王勇，韋賀遠(yuǎn)，劉彬昕，陳典

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，農(nóng)業(yè)部東北地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點實驗室，哈爾濱 150030）

洋蔥成花素同源基因AcLFT3的克隆與表達(dá)分析

王勇，韋賀遠(yuǎn)，劉彬昕，陳典

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，農(nóng)業(yè)部東北地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點實驗室，哈爾濱 150030）

以RT-PCR結(jié)合RACE方法克隆洋蔥成花素同源基因AcLFT3的全長cDNA序列，利用生物信息學(xué)方法對蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測分析，采用實時定量PCR法分析洋蔥AcLFT3基因在不同時期不同器官的表達(dá)模式，為探討洋蔥抽薹開花的分子機制奠定基礎(chǔ)?？寺～@得的洋蔥成花素同源基因AcLFT3 cDNA全長序列共838 bp，其中開放讀碼框為540 bp，編碼由179個氨基酸組成、等電點為8.81、分子質(zhì)量為20.1 ku的一個PEBP家族蛋白。AcLFT3與大蔥成花素蛋白的同源性最高，為84.4%，其次為鳶尾。實時熒光定量PCR分析表明，AcLFT3基因在洋蔥不同生長發(fā)育階段器官中均有表達(dá)，以春化后抽薹前的葉片中表達(dá)量最高。

洋蔥；AcLFT3；熒光定量；序列分析；表達(dá)模式

植物成花受環(huán)境因素和內(nèi)源因素調(diào)控，其中成花素基因是關(guān)鍵基因之一。生殖生長階段起始標(biāo)志是花芽形成，即花器官孕育?；ㄆ鞴賮碓从陧敹朔稚M織花原基分化，而葉片是感受外界環(huán)境變化器官，這兩個器官在空間上是分開的，因此會有一個長距離的運輸信號將其聯(lián)系起來，將這種信號物質(zhì)稱為開花素[1]。研究表明，花素是一種由FT基因編碼的蛋白質(zhì)[2-3]，盡管植物成花轉(zhuǎn)變受不同外界因素影響及內(nèi)部基因調(diào)控，但最終都匯集到相同開花整合因子——FT（FLOWERING LOCUS T）基因處。FT基因首次克隆于擬南芥中[4]。研究認(rèn)為，F(xiàn)T首先與轉(zhuǎn)錄因子FD基因相互作用，激活轉(zhuǎn)錄特性基因，結(jié)合在花序分生組織特征基因和花器官形態(tài)特征基因AP1（APETALA1）的啟動子區(qū)域，來促進(jìn)開花[5]，通過轉(zhuǎn)基因試驗也證實FT基因可促進(jìn)開花[6]。從蛋白結(jié)構(gòu)上看[7-8]：FT蛋白屬于PEBP家族，該家族基因的功能和結(jié)構(gòu)在不同植物間也有較高的保守性，在調(diào)控開花上起重要作用[9]。現(xiàn)已在蕙蘭[10]、菊花[11]、水稻[12]、荔枝[13]和山核桃[14]等植物中克隆得到FT及其同源基因。洋蔥年產(chǎn)量排在番茄、甘藍(lán)之后，占據(jù)蔬菜作物的第三位[15]。我國是世界洋蔥生產(chǎn)大國，但我國洋蔥出口量不足國際市場的1/10，其中主要制約因素之一是洋蔥的先期抽薹。迄今為止，關(guān)于洋蔥成花調(diào)控的分子機制鮮見報道。

本研究立足于洋蔥生產(chǎn)實踐，針對普遍存在的先期抽薹問題，克隆成花素基因，分析其結(jié)構(gòu)特點及表達(dá)特性，旨在探索成花素基因在洋蔥抽薹中的作用，以期結(jié)合洋蔥的LFY、FLC、CO、AP1等基因，明確洋蔥抽薹機制，為通過基因工程方法調(diào)控開花奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試洋蔥“1007”品系由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)蔥蒜課題組提供；dNTPs、3'-Full RACE Core Set Ver.2.0、5'-Full RACE Kit、LA TaqDNA Polymerase等購自TaKaRa公司；pEASY-T3 Cloning Kit購自TransGen公司；Trizol試劑購自Invitrogen公司；M-MLV Reverse Transcriptase和限制性內(nèi)切酶均購自MBI公司；引物經(jīng)Primer5軟件設(shè)計，由博仕生物公司合成。

