潘龍，李廣興*，聶思靜，蔡皓璠，李蘭蘭

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030；2.黑龍江職業(yè)學(xué)院農(nóng)牧工程系，哈爾濱 150080）

三種IBV檢測方法比較研究

潘龍1，李廣興1*，聶思靜1，蔡皓璠2，李蘭蘭1

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030；2.黑龍江職業(yè)學(xué)院農(nóng)牧工程系，哈爾濱 150080）

IBV屬于冠狀病毒γ群，可引起雞呼吸道疾病，對IBV診斷方法研究廣泛，建立多種方法，而噬菌體展示技術(shù)廣泛用于蛋白質(zhì)研究中。使用分子生物學(xué)技術(shù)和噬菌體展示技術(shù)篩選到能與IBV S1蛋白特異性結(jié)合噬菌體建立三種IBV檢測方法，Real-Time PCR、RT-PCR和噬菌體ELISA。結(jié)果表明，三種方法都可有效檢測出傳染性支氣管炎病毒（IBV），證明三種方法可靠性，對這三種方法的靈敏性進行比較，敏感性上實時Real-Time PCR法最敏感，依次為RT-PCR和噬菌體ELISA技術(shù)，檢測極限分別為7.64×101、7.64×103、1.21×105copies·μL-1，證明篩選的IBV S1蛋白特異性親和噬菌體可用于IBV病毒診斷，具有較高特異性和敏感性，為IBV診斷提供新方法。Real-Time PCR、RT-PCR和噬菌體ELISA三種方法各具特點，可滿足不同檢測需要。

IBV；Real-time PCR；RT-PCR；噬菌體ELISA

雞傳染性支氣管炎（Infectious bronchitis，IB）是由傳染性支氣管炎病毒（Infectious bronchitis vi?rus，IBV）引起雞急性、高度接觸傳染性、病毒性呼吸道疾病。IBV損害腎臟和生殖系統(tǒng)，引起雛雞死亡、蛋雞產(chǎn)蛋量和蛋品質(zhì)下降[1]，由于IBV經(jīng)常和其他病毒和細菌同時發(fā)生，常引起混合感染和繼發(fā)感染。

IBV屬于冠狀病毒科（Coronaviridae），冠狀病毒屬（Coronavirus），γ冠狀病毒群，為外被囊膜單股正鏈RNA病毒。病毒基因組由單股不分節(jié)段的正鏈RNA組成，長約27.6 kb。含四種結(jié)構(gòu)蛋白，即纖突（Spike，S）糖蛋白、核（Nucleocapsid，N）蛋白、膜（Membrane，M）糖蛋白和小膜（Small envelope，E）糖蛋白。

雞傳染性支氣管炎病毒血清型復(fù)雜[2]，不同血清型間抗原性差異較大，存在特殊遺傳變異方式，因此不易診斷[3]?？焖贉蚀_檢測IBV對其進行診斷，成為預(yù)防和控制傳染性支氣管炎關(guān)鍵。目前常規(guī)檢測IBV技術(shù)主要有病毒分離、血清學(xué)試驗和分子生物學(xué)試驗等方法[4]。本試驗建立熒光定量PCR（Real time PCR），RT-PCR（Reverse transcrip?tion PCR）和噬菌體ELISA三種IBV檢測方法，并進行比較研究，評價三種方法優(yōu)缺點，為IBV臨床診斷提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 熒光定量PCR引物設(shè)計、合成

根據(jù)傳染性支氣管炎病毒Beaudett株（GenBank中登錄號為AJ311317）的N基因序列，利用Oli?go6.0軟件設(shè)計一對引物。上游引物p1（5'GAA?CAGGACCAGCCGCTAA 3'），下游引物p2（5'GAG?GAATGAAATCCCAACG 3'），擴增片段189 bp，由哈爾濱博仕生物技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.2 病毒和噬菌體

傳染性支氣管炎病毒Beaudett株由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院病理解剖教研室保存，新城疫病毒（NDV）、傳染性喉氣管炎病毒（ILTV）、傳染性法氏囊病毒（IBDV），禽流感病毒抗原（AIV）均為疫苗株，IBV S1蛋白結(jié)合噬菌體由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院病理解剖教研室淘選保存，測定的氨基酸序列為HWDPFSLSAYFP。

1.3 病毒RNA提取和cDNA合成

參照TRIzol試劑（Invitrogen公司）使用說明書提取病毒總RNA，提取的總RNA溶于10 μL無RNA酶的dH2O中，反轉(zhuǎn)錄參照TAKARA公司M-MLV反轉(zhuǎn)錄說明書進行，得到cDNA-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4 陽性標準品制備

