林洪金，王從武

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030）

雞CSE多克隆抗體制備及硒缺乏對(duì)雞肝臟內(nèi)源性硫化氫生成酶的影響

林洪金，王從武

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030）

硒與硫化氫生成酶均在動(dòng)物生理活動(dòng)中起重要作用。為探討硒缺乏對(duì)雞內(nèi)源性硫化氫生成酶的影響，在建立雞低硒模型后，分別于15、25、35、45、55、65 d采集肝組織，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)H2S生成酶（CSE、CBS、3-MST）mRNA表達(dá)量。結(jié)果表明，低硒可誘導(dǎo)CSE、CBS和3-MST mRNA表達(dá)量升高，但無(wú)時(shí)間效應(yīng)，揭示H2S生成酶在硒缺乏導(dǎo)致的損傷中有重要作用。制備CSE多克隆抗體，為今后CSE蛋白水平研究奠定基礎(chǔ)。

硒；雞；肝臟；硫化氫生成酶；多克隆抗體

硒是人和動(dòng)物體內(nèi)重要微量元素，肝臟是缺硒的靶器官之一，低硒會(huì)引起肝組織損傷[1]。王志蘭等研究表明，硒缺乏大鼠表現(xiàn)出肝細(xì)胞壞死，這種壞死類(lèi)似于大量飲用酒精后產(chǎn)生的結(jié)果，肝細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)產(chǎn)生結(jié)構(gòu)變化導(dǎo)致微粒體過(guò)氧化反應(yīng)[2]。肝臟也是含硒量較多器官之一，硒可以發(fā)揮抗氧化能力預(yù)防肝纖維化[3]。H2S是繼NO和CO之后發(fā)現(xiàn)的第三類(lèi)信號(hào)分子，在體內(nèi)主要通過(guò)胱硫醚β合酶（Cystathionineβ-synthase,CBS）、胱硫醚γ裂解酶（Cystathionineγ-lyase,CSE）、3-巰基丙酮酸硫轉(zhuǎn)移酶（3-mercaptopyruvatesulfurtransferase, 3-MST）生成，H2S生成酶在機(jī)體系統(tǒng)中發(fā)揮生理作用[4]。當(dāng)機(jī)體發(fā)生疾病時(shí)，內(nèi)源性H2S生成酶的表達(dá)量發(fā)生改變。如張寧等在大鼠肝硬化中發(fā)現(xiàn)肝組織中CSE mRNA表達(dá)量低于正常對(duì)照組[5]。Kim等發(fā)現(xiàn)，在乙醇喂養(yǎng)大鼠1周后引起肝臟纖維化以及肝脂肪變性，此時(shí)CBS mRNA表達(dá)量有所下降[6]。本試驗(yàn)通過(guò)建立雞缺硒模型，檢測(cè)硒缺乏對(duì)CSE、CBS、3-MST mRNA的影響，制備雞CSE多克隆抗體，為后續(xù)研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)雞的飼養(yǎng)

選擇健康1日齡雛雞120只，隨機(jī)分為對(duì)照組和低硒組，每組60只，雌雄各半，對(duì)照組飼喂全價(jià)飼料，飼料中硒含量為0.15 mg·mL-1；低硒組飼喂缺硒日糧，飼料硒含量為0.033 mg·mL-1。均常規(guī)飼養(yǎng)，自由采食和飲水。飼喂期為65 d，分別在15、25、35、45、55、65 d時(shí)，將雛雞靜脈放血處死后采集肝臟組織，迅速放于液氮中進(jìn)行預(yù)冷，于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑

