于娜，楊澤宇,2，林旭，李玉龍，趙洵武，張貴學(xué)*

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，哈爾濱 150030；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)成棟學(xué)院，哈爾濱 150500）

牛支持細(xì)胞和成纖維細(xì)胞體外培養(yǎng)及pEGFP-N3轉(zhuǎn)染

于娜1，楊澤宇1,2，林旭1，李玉龍1，趙洵武1，張貴學(xué)1*

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，哈爾濱 150030；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)成棟學(xué)院，哈爾濱 150500）

試驗(yàn)以新生牛睪丸組織、牛胎兒皮膚組織為材料，進(jìn)行支持細(xì)胞、成纖維細(xì)胞的分離、純化、鑒定及pEGFP-N3載體轉(zhuǎn)染。結(jié)果表明，完善犢牛支持細(xì)胞、胎牛皮膚成纖維細(xì)胞體外培養(yǎng)體系，細(xì)胞純度可達(dá)95%。支持細(xì)胞在相同密度下較成纖維細(xì)胞能更快完成細(xì)胞生長指數(shù)期，生長迅速。轉(zhuǎn)染pEGFP-N3載體后，初期EGFP均勻充滿胞漿，后期EGFP向細(xì)胞核聚集，熒光強(qiáng)度明顯高于細(xì)胞質(zhì)中。轉(zhuǎn)染后24、48、72 h，成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率高于支持細(xì)胞，轉(zhuǎn)染pEGFP-N3的成纖維細(xì)胞和支持細(xì)胞在轉(zhuǎn)染48 h后達(dá)到最大轉(zhuǎn)染效率。轉(zhuǎn)染后成纖維細(xì)胞的存活時間明顯高于支持細(xì)胞，這與支持細(xì)胞生物學(xué)性質(zhì)有關(guān)。

支持細(xì)胞；成纖維細(xì)胞；體外培養(yǎng)；pEGFP-N3載體

成纖維細(xì)胞以其生長快、體外培養(yǎng)性質(zhì)穩(wěn)定，成為轉(zhuǎn)基因克隆動物的首選核供體[1]。睪丸支持細(xì)胞是構(gòu)成血睪屏障主要成員，不僅能分泌多種生長因子、營養(yǎng)因子和免疫保護(hù)因子，還能發(fā)揮其免疫豁免功能，提高移植成活率[2]。因此，睪丸支持細(xì)胞在干細(xì)胞研究、細(xì)胞移植及核移植領(lǐng)域具有較大潛力。本試驗(yàn)對新生牛睪丸支持細(xì)胞和胎牛成纖維細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)并分析，利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-N3導(dǎo)入體外培養(yǎng)的支持細(xì)胞和成纖維細(xì)胞，對EGFP蛋白在細(xì)胞中表達(dá)作比較，探討支持細(xì)胞、成纖維細(xì)胞生物學(xué)特性，為篩選轉(zhuǎn)基因牛供體細(xì)胞提供理論和技術(shù)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

真核表達(dá)載體pEGFP-N3（由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物遺傳育種與繁殖實(shí)驗(yàn)室保存）。DMEM、胎牛血清（Gibco）；胰蛋白酶（1∶250）、乙二胺四乙酸二鈉（Amresco）；PBS（無Ca2+，Mg2+PBS，Hyclone）；L-谷氨酰胺、DMSO（Sigma）；100×雙抗、西班牙瓊脂糖、胰蛋白酶、胰蛋白胨、酵母提取物、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、DNA Marker、凝膠回收純化試劑盒、質(zhì)粒小量制備純化試劑盒（索萊寶生物公司）；dNTP、rTaq酶、感受態(tài)Top10（TaKaRa）；Li?pofectamine?2000轉(zhuǎn)染試劑（Invitrogen）；蘇木紫、伊紅、油紅O（武漢博士德公司）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（ABI）；無內(nèi)毒素質(zhì)粒小提試劑盒（Endo-free Plas?mid Mini KitⅡ，OMEGA）。

1.2 方法

1.2.1 支持細(xì)胞、成纖維細(xì)胞培養(yǎng)與純化

新生牛放血致死后，用碘酒消毒下腹部，無菌取出雙側(cè)睪丸，剪去脂肪墊，用37℃生理鹽水沖洗睪丸，然后置于4℃生理鹽水中，2 h內(nèi)送回實(shí)驗(yàn)室。胎牛取出后，碘酒消毒皮膚，無菌剪下背部皮膚，37℃生理鹽水沖洗，然后置于4℃生理鹽水中，2 h內(nèi)送回實(shí)驗(yàn)室。