將病毒培養(yǎng)物反復(fù)凍融3次，離心取上清，按上述方法提取總RNA，按以上條件反轉(zhuǎn)錄，PCR反應(yīng)體系25 μL：上下游引物1 μL，dNTPs 2 μL，10×Buffer 2.5 μL，cDNA 2 μL，ExTaqTM DNA聚合酶0.25 μL，ddH2O 16.5 μL；反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min；變性：94℃30 s；退火：55℃30 s；延伸：72℃30 s，30個循環(huán)，最后再72℃延伸10 min。RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定，回收目的DNA片段，將目的片段與pMD18-T載體16℃連接過夜，轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細胞，經(jīng)質(zhì)粒PCR鑒定陽性命名為pMD-N1，nano2000紫外分光光度計測定濃度，根據(jù)公式：（6.02×1023copies·mol-1）×（濃度g·μL-1）/（MW g·mol-1）=copies·μL-1計算其拷貝數(shù)，置-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.5 熒光定量PCR方法建立

1.5.1 熒光定量PCR反應(yīng)條件建立

開始10倍梯度稀釋質(zhì)粒pMD-N1標準品進行Real-time PCR擴增，反應(yīng)體系為20 μL：5×Gold?en HS SYBR Green qPCR Mix 4 μL，50×ROX Refer?ence Dye 0.4 μL，上下游引物（10 μmol·L-1）各0.5 μL，DNA模板1 μL，ddH2O Up to 20 μL。反應(yīng)條件使用兩部法：Stage 1：95℃15 min；Stage 2：95℃10 s，60℃30 s；每個循環(huán)退火延伸結(jié)束時檢測熒光信號，共40個循環(huán)，繪制標準曲線。

1.5.2 敏感性試驗

將質(zhì)粒標準品經(jīng)10倍梯度稀釋濃度從108到1 copies·μL-1，按上述體系進行Real-time PCR反應(yīng)，確定檢測病毒最小拷貝數(shù)，同時用常規(guī)RTPCR進行擴增，擴增產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.5.3 特異性試驗

對傳染性支氣管炎病毒（IBV）、新城疫病毒（NDV）、傳染性法氏囊病毒（IBDV）、禽流感病毒（AIV）、傳染性喉氣管炎病毒（ILTV），分別取等量樣品提取病毒RNA（或DNA），后用隨機引物反轉(zhuǎn)錄，采用所建立的IBV Real-time PCR方法進行檢測。

1.5.4 重復(fù)性試驗

為評估Real-time PCR檢測方法組內(nèi)和組間試驗的重復(fù)性、穩(wěn)定性，應(yīng)用10倍梯度稀釋標準品進行Real-time PCR檢測，各取5個濃度重復(fù)3次，依據(jù)檢測結(jié)果計算Ct平均值和變異系數(shù)（CV），通過CV評價試驗穩(wěn)定性。

1.6 噬菌體ELISA診斷方法建立

1.6.1 抗原的最佳工作量

用碳酸鹽緩沖液稀釋IBV病毒Beaudette株，1∶10～640倍稀釋，包被反應(yīng)板，每孔100 μL。按常規(guī)程序測定陰、陽性噬菌體濃度，試驗用噬菌體投入1∶10倍稀釋，M13多抗1∶1 000，酶標抗體1∶5 000倍稀釋，其他按常規(guī)步驟進行測定。

1.6.2 封閉液濃度

使用1%、3%、5%BSA封閉液，封閉1 h，選擇P/N值最高，且P值接近1的濃度為最佳封閉濃度。

1.6.3 最佳M13抗體稀釋度及工作時間確定

將M13噬菌體多抗1∶500、1∶1 000、1∶2 000倍稀釋，作用時間分別為1 h，其他按常規(guī)步驟進行測定。

1.6.4 酶標二抗的最佳稀釋度、作用時間及顯色時間確定

酶標二抗1∶3 000、1∶4 000、1∶5 000、1∶6 000倍稀釋，采用不同作用時間，其他按常規(guī)步驟進行。

1.6.5 特異性試驗

將傳染性法氏囊病毒、新城疫、禽流感、傳染性支氣管炎、傳染性喉氣管炎等禽病病原，病毒滴度均＞105EID50，做10-1～10-8倍稀釋，用建立的噬菌體ELISA方法確定診斷方法特異性。