核酸內(nèi)切酶BamHⅠ和XhoⅠ、T4DNA連接酶等購(gòu)自大連寶生物公司；膠回收純化試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、DNA質(zhì)粒提取試劑盒、熒光定量PCR染料等購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；Trizol購(gòu)自Invitrogen中國(guó)（英濰捷基）公司；β-actin抗體、羊抗兔和羊抗鼠酶標(biāo)二抗（辣根過(guò)氧化物酶）購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；弗氏完全佐劑（FCA）和弗氏不完全佐劑（FIA）均購(gòu)自西格瑪奧德里奇（中國(guó)）公司；Troziol購(gòu)自大連寶生物公司；M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑、dNTP等常規(guī)試劑購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.3 肝組織中CSE、CBS、3-MST基因mRNA表達(dá)的檢測(cè)

1.3.1 肝組織總RNA提取

按照Trizol法提取肺組織總mRNA。取100 mg肺組織加1 mL Trizol于冰浴下進(jìn)行勻漿，后經(jīng)氯仿處理，異丙醇沉淀，75%乙醇洗滌后，略干燥，溶于DEPC處理水。經(jīng)核酸紫外分析儀檢測(cè),根據(jù)OD260/OD280值，確定樣品中RNA純度和含量。

1.3.2 肝組織總mRNA反轉(zhuǎn)錄

在總mRNA中，分別加入Oligo dT 4 μL、5× Buffer 16 μL、dNTP 4 μL、RNase Inhibitor 2 μL、M-MLV 4 μL以及由DEPC處理的滅菌水50 μL，混勻，共80 μL，42℃水浴60 min，85℃水浴5 min滅活反轉(zhuǎn)錄酶，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 熒光定量PCR擴(kuò)增

根據(jù)已知基因序列應(yīng)用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，驗(yàn)證引物特異性。

采用SYBR GreenⅠ熒光染料法進(jìn)行實(shí)時(shí)擴(kuò)增。20 μL反應(yīng)體系如下：

SYBR Premix ExTaq10 μL，Rox Reference DyeⅡ0.4 μL，上游引物（10 pmol·μL-1）0.4 μL，下游引物（10 pmol·μL-1）0.4 μL，cDNA模板2.0 μL，滅菌雙蒸水6.8 μL。反應(yīng)在ABI 7500 Real Time PCR System上進(jìn)行。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30 s，95℃5 s，60℃34 s，40個(gè)循環(huán)，最后為融解反應(yīng)。

計(jì)算方法采用2-ΔΔCt方法。

1.4 CSE多克隆抗體的制備

1.4.1 雞CSE基因序列的克隆與鑒定

1.4.1.1 雞CSE基因的擴(kuò)增與鑒定

根據(jù)GenBank中已經(jīng)公布的雞CSE cds區(qū)基因序列（XM_422542.3）設(shè)計(jì)特異性克隆表達(dá)引物：

應(yīng)用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的條帶，反應(yīng)體系（25 μL）如下：2×PCR SuperMix 12.5 μL，上下游特異性引物各1 μL，反轉(zhuǎn)錄模板1 μL，滅菌水9.5 μL，混勻后進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，52℃退火30 s，72℃延伸1 min，34個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min，4℃終止反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后取5 μL PCR產(chǎn)物，在0.8%瓊脂糖凝膠中電泳20 min。電泳后在紫外凝膠成像儀觀察條帶。

1.4.1.2 雞CSE重組表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定

電泳后大小與預(yù)測(cè)大小一致的PCR產(chǎn)物，用膠回收試劑盒純化和回收PCR產(chǎn)物。將獲得的PCR產(chǎn)物與pMD18-T載體相連，加入的試劑如下：4 μL膠回收產(chǎn)物，solution I 5 μL，pMD18-T載體4 μL，16℃連接過(guò)夜。取10 μL加到100 μL感受態(tài)細(xì)胞中，冰浴30 min，混勻。42℃水浴45 s后再冰浴1 min。加入500 μL無(wú)氨芐青霉素（Amp）的LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)1 h，取出后3 000 r·min-1離心1 min，留200 μL液體，混勻后涂于含100 μg·mL-1氨芐的LB平板上，37℃培養(yǎng)12 h，挑取白色單個(gè)菌落，于5 mL含Amp的液體LB培養(yǎng)基中，37℃搖床振蕩過(guò)夜。利用質(zhì)粒小提試劑盒，按照說(shuō)明書(shū)操作提取質(zhì)粒，進(jìn)行質(zhì)粒PCR反應(yīng)，核酸電泳比對(duì)片段大小。為進(jìn)一步核對(duì)目的基因是否連接到克隆載體，對(duì)陽(yáng)性克隆的質(zhì)粒經(jīng)BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定，進(jìn)行核酸電泳分析，觀察與預(yù)期大小的基因片段是否一致。經(jīng)質(zhì)粒PCR及酶切鑒定正確后，將疑似陽(yáng)性克隆的質(zhì)粒送序列測(cè)定公司進(jìn)行測(cè)序。應(yīng)用序列比對(duì)軟件將測(cè)序結(jié)果與已知序列進(jìn)行比對(duì)分析。