1.2 洋蔥總RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄

采用Invitrogen公司生產(chǎn)的Trizol試劑提取洋蔥抽薹前的葉片RNA，測定OD260和OD280值，計算RNA含量和純度，并用瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性，用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶（MBI公司）對提取的總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲得第1鏈cDNA，將其保存于-20℃冰箱中。

1.3 AcLFT3的克隆

從GenBank上下載已登錄的葡萄、水仙、鳶尾等植物的FT同源基因序列，用DNAMAN軟件進(jìn)行序列比對，根據(jù)比對得出的保守區(qū)設(shè)計簡并引物FTP-F和FTP-R（見表1），以洋蔥總RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，通過PCR擴增出中間片段。純化回收后與pEASY-T3載體進(jìn)行連接轉(zhuǎn)化（DH5α大腸桿菌），37℃過夜培養(yǎng)，藍(lán)白斑篩選后挑取已連接的白斑，經(jīng)質(zhì)粒PCR與酶切檢測驗證為陽性克隆后，測序。

按照3'-Full RACE Core Set Ver.2.0和5'-Full RACE Kit說明書方法進(jìn)行3'RACE和5'RACE擴增。3'RACE根據(jù)TaKaRa公司的3'-Full RACE Core Set Ver.2.0中的方法修飾后用試劑盒內(nèi)的特異性引物，把洋蔥總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。根據(jù)測序所得中間片段序列設(shè)計兩個上游特異性引物AcFTGSP3-F、AcFTGSP3-R（見表1），進(jìn)行巢式PCR擴增，得到預(yù)期大小的片段后，切膠回收，連接pEASY-T3載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，藍(lán)白斑篩選陽性克隆，經(jīng)質(zhì)粒PCR和酶切鑒定后測序。5'RACE根據(jù)TaKaRa公司的5'-Full RACE Kit對提取的總RNA去磷酸化、mRNA去除帽子結(jié)構(gòu)、連接RNA Oligo到脫帽的mRNA 5'端、反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。根據(jù)測序所得中間片段序列設(shè)計兩個上游特異性引物AcFTGSP5-F、AcFTGSP5-R（見表1），以得到的cDNA為模板，進(jìn)行巢式PCR，得到預(yù)期大小的片段后進(jìn)行切膠回收，連接pEASY-T3載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，篩選陽性克隆，經(jīng)質(zhì)粒PCR和酶切鑒定后測序。

1.4 AcLFT3蛋白的生物信息學(xué)分析

應(yīng)用DNAstar軟件推測洋蔥AcLFT3的氨基酸組成，對蛋白的基本特征進(jìn)行分析；使用MEGA 5.2.1軟件建立系統(tǒng)進(jìn)化樹；用SMART4.0完成蛋白質(zhì)序列功能域預(yù)測；根據(jù)生物信息學(xué)在線軟件http: //www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/分析蛋白質(zhì)的信號肽結(jié)構(gòu)；用SWISS-MODEL對洋蔥AcLFT3蛋白中氨基酸序列的三級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測。

1.5 AcLFT3的時空表達(dá)模式分析

用Trizol試劑分別提取洋蔥營養(yǎng)時期的根、葉鞘、葉片，春化后抽薹前的根、葉鞘、葉片，抽薹開花期的葉片、假莖、花序等器官的RNA，用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶，反轉(zhuǎn)錄成cDNA模板，根據(jù)克隆的基因序列分別設(shè)計實時熒光定量的內(nèi)參引物（AcActin-F，AcActin-R）和基因特異性引物（AcFT-F，AcFT-R），按照SYBRPremix ExTaqTMⅡ操作說明，在Bio-Rad iQ5熒光定量PCR儀上完成PCR擴增，通過溶解曲線和擴增曲線鑒定引物的特異性，檢測基因的相對表達(dá)量，3次重復(fù)，輸出數(shù)據(jù)使用Microsoft Excel 2003軟件處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 AcLFT3基因的克隆及序列分析

以Trisol方法提取RNA，可以去除植物內(nèi)的多糖、酚類等利用一些傳統(tǒng)方法提取RNA很難除去的物質(zhì)[16]。以洋蔥葉片總RNA反轉(zhuǎn)錄所得的cDNA為模板，利用FTP-F和FTP-R簡并引物，擴增得到FT基因中間片段，長度為234 bp。用RACE法分別獲得FT基因的3'端序列長度為563 bp，5'cDNA末端序列長度為373 bp，之后利用DNAMAN序列拼接后得到長度為838 bp的全長cDNA序列，進(jìn)行開放讀碼框分析，根據(jù)編碼區(qū)設(shè)計特異性引物FTORF-F和FTORF-R，擴增得到編碼區(qū)cDNA序列，該序列為540 bp,將其命名為AcLFT3（見圖1）。