2 結(jié)果與分析

2.1 標準品制備

通過RT-PCR擴增除IBV Beaudett株N基因目的片段，長度為189 bp，連接pMD18-T載體后進行鑒定，證明所克隆的基因為IBV Beaudett株N基因。提取pMD18-N質(zhì)粒經(jīng)DNA經(jīng)紫外分光光度計測定結(jié)果為：質(zhì)粒濃度為235 ng·μL-1，根據(jù)公式換算成拷貝數(shù)為7.64×1010copies·μL-1。

2.2 熒光定量PCR方法建立

2.2.1 熒光定量PCR標準曲線建立

IBV S1基因擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳鑒定，大小為189 bp（見圖1）。通過Real-time PCR，得到檢測IBV擴增曲線（見圖2）和標準曲線（見圖3）。IBV Real-time PCR標準品具有良好的線性關(guān)系（相關(guān)系數(shù)R2=0.9995；擴增效率E=101.99）熔解曲線為單一峰值。

圖1 IBV-N基因RT-PCR產(chǎn)物電泳圖譜Fig.1 Electropherogram of IBV-N

圖2 Real-time PCR擴增曲線Fig.2 Dynamic curve of Real-time PCR

圖3 Real-time PCR標準曲線Fig.3 Standard curve of Real-time PCR

2.2.2 熒光定量PCR的敏感性

經(jīng)過檢測，確定Real-time PCR檢出的最低限為7.64×101copies·μL-1，常規(guī)RT-PCR檢測極限為7.64×103copies·μL-1（見圖4）。

圖4 常規(guī)PCR靈敏度檢測Fig.4 Sensitivity of PCR detection

2.2.3 熒光定量PCR的特異性

根據(jù)熔解曲線的結(jié)果表明，只有IBV才能擴增出特異性峰值，而對其他禽源病毒（NDV、ILTV、IBDV、AIV）檢測結(jié)果未擴增出特異性峰值，均為陰性（見圖5）。

圖5 Real-time PCR的特異性結(jié)果Fig.5 Specificity of Real-time PCR

2.2.4 熒光定量PCR的重復(fù)性

熒光定量PCR的重復(fù)性見表1。

取5個10倍梯度稀釋的標準品分別做3個批內(nèi)重復(fù)和批間重復(fù)試驗，將試驗結(jié)果進行統(tǒng)計分析，批內(nèi)變異系數(shù)（CV0）0.1%～0.8%，批間變異系數(shù)（CV）0.7%～1.6%。

表1 熒光定量PCR的重復(fù)性Table 1 Reproducible of Real-time PCR

2.3 噬菌體ELISA檢測方法的建立

2.3.1 噬菌體最佳工作量的確定

將IBV抗原以1∶10倍稀釋包被ELISA板，噬菌體1∶20、1∶40、1∶80、1∶160倍稀釋時，P/N分別為1.79、2.12、1.83、1.38，確定P/N最大，且P值接近1的為最佳稀釋濃度，同時將1∶40倍的噬菌體進行滴度測定，確定最佳的噬菌體投入量為4×1011個·孔-1。

2.3.2 最適封閉液及封閉時間的確定

使用含1%、3%、5%BSA PBST封閉后的P/N值分別為3.17、3.56、3.30，確定最適封閉液為含3%BSA的PBST。

2.3.3 最佳M13抗體稀釋度及工作時間的確定

M13噬菌體多抗最佳稀釋度P/N分別為3.13、3.71、3.65，最佳作用時間P/N分別為2.98、3.73、 3.70，確定最佳M13抗體稀釋度為1∶1 000，作用時間為1 h。

2.3.4 酶標二抗稀釋度及工作時間的確定

酶標二抗稀釋度的P/N值分別為3.59、3.79、3.42、3.39，作用30、60、90 min，測得P/N值分別為2.56、3.81、3.49。依據(jù)以上結(jié)果，選擇1∶4 000作為二抗最佳稀釋度；1 h作為最佳作用時間。

2.3.5 交叉試驗

應(yīng)用建立起的噬菌體ELISA診斷方法，對雞傳染性法氏囊病毒、新城疫、禽流感、雞傳染性支氣管炎、雞傳染性喉氣管炎等病毒進行檢測，10-4倍稀釋時P/N仍然＞2，證明該診斷方法與上述病毒交叉反應(yīng)弱，特異性比較強，用Real-time PCR測定原始病毒液中IBV病毒的拷貝數(shù)，計算10-4倍稀釋時的拷貝數(shù)為1.21×105copies·μL-1（見圖6）。