1.4.2 雞CSE基因在大腸桿菌中的表達(dá)、純化和鑒定

取pET-32a-CSE質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布LB（含Amp 60 μg·mL-1）平板，37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)過(guò)夜。挑取菌體并接種于10 mL LB（含Amp 60 μg·mL-1）中培養(yǎng)過(guò)夜。1∶10比例稀釋過(guò)夜菌，37℃振蕩培養(yǎng)至OD600在0.4～1.0（最好為0.6，大約需4 h）。取部分培養(yǎng)液作為未誘導(dǎo)的對(duì)照組，余下的加入IPTG誘導(dǎo)劑到終濃度為1 mmol·L-1作為試驗(yàn)組。每隔1 h在試驗(yàn)組中取出1 mL培養(yǎng)液，檢測(cè)OD值并加入上樣緩沖液煮沸15 min，進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分析。然后誘導(dǎo)100 mL菌液并收集菌體，經(jīng)過(guò)破碎后離心分離上清和沉淀。分別加入上樣緩沖液進(jìn)行蛋白鑒定。然后用預(yù)冷的18.625 g·L-1KCl進(jìn)行染色，當(dāng)出現(xiàn)寬變色條帶時(shí)，切下白色條帶并碾碎，加入PBS約400 μL，反復(fù)凍融3次后離心取上清，蛋白電泳檢測(cè)融合蛋白純度。

1.4.3 抗雞CSE多克隆抗體制備

將純化單一條帶的原核表達(dá)蛋白用PBS稀釋到1 mg·mL-1，與弗氏完全佐劑（首次免疫）或者弗氏完全佐劑（除首次免疫）進(jìn)行1∶1混合，形成穩(wěn)定乳劑，即可用于動(dòng)物接種。

免疫前從兔耳緣靜脈采血，作為陰性對(duì)照。免疫結(jié)束后收集血清，純化的CSE原核表達(dá)蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳后，應(yīng)用濕轉(zhuǎn)電轉(zhuǎn)移方法，將蛋白轉(zhuǎn)印至NC膜上，依次經(jīng)過(guò)5%脫脂乳孵育2 h、制備的血清孵育2 h、羊抗兔酶標(biāo)二抗（1∶2 000）孵育1 h。然后在膜上加入約400 μL DAB顯色液，避光孵育5 min，觀察膜上條帶并掃描。

2 結(jié)果與分析

2.1 臨床癥狀和肝臟剖檢變化

與正常組相比，低硒組可見(jiàn)雞精神沉郁，體重較正常組低，有滲出性素質(zhì)，剖檢肝臟時(shí)發(fā)現(xiàn)輕度萎縮，質(zhì)地脆弱，有的肝臟由深紅色變成灰黃色，局灶性壞死。