將新生牛睪丸用生理鹽水洗凈，剖去結(jié)締組織膜，剪去睪丸白膜，加入少量PBS將組織剪成大小一致的小塊，移入盛有PBS的新玻璃皿中撥散，去除血細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞，將曲細(xì)精管移入離心管中，加入10倍體積膠原酶Ⅳ，室溫消化15 min，至曲細(xì)精管彼此分散開；加入5～10 mL PBS，1 000 r·min-1離心5 min，棄上清，重復(fù)消化步驟，離心后加入10倍體積0.25%胰酶消化液，室溫消化10～15 min；加入等量基礎(chǔ)培養(yǎng)液終止消化，1 000 r·min-1離心5 min，棄上清，用PBS重懸細(xì)胞，100 μm篩網(wǎng)過濾，離心后棄上清，將細(xì)胞沉淀用全培養(yǎng)液懸起，按一定接種密度分裝培養(yǎng)瓶中，CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。參考李冬旭等[3]、于磊等[4]、鄭鵬等[5-6]方法，采用差速貼壁分選支持細(xì)胞。

將胎牛皮膚用生理鹽水沖洗干凈，用手術(shù)刀刮去皮膚表面胎毛，加入少量PBS，剪碎組織，用PBS沖洗2～3次，將組織塊轉(zhuǎn)入離心管中，消化方法同上，采用不同胰酶消化時間分選成纖維細(xì)胞。

1.2.2 繪制細(xì)胞生長曲線

將細(xì)胞按照1～5×105個·孔-1，接種到24孔板上，以1、2、3、4、5、6和7 d為時間點(diǎn)，在每天同一時間消化3個孔細(xì)胞，臺盼蘭染色，細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)細(xì)胞總數(shù)、活細(xì)胞數(shù)、死細(xì)胞數(shù)、細(xì)胞活率。每3 d換1次全培養(yǎng)液，以時間為橫坐標(biāo)，以細(xì)胞數(shù)、細(xì)胞活率為縱坐標(biāo)，繪制細(xì)胞生長曲線。

1.2.3 細(xì)胞染色體制備、鑒定和核型分析

取處于對數(shù)生長期的支持細(xì)胞和成纖維細(xì)胞，加入含0.2 μg·mL-1秋水仙素的DMEM/F-12細(xì)胞培養(yǎng)基，孵育4 h后，消化、離心、收集細(xì)胞。加入0.075 mol·L-1KCl低滲溶液室溫處理30 min。Cannoy固定液固定（甲醇∶冰醋酸=3∶1），此固定液現(xiàn)用現(xiàn)配，預(yù)固定3 min后，重復(fù)固定2～3次，每次固定20 min。然后滴片、染色、顯微鏡下觀察照相并進(jìn)行核型分析。對支持細(xì)胞和成纖維細(xì)胞進(jìn)行HE染色，油紅O染色鑒定。

HE染色：細(xì)胞棄掉培養(yǎng)基后，利用PBS清洗3次；4%多聚甲醛固定15 min后再用PBS清洗3次；滴加蘇木素溶液覆蓋標(biāo)本，染色12 min；自來水洗滌3次；95%酒精30 s；滴加伊紅溶液覆蓋標(biāo)本，染色2 min；自來水洗滌3次；觀察，照相。

油紅O染色：棄掉培養(yǎng)基，PBS清洗3次；10%甲醛固定液，固定30 min；PBS清洗3次；蒸餾水清洗3次；烘箱干燥2 min；0.5%油紅工作液，染色40 min；PBS清洗3次；觀察，照相。

1.2.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率、存活時間測定

采用陽離子脂質(zhì)體介導(dǎo)方法，用除去內(nèi)毒素的質(zhì)粒pEGFP-N3轉(zhuǎn)染牛胎兒成纖維細(xì)胞和新生牛睪丸支持細(xì)胞，以未轉(zhuǎn)染的奶牛胎兒成纖維細(xì)胞和睪丸支持細(xì)胞作為陰性對照。轉(zhuǎn)染試驗(yàn)在6孔板中進(jìn)行，質(zhì)粒樣品轉(zhuǎn)染重復(fù)6次。轉(zhuǎn)染24、48、72 h后使用熒光顯微鏡觀察EGFP表達(dá)情況，同時隨機(jī)挑取20個視野（×400），分別計(jì)數(shù)細(xì)胞總數(shù)和轉(zhuǎn)染陽性細(xì)胞數(shù)，以檢測轉(zhuǎn)染效率。加入適當(dāng)濃度的G418進(jìn)行篩選，觀察細(xì)胞存活時間。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用Excel 2003和CoStat軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，顯著水平為P＜0.05，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 支持細(xì)胞、成纖維細(xì)胞體外培養(yǎng)特性

