 RLM 可能通過抑制組織中的應激反應而降低心肌中TNF-α 和caspase-3 含量。

總之，本研究證實RLM 對DOX 導致的心肌損傷有保護作用，其機制可能與抗氧化、抗炎和抗凋亡有關。 在下一步研究中，筆者將對其分子機制進行進一步探討。

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