2.2 肝臟中CSE、CBS、3-MST mRNA表達(dá)水平

圖1～3分別顯示對(duì)照組和低硒組雞肝臟組中CSE、CBS、3-MST基因mRNA表達(dá)的對(duì)比，從圖中可以發(fā)現(xiàn)，從15 d開(kāi)始到65 d，各低硒組中CSE、CBS、3-MST基因mRNA表達(dá)量均高于對(duì)照組，且差異性顯著（P＜0.05）。CSE mRNA水平在15 d時(shí)增長(zhǎng)幅度最小，為82%；在65 d時(shí)增長(zhǎng)幅度最大，為228%。CBS mRNA水平在45 d時(shí)增長(zhǎng)幅度最小，為96%；在65 d時(shí)增長(zhǎng)幅度最大，為222%。3-MST mRNA水平在15 d時(shí)增長(zhǎng)幅度最小，為88%；在65 d增長(zhǎng)幅度最大，為232%。雞肝臟CSE蛋白表達(dá)水平結(jié)果與mRNA水平相似，從15～65 d時(shí)所有低硒組CSE蛋白表達(dá)量均大于對(duì)照組。

圖1 硒缺乏對(duì)雞肝臟CSE mRNA表達(dá)量的影響Fig.1 Effects of Se-deficiency on CSE mRNA level in chicken liver

圖2 硒缺乏對(duì)雞肝臟CBS mRNA表達(dá)量的影響Fig.2 Effects of Se-deficiency on CBS mRNA level in chicken liver

圖3 硒缺乏對(duì)雞肝臟3-MST mRNA表達(dá)量的影響Fig.3 Effects of Se-deficiency on 3-MST mRNA level in chicken liver

2.3 雞CSE多克隆抗體制備

2.3.1 雞CSE基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果

對(duì)雞CSE基因應(yīng)用DNAstar軟件分析親水區(qū)和抗原區(qū)等并設(shè)計(jì)克隆表達(dá)引物，以雞肝臟組織cDNA為模板，擴(kuò)增目的基因CSE，PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析（見(jiàn)圖4），在約528 bp處有特異性帶，與預(yù)期產(chǎn)物大小相符。

圖4 應(yīng)用克隆表達(dá)引物擴(kuò)增雞CSE基因Fig.4 Amplification of CSE gene by using clone and expression primers

2.3.2 雞CSEmRNA基因序列測(cè)序結(jié)果

膠回收純化的目的片段與克隆載體連接后，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中。質(zhì)粒經(jīng)PCR和雙酶切進(jìn)行鑒定。被鑒定為陽(yáng)性克隆的進(jìn)行測(cè)序分析，測(cè)序結(jié)果通過(guò)分子生物學(xué)軟件與CSE mRNA基因序列進(jìn)行比對(duì)，核苷酸同源性比對(duì)為99.8%，氨基酸同源性比對(duì)為100%，證明成功克隆雞CSE基因。

2.3.3 重組表達(dá)載體構(gòu)建與鑒定

構(gòu)建克隆載體和空表達(dá)載體雙酶切及膠回收試劑盒純化后，用T4DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)化后挑取單個(gè)菌落培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，經(jīng)PCR和雙酶切鑒定。瓊脂糖凝膠電泳顯示，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物及酶切插入片段長(zhǎng)528 bp，符合預(yù)測(cè)分子質(zhì)量。重組質(zhì)粒酶切及測(cè)序鑒定表明成功構(gòu)建CSE基因表達(dá)載體（見(jiàn)圖5）。

圖5 CSE重組原核表達(dá)質(zhì)粒PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖譜Fig.5 Electrophoresis of the PCR product from the recombinant plasmid of CSE

2.3.4 融合蛋白表達(dá)、鑒定與純化

2.3.4.1 基因表達(dá)產(chǎn)物SDS-PAGE分析

雞CSE的陽(yáng)性重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coliRosetta后，經(jīng)1 mmol·L-1IPTG在37℃誘導(dǎo)，蛋白表達(dá)量隨著時(shí)間逐漸增加，最佳誘導(dǎo)時(shí)間為4 h，表達(dá)產(chǎn)物大小與預(yù)期一致，CSE約為41 ku，見(jiàn)圖6。