睪丸支持細(xì)胞折光性強(qiáng)，細(xì)胞胞體伸展，其四周多有突起，形態(tài)不規(guī)則，此后胞質(zhì)逐漸增大，折光性減弱，2～3 d鋪滿培養(yǎng)皿底壁。支持細(xì)胞傳代后生長較快，約2 d即可增殖一代（見圖1A）。胎牛皮膚成纖維細(xì)胞在1～24 h內(nèi)逐漸貼壁，形狀由圓形變成長梭形或多角形，胞質(zhì)弱嗜堿性，胞核較大呈橢圓形，染色質(zhì)疏松著色淺，核仁明顯。為典型的成纖維細(xì)胞形態(tài)，大量細(xì)胞聚集時，呈現(xiàn)細(xì)線型和旋渦型生長，2～4 d可長滿整瓶（見圖1B）。

圖1 細(xì)胞體外培養(yǎng)(×100)Fig.1 Cells culture in vitro(×100)

2.2 細(xì)胞生長曲線

支持細(xì)胞的總細(xì)胞數(shù)、活細(xì)胞數(shù)、死細(xì)胞數(shù)見圖2A，細(xì)胞活率生長曲線見圖2C。第1天細(xì)胞生長處于潛伏期，總細(xì)胞數(shù)、活細(xì)胞數(shù)、死細(xì)胞數(shù)處于最低水平；2～3 d細(xì)胞生長處于指數(shù)增長期，細(xì)胞快速增殖，第3天細(xì)胞活率、活細(xì)胞數(shù)達(dá)到最大，從第4天起，細(xì)胞活率下降，死細(xì)胞數(shù)快速增加。

胎牛皮膚成纖維細(xì)胞的總細(xì)胞數(shù)、活細(xì)胞數(shù)、死細(xì)胞數(shù)見圖2B，細(xì)胞活率生長曲線見圖2C。第1天細(xì)胞生長處于潛伏期，總細(xì)胞數(shù)、活細(xì)胞數(shù)、死細(xì)胞數(shù)處于最低水平；2～5 d細(xì)胞生長處于指數(shù)增長期，細(xì)胞快速增殖，第4天細(xì)胞活率達(dá)到最大，第5天細(xì)胞總數(shù)和活細(xì)胞總數(shù)達(dá)到最大，死細(xì)胞數(shù)在第7天增大到最大。

支持細(xì)胞和成纖維細(xì)胞在體外培養(yǎng)時，都存在短暫的潛伏期，進(jìn)入對數(shù)生長期，之后進(jìn)入平臺期，生長曲線類似S型，符合體外培養(yǎng)細(xì)胞正常生長增殖規(guī)律。支持細(xì)胞在相同密度下較成纖維細(xì)胞能更快的進(jìn)入細(xì)胞生長指數(shù)期，生長迅速。

圖2 細(xì)胞生長曲線Fig.2 Cells growth line

2.3 染色體核型分析

對支持細(xì)胞和成纖維細(xì)胞染色體核型進(jìn)行檢測，結(jié)果表明體外培養(yǎng)的睪丸支持細(xì)胞和成纖維細(xì)胞均含有正常的二倍體核型，共計(jì)60條染色體（見圖3）。

圖3 細(xì)胞染色體核型分析(×1000）Fig.3 Karyotype analysis(×1000）

2.4 細(xì)胞鑒定

HE染色結(jié)果表明，成纖維細(xì)胞呈長梭形，胞質(zhì)染色較淡，而細(xì)胞核染色較深，呈圓形或橢圓形位于細(xì)胞質(zhì)中央或偏位（見圖4A）。支持細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，胞質(zhì)完全鋪開，染色較淡，而細(xì)胞核染色較深，呈圓形或橢圓形位于細(xì)胞質(zhì)中央或偏位，核仁明顯（見圖4B）。油紅O染色表明，油紅O染色可見成纖維細(xì)胞不能被染色（見圖4C），支持細(xì)胞核周圍分布的許多圓形或卵圓形的脂質(zhì)小滴呈紅褐色，而細(xì)胞其他部分不著色（見圖4D）。

2.5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染形態(tài)學(xué)觀察及轉(zhuǎn)染后EGFP表達(dá)效率