圖6 噬菌體ELISA檢測方法的敏感性試驗Fig.6 Phage ELISA of the sensitivity of the detection method

3 討論與結(jié)論

Real-time PCR技術(shù)具有自動化程度高，反應(yīng)快速、重復(fù)性好、靈敏度高、特異性強、結(jié)果清晰等特點，可精確到幾個拷貝數(shù)，廣泛應(yīng)用于各種傳染病診斷和療效評價，腫瘤標志物及瘤基因檢測實現(xiàn)腫瘤病診斷、遺傳基因檢測實現(xiàn)遺傳病診斷[5]。應(yīng)用于動物疾病檢測禽流感、新城疫、口蹄疫、豬瘟、沙門菌、大腸埃希菌等診斷，在食品安全領(lǐng)域廣泛，也是相關(guān)分子生物學(xué)研究中進行定量研究重要方法，隨著生物芯片技術(shù)和熒光探針定量技術(shù)結(jié)合，Real-time PCR在醫(yī)學(xué)檢測及其他各個領(lǐng)域中應(yīng)用前景更加廣闊。

相對于Real-time PCR技術(shù)，RT-PCR技術(shù)歷史更長，其檢測靈敏程度無Real-time PCR高，但其在設(shè)備投入和成本方面具有優(yōu)勢，可進行大量樣本檢測，受樣本保存時間影響小[6]，而ELISA技術(shù)由于其對設(shè)備要求低，易于操作，不需要昂貴的實驗設(shè)備可以廣泛應(yīng)用于基層現(xiàn)場的病原檢測，特別是對新鮮病原材料檢出率高[7]。

噬菌體展示技術(shù)作為新興研究方法和工具，在研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)上已被廣泛應(yīng)用，已開發(fā)出單鏈絲狀噬菌體展示系統(tǒng)、λ噬菌體展示系統(tǒng)、T4噬菌體展示系統(tǒng)等數(shù)種噬菌體展示系統(tǒng)。噬菌體展示技術(shù)具有高通量淘選、模擬表位篩選、易于純化等顯著優(yōu)點[8]。

本試驗在建立Real-time PCR法時構(gòu)建重組質(zhì)粒作為標準品直接將待檢目的片斷克隆到T載體中，最大限度保證標準品與檢測樣品間擴增效率一致性。建立擴增曲線和標準曲線具有良好線性

關(guān)系（相關(guān)系數(shù)R2=0.9995；擴增效率E=101.99）。特異性試驗結(jié)果由熔解曲線分析顯示與其他禽源病毒不發(fā)生交叉反應(yīng)，在40個循環(huán)內(nèi)無引物二聚體等非特異擴增，表明該方法具有高度穩(wěn)定性。重復(fù)性試驗結(jié)果變異系數(shù)批內(nèi)為0.1%～0.8%，批間為0.7%～1.6%，表明該方法具有良好重復(fù)性。該方法可檢測到初始模板中7.64×101copies·μL-1病毒核酸，而常規(guī)RT-PCR檢測極限為7.64×103copies·μL-1，敏感性高于常規(guī)RT-PCR 100倍，與其他研究結(jié)果相同[9]。噬菌體展示技術(shù)在病毒學(xué)研究中發(fā)揮重要作用[10]，可用于病毒受體研究[11-12]，篩選的特異性噬菌體也可用于病原診斷[13]，本試驗所建立的噬菌體ELISA法在10-4稀釋時能特異性檢測到IBV病毒，具有較高特異性，證明所篩選具有特異性結(jié)合能力噬菌體在病原診斷領(lǐng)域應(yīng)用前景良好，所建立三種方法可靠性穩(wěn)定，檢測敏感性順序為Re?al-time PCR、RT-PCR和噬菌體ELISA，可根據(jù)需要選擇不同的檢測方法，當檢測樣品數(shù)量很大時可優(yōu)先選擇RT-PCR法，而在檢測新鮮病料時，可選用噬菌體ELISA法，該法操作更簡便，特別適合在試驗條件較差基層初步篩使用。

[1]Lim T H,Lee H J,Lee D H,et al.An emerging recombinant clus?ter of nephropathogenic strains of avian infectious bronchitis virus in Korea[J].Infect Genet Evol,2011,11(3):678-685.

[2]Worthington K J,Currie R J,Jones R C.A reverse transcrip?tase-polymerase chain reaction survey of infectious bronchitis vi?rus genotypes in Western Europe from 2002 to 2006[J].Avian Pathol.2008,37(3):247-257.