由圖2可知，該基因4種堿基A、T、C、G的含量分別為31.9%；25.2%；18.5%；24.4%。AcLFT3所編碼的氨基酸序列在第68位有一個D-P-D-x-P元件，而在此后第10個殘基處是一個histidine殘基，據(jù)此較近處有1個G-I-H-R元件，由此可以推測AcLFT3蛋白屬于PEBP家族成員，與此前有關(guān)FT蛋白屬于PEBP家族的報道相吻合[17]。

2.2 氨基酸序列比對及系統(tǒng)發(fā)育分析

采用DNAMAN軟件，分析AcLFT3與大蔥、番薯、擬南芥和陸地棉等7種植物FT的一致性，結(jié)果表明（見圖3），洋蔥AcLFT3的氨基酸序列與大蔥的成花素氨基酸序列同源性最高，達(dá)到84.4%，其次為鳶尾，同源性為83.9%，與番薯、擬南芥和葡萄等植物的同源性也在60.0%以上，說明FT蛋白在進(jìn)化上相對保守。

圖1 AcLFT3基因RT-PCR和RACE擴增結(jié)果Fig.1 RT-PCR and RACE amplification of AcLFT3

圖2 洋蔥AcLFT3的cDNA序列及預(yù)測氨基酸序列Fig.2 cDNA sequence and deduced amino acid sequence of AcLFT3 gene

以MEGA5.1軟件構(gòu)建（bootstrap）neighboroining（NJ）樹（見圖4），結(jié)果顯示，洋蔥AcLFT3與大蔥親緣關(guān)系最近，其次是鳶尾。從系統(tǒng)進(jìn)化樹可見，在進(jìn)化上，洋蔥的成花素同源基因AcLFT3明顯不同于此前克隆的洋蔥花序分生組織特異基因AcLFY，后者把單雙子葉植物在進(jìn)化上明顯分為并列的兩個分支[18]，而AcLFT3在單子葉植物與雙子葉植物間差別不大，推測該基因出現(xiàn)較早。

圖3 洋蔥AcLFT3與其他植物FT氨基酸序列比對Fig.3 Alignment of the A.cepa AcLFT3 with FT from other plant specie

圖4 洋蔥AcLFT3與其他植物的FT系統(tǒng)進(jìn)化樹分析Fig.4 Phylogenetic tree analysis of the Allium cepa AcLFT3 with FT from other plant species

2.3 AcLFT3基因表達(dá)的定量分析

實時熒光定量PCR結(jié)果表明（見圖5），AcLFT3基因在洋蔥營養(yǎng)生長時期的根、葉鞘、葉片，春化后抽薹前的根、葉鞘、葉片，開花后的葉片、假莖、花序等器官中均有表達(dá)，但表達(dá)量存在明顯差異，AcLFT3基因在春化后期抽薹前期的葉片中表達(dá)量最高，而在根、假莖、花序中的表達(dá)量相對較低。

圖5 洋蔥AcLFT3基因的時空表達(dá)特性Fig.5 Spatiotemporal expression patterns of AcLFT3 gene in onion

3 討論

FT是一類開花調(diào)控基因，在模式植物擬南芥中參與光周期、赤霉素、春化和自主成花等與成花相關(guān)的途徑，與轉(zhuǎn)錄因子FD相互作用，調(diào)控花序分生組織特征基因和花器官發(fā)生基因APETALA1（AP1）的表達(dá)，是植物中的促花基因[1]。很多植物的成花素基因被分離出來，如水稻[12]，菊花[11]和山核桃[14]等植物中克隆出FT同源基因，在洋蔥中已克隆出LFY等與抽薹開花相關(guān)的基因，但目前關(guān)于FT報道較少，明確FT基因的表達(dá)規(guī)律及其功能結(jié)構(gòu)有利于調(diào)控洋蔥抽薹開花。本研究以洋蔥品系“1007”為材料，克隆AcLFT3基因，并利用熒光定量PCR方法，分析AcLFT3基因在洋蔥營養(yǎng)期的根、葉鞘、葉片，春化后抽薹前的根、葉鞘、葉片，開花后的葉片，假莖、花序