熒光顯微鏡下觀察真核表達(dá)載體pEGFP-N3轉(zhuǎn)染胎牛成纖維細(xì)胞和新生牛睪丸支持細(xì)胞，轉(zhuǎn)染細(xì)胞均有熒光表達(dá)（見圖5）。

圖4 細(xì)胞鑒定(×200）Fig.4 Identification of cells(×200）

圖5 不同時間轉(zhuǎn)染效率的熒光觀察Fig.5 Observation of the cells transfection effciency

pEGFP-N3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染犢牛睪丸支持細(xì)胞和胎牛成纖維細(xì)胞后初期EGFP大多均勻地充滿胞漿（見圖6-1），個別細(xì)胞EGFP充滿整個細(xì)胞（見圖6-2），后期隨著細(xì)胞分裂生長，EGFP向細(xì)胞核聚集（見圖6-3），在細(xì)胞核中出現(xiàn)的比例越來越大且熒光強(qiáng)度明顯高于細(xì)胞質(zhì)中（見圖6-4）。

圖7表明，轉(zhuǎn)染24、48、72 h后，成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率都高于支持細(xì)胞，二者差異顯著（P＜0.05）；轉(zhuǎn)染pEGFP-N3的成纖維細(xì)胞在轉(zhuǎn)染48 h后達(dá)到最大轉(zhuǎn)染效率29.69%±1.32%，轉(zhuǎn)染效率明顯高于轉(zhuǎn)染24和72 h，差異顯著（P＜0.05），轉(zhuǎn)染pEGFP-N3的支持細(xì)胞在轉(zhuǎn)染48 h后達(dá)到最大轉(zhuǎn)染效率9.62%± 0.12%，轉(zhuǎn)染效率與轉(zhuǎn)染24和72 h相比，差異顯著（P＜0.05）。

圖8表明，轉(zhuǎn)染后成纖維細(xì)胞存活時間可達(dá)到（47.5±4.62）d，明顯高于支持細(xì)胞存活時間（23.5± 3.94）d，二者差異顯著（P＜0.05）。

圖6 轉(zhuǎn)染pEGFP-N3-HNP1質(zhì)粒熒光蛋白EGFP表達(dá)情況(×400)Fig.6 Observe of the EGFP fluorescence expresstion at different times(×400)

圖7 不同時間細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率Fig.7 Cells transfection effciency in different time

圖8 細(xì)胞存活時間Fig.8 Transfection effeciency to cells survival time

3 討論與結(jié)論

犢牛睪丸支持細(xì)胞是研究雄性動物血睪屏障的良好研究體系，關(guān)于EGFP轉(zhuǎn)染犢牛睪丸支持細(xì)胞分布及效率研究較少見。試驗(yàn)結(jié)果顯示初期EGFP均勻充滿胞漿，后期EGFP向細(xì)胞核聚集，在細(xì)胞核的熒光強(qiáng)度明顯高于細(xì)胞質(zhì)中。質(zhì)粒pEGFP-N3含有高效功能強(qiáng)大的啟動子SV40和PC?MV，具有很強(qiáng)復(fù)制能力，大量復(fù)制，然后pEG?FP-N3被進(jìn)入細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄mRNA，mRNA出細(xì)胞核進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)進(jìn)行蛋白質(zhì)合成，因此，初期主要分布在細(xì)胞質(zhì)中，在核膜周圍富集。隨著轉(zhuǎn)染時間推移和細(xì)胞分裂，EGFP在細(xì)胞核內(nèi)富集，似乎EGFP傾向于細(xì)胞核內(nèi)富集。pEGFP-N3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染48 h的轉(zhuǎn)染效率顯著高于24和72 h的細(xì)胞，表明pEGFP-N3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染犢牛睪丸支持細(xì)胞和胎牛成纖維細(xì)胞的效率與細(xì)胞生長期有關(guān)，生長48 h的犢牛睪丸支持細(xì)胞和胎牛成纖維細(xì)胞，可能由于其正處于生長對數(shù)期，包括EGFP在內(nèi)的蛋白質(zhì)合成較為活躍，因而EGFP表達(dá)較高，72 h時EGFP表達(dá)情況變化不大，但由于未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞較陽性細(xì)胞生長快速，細(xì)胞總數(shù)增加，造成72 h時，細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率反而低于48 h。