[3]Ji J,Xie J,Chen F,et al.Phylogenetic distribution and predomi? nant genotype of the avian infectious bronchitis virus in China during 2008-2009[J].Virol J,2011(8):184.

[4]李中華,史惠,周毅,等.雞傳染性支氣管炎實驗室診斷方法研究進展[J].動物醫(yī)學(xué)進展,2008(1):95-99.

[5]朱捷,楊成君,王軍.熒光定量PCR技術(shù)及其在科研中的應(yīng)用[J].生物技術(shù)通報,2009(2):73-76.

[6]劉思國,江國托,康麗娟,等.PCR方法快速檢測雞傳染性支氣管炎病毒[J].動物醫(yī)學(xué)進展,1999(3):30-33.

[7]黃溢泓,韋正吉,李志源,等.五種禽呼吸道病病原多重PCR檢測方法的建立和應(yīng)用[J].中國獸醫(yī)科學(xué),2010(2):164-168.

[8]Smith G P.Filamentous fusion phage:Novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface[J].Science, 1985,228(5):1315-1317.

[9]劉喬然,劉勝旺.雞傳染性支氣管炎病毒Real-time PCR方法的建立及其對感染雞體內(nèi)病毒的檢測[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報. 2008(8):637-641.

[10]Sun E C,Zhao J,Yang T,et al.Identification of a conserved JEV serocomplex B-cell epitope by screening a phage-display peptide library with a mAb generated against West Nile virus capsid pro?tein.[J].Virol J,2011(8):100.

[11]Moreland N J,Susanto P,Lim E,et al.Phage display approaches for the isolation of monoclonal antibodies against dengue virus en?velope domainⅢfrom human and mouse derived libraries[J].Int J Mol Sci,2012,13(3):2618-2635.

[12]Xue M,Shi X,Zhang J,et al.Identification of a conserved B-cell epitope on reticuloendotheliosis virus envelope protein by screen?ing a phage-displayed random peptide library[J].PLoS One, 2012,7(11):49842.

[13]Wu D,Li G,Qin C,et al.Phage displayed peptides to avian H5N1 virus distinguished the virus from other viruses[J].PLoS One, 2011,6(8):23058.

Comparative study on three kinds of detection methods of avian infec?tious bronchitis virus/

PAN Long1,LI Guangxing1,NIE Sijing1,CAI Haofan2,LI Lanlan1(1. School of Veterinary Medicine,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China;2.Department ofAnimal Husbandry andAgriculture,Heilongjiang Polytechnic,Harbin 150080,China)

Avian infectious bronchitis virus(IBV),which belongs to group γ coronavirus,leads to chicken respiratory disease—infectious bronchitis(IB)and causes enormous economic loss.Latest researches on IBV diagnostic methods are undertaken very extensively,and rapid and specific diagnostic methods have obvious significance on the comprehensive prevention of IB.In this paper,molecular biology and phage display technique were used to establish three kinds of IBV diagnostic methods,i.e.,real time quantitativepolymerasechainreaction(qRT-PCR),reversetranscriptionPCR(RT-PCR),and phage-mediated enzyme-linked immunosorbent assay(phage-mediated ELISA),and their characteristics were comparatively studied.The results showed that these three methods had the reliability to assay IBV specifically,and they could detect IBV at least 7.64×101,7.64×103,1.21×105copies·μL-1,respectively,in which qRT-PCR had the highest sensitivity.Furthermore,the high affinity phages to IBV S1 protein were employed with phage display technique to develop phage-mediated ELISA,and it had very good specificity and sensitivity for IBV diagnosis,and it is suitable to utilized veterinary clinic application.

infectious bronchitis virus;Real-time PCR;RT-PCR;phage-mediated ELISA

S852.31

A

1005-9369（2014）09-0100-06

2014-07-19

黑龍江省自然科學(xué)基金項目（ZJN0702-01）；國家自然科學(xué)基金項目（31172295，31272569）

潘龍（1979-），男，博士研究生，研究方向為動物病理學(xué)。E-mail:panlong79@126.com

*通訊作者：李廣興，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向為動物病理學(xué)。E-mail:ligx@neau.edu.cn。

時間2014-9-18 10:48:03[URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20140918.1048.012.html

潘龍,李廣興,聶思靜,等.三種IBV檢測方法比較研究[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2014,45(9):100-105.

Pan Long,Li Guangxing,Nie Sijing,et al.Comparative study on 3 kinds of detection methods of avian infectious bronchitis virus[J].Journal of Northeast Agricultural University,2014,45(9):100-105.(in Chinese with English abstract)