圖6 重組原核表達(dá)質(zhì)粒pET32a-CSE，1.0 mmol·L-1IPTG不同誘導(dǎo)時(shí)間SDS-PAGE分析結(jié)果Fig.6 SDS-PAGE analysis of the pET32a-CSE with 1.0 mmol·L-1IPTG

2.3.4.2 融合蛋白純化

將純化的CSE的原核表達(dá)蛋白取10 μL進(jìn)行蛋白電泳，得到單一蛋白條帶，大小與預(yù)期大小相符，經(jīng)測(cè)定純化蛋白濃度，可達(dá)2.4 mg·mL-1（見(jiàn)圖7）。

圖7 融合蛋白純化Fig.7 Purification of fusion protein

2.3.5 多克隆抗體制備和鑒定結(jié)果

2.3.5.1 ELISA法測(cè)定多克隆抗體效價(jià)結(jié)果

ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示CSE原核表達(dá)蛋白能被制備的兔多克隆抗體血清識(shí)別，其中免疫目的蛋白的兔多克隆抗體血清效價(jià)為1∶25 600。

2.3.5.2 Western Blot的檢測(cè)結(jié)果

雞CSE基因原核表達(dá)蛋白經(jīng)蛋白凝膠電泳后，轉(zhuǎn)印至NC膜上，制備的兔多克隆抗體血清稀釋倍數(shù)為1∶1 000，加入酶標(biāo)二抗后，DAB顯色，NC膜上在41 ku的位置出現(xiàn)單一條帶，證明成功制備雞CSE基因兔多克隆抗體，是目的蛋白誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性抗體。

3 討論與結(jié)論

多克隆抗體應(yīng)用廣泛，相對(duì)于單克隆抗體而言，多克隆抗體具有制備技術(shù)簡(jiǎn)單、試驗(yàn)周期短價(jià)格低等優(yōu)點(diǎn)。首先用引物設(shè)計(jì)軟件盡量在抗原性強(qiáng)及親水性強(qiáng)的基因序列區(qū)域設(shè)計(jì)特異性引物。PCR擴(kuò)增，連接到克隆載體后進(jìn)行測(cè)序。試驗(yàn)得到雞CSE基因序列與NCBI公布的雞CSE基因序列核苷酸同源性為99.8%，氨基酸同源性為100%。表達(dá)載體選用pET-32a，因?yàn)閜ET-32a表達(dá)載體在大腸桿菌中可高效穩(wěn)定表達(dá)外源性蛋白質(zhì)[7]。本試驗(yàn)表達(dá)菌株選用BL21（DE3），BL21屬于蛋白酶缺陷型菌株，蛋白酶在菌株內(nèi)含量過(guò)多使外源表達(dá)產(chǎn)物穩(wěn)定性較差，所以選用這種蛋白酶缺陷型的菌株使得表達(dá)產(chǎn)物更加穩(wěn)定。

本試驗(yàn)選擇的免疫動(dòng)物是新西蘭白兔，免疫效果較好，每2周免疫1次，共免疫4次。免疫結(jié)束后，經(jīng)Western Blot分析，本試驗(yàn)制備的CSE多克隆抗體能與其融合蛋白結(jié)合，條帶與預(yù)期大小一致且條帶單一，說(shuō)明本試驗(yàn)利用原核表達(dá)系統(tǒng)成功制備特異性強(qiáng)的兔抗雞CSE抗體，為進(jìn)一步研究雞CSE在日糧低硒中變化奠定基礎(chǔ)。

CSE、CBS、3-MST是動(dòng)物機(jī)體內(nèi)促進(jìn)內(nèi)源性H2S生成酶，在多數(shù)組織中存在，在肝臟表達(dá)量較高。但CSE和CBS具有組織特異性，有些組織中只存在其中一種。比如在大鼠平滑肌、主動(dòng)脈、肺動(dòng)脈、腸系膜動(dòng)脈中只發(fā)現(xiàn)CSE表達(dá)，無(wú)CBS表達(dá)；在小腦中一般只有CBS表達(dá)，無(wú)CSE表達(dá)。CSE、CBS、3-MST在內(nèi)源性H2S的生成途徑中有不同作用。