轉(zhuǎn)染24、48、72 h后，轉(zhuǎn)染pEGFP-N3的成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率都高于支持細(xì)胞，顯然，支持細(xì)胞抗轉(zhuǎn)染能力高于成纖維細(xì)胞。由圖8可知，轉(zhuǎn)染后，成纖維細(xì)胞存活時間明顯高于支持細(xì)胞存活時間，顯然細(xì)胞內(nèi)外源蛋白對支持細(xì)胞傷害比成纖維細(xì)胞大。這與支持細(xì)胞特殊生理功能密不可分。哺乳動物的曲細(xì)精管腔主要由睪丸支持細(xì)胞組成，相鄰支持細(xì)胞基底部、血管內(nèi)皮基膜、結(jié)締組織和曲細(xì)精管基膜牢固緊密連接形成血睪屏障，血睪屏障能阻止外來的抗原進(jìn)入睪丸[7]，推測支持細(xì)胞有較強(qiáng)的抗轉(zhuǎn)染能力。一旦外源蛋白進(jìn)入細(xì)胞，支持細(xì)胞分泌各種炎癥因子[8]，引起炎癥反應(yīng)，推測進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的外源蛋白對支持細(xì)胞傷害比成纖維細(xì)胞大。影響細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率的因素很多，如EGFP基因表達(dá)隨DNA、脂質(zhì)體量增加而增加，延長細(xì)胞暴露時間反而使轉(zhuǎn)染效率下降，轉(zhuǎn)染細(xì)胞數(shù)適當(dāng)時轉(zhuǎn)染效率較高[9]。在今后研究中，可根據(jù)上述影響外源基因轉(zhuǎn)染效率的參數(shù)進(jìn)一步優(yōu)化pEG?FP-N3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染犢牛睪丸支持細(xì)胞和胎牛成纖維細(xì)胞的條件，為開展目標(biāo)蛋白質(zhì)在犢牛睪丸支持細(xì)胞和胎牛成纖維細(xì)胞中的功能研究提供理論依據(jù)。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，完善犢牛支持細(xì)胞、胎牛皮膚成纖維細(xì)胞體外培養(yǎng)體系，轉(zhuǎn)染pEGFP-N3載體后，細(xì)胞48 h轉(zhuǎn)染效率最高，初期EGFP均勻地充滿胞漿和胞核，后期EGFP向細(xì)胞核聚集，在細(xì)胞核處熒光強(qiáng)度明顯高于細(xì)胞質(zhì)中。支持細(xì)胞抗轉(zhuǎn)染能力高于成纖維細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后存活時間低于成纖維細(xì)胞，這可能和支持細(xì)胞特性有關(guān)。

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Bovine sertoli cells and fibroblast cells culturein vitroand their transfection with the plasmid pEGFP-N3

YU Na1,YANG Zeyu1,2,LIN Xu1,LI Yulong1, ZHAO Xunwu1,ZHANG Guixue1(1.School of Animal Science and Technology,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China;2.School of Chengdong,Northeast Agricultural University,Harbin 150500,China)

The newborn calf testicles and embryo skin were used in this experiment,the sertoli cells and fibroblast cells were transfected with the plasmid pEGFP-N3 by Liposome-mediated.The results showed that the purity of the cells was up to 95%.The early EGFP was evenly filled in cytosol after transfection.Later,EGFP was gathered in the nucleus and the fluorescence intensity in the nucleus became more higher in the cytoplasm.The results showed that transfection efficiency of fibroblast cell was higher than sertoli cells.The transfection efficiency of fibroblast cells and sertoli cells was significantly different after transfection at 24,48 and 72 h.Both cells got the highest transfection efficiency at 48 h.After transfecting, the life of fibroblast cells was obviously longer than sertoli cells.It may be due to the inimitable physiological function of sertoli cells and high tansfectiion efficiency of fibroblasts.

fibroblast cells;sertoli cells;in vitroculture;pEGFP-N3 plasmid

S823.3

A

1005-9369（2014）09-0089-06

2014-02-04

黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士基金項(xiàng)目（LRB04-185）

于娜（1982-），女，博士，研究方向?yàn)閯游镞z傳育種與繁殖。E-mail:yuna1982_2003@163.com

*通訊作者：張貴學(xué)，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)閯游锓敝?。E-mail:gxzhang@neau.edu.cn

時間2014-9-18 10:42:53[URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20140918.1042.005.html

于娜,楊澤宇,林旭,等.牛支持細(xì)胞和成纖維細(xì)胞體外培養(yǎng)及pEGFP-N3轉(zhuǎn)染[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2014,45(9):89-94.

Yu Na,Yang Zeyu,Lin Xu,et al.Bovine sertoli cells and fibroblast cells culturein vitroand their transfection with the plasmid pEGFP-N3[J].Journal of Northeast Agricultural University,2014,45(9):89-94.(in Chinese with English abstract)