在多數(shù)情況下促進(jìn)H2S生成酶類(lèi)是共同作用結(jié)果。比如在慢性腎臟疾病中，導(dǎo)致CSE、CBS、3-MST表達(dá)同時(shí)降低[8]。在肝臟缺血再灌注和功能紊亂引起損傷中，機(jī)體通過(guò)對(duì)CSE、CBS、3-MST的調(diào)控直接影響內(nèi)源性H2S的生成繼而發(fā)揮對(duì)肝臟保護(hù)作用[9]。其對(duì)肝臟的氧化應(yīng)激有一定作用。Robert等發(fā)現(xiàn)，在CBS基因敲除的大鼠肝臟中，大量氧化應(yīng)激基因表達(dá)上升[10]。CBS基因的敲除可提升肝臟中蛋白質(zhì)氧化和脂質(zhì)過(guò)氧化30%，由于肝星狀細(xì)胞激活，使肝損傷增加50倍[11-12]。在CSE基因敲除后，出現(xiàn)類(lèi)似CBS基因敲除現(xiàn)象，機(jī)體產(chǎn)生氧化損傷，抗氧化能力下降[13]。在大鼠腎小管間質(zhì)纖維化，CBS和CSE的mRNA及蛋白水平均降低，用NaHS處理后又可同時(shí)上調(diào)腎組織CBS和CSE的mRNA和蛋白表達(dá)量[14]。CSE、CBS、3-MST在肝臟中均可促進(jìn)H2S生成，所以當(dāng)肝臟受到損傷時(shí)，其表達(dá)水平可能會(huì)被同時(shí)升高或降低。這與本次試驗(yàn)結(jié)果一致。

綜上所述，日糧低硒可導(dǎo)致雞肝臟中CSE、CBS、3-MST mRNA表達(dá)量顯著升高，這可能是由于機(jī)體自發(fā)調(diào)控來(lái)保護(hù)肝臟引起，其作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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Preparation of polyclonal antibody of chick CSE and the effect of sele?nium deficiency on endogenous hydrogen producing enzymes in chicks

LIN Hongjin,WANG Congwu(School of Veterinary Medicine,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China)

Both selenium and sulfide-producing enzyme play important roles in the physiological activity of the animals.The aim of this investigate revealed the effect of generate hydrogen sulfide enzyme induced by the chicken model of selenium deficiency.Liver tissue were collected on 15,25,45,55,65 d. Real-time PCR was used to detect the expression of mRNA H2S producing enzyme(CSE,CBS,3-MST). The results showed that the expression level of selenium could induce the mRNA in CSE,CBS and 3-MST, but there was no effect of time,suggesting that H2S generation enzymes played an important role in the injury in selenium deficiency.At the same time,the preparation of CSE polyclonal antibody was prepared, providing a reference research on the level of CSE protein in the future.

selenium;chick;liver;hydrogen sulfide-producing enzymes;polyclonal antibody

S831

A

1005-9369（2014）09-0095-05

2014-04-02

國(guó)家自然科學(xué)基金（31272626）

林洪金（1970-），男，副教授，博士，研究方向?yàn)榕R床獸醫(yī)學(xué)。E-mail:linhongjin_2000@163.com

時(shí)間2014-9-18 10:49:23[URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20140918.1049.014.html

林洪金,王從武.雞CSE多克隆抗體制備及硒缺乏對(duì)雞肝臟內(nèi)源性硫化氫生成酶的影響[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2014,45(9): 95-99.

Lin Hongjin,Wang Congwu.Preparation of polyclonal antibody of chick CSE and the effect of selenium deficiency on endogenous hydrogen producing enzymes in chicks[J].Journal of Northeast Agricultural University,2014,45(9):95-99.(in Chinese with English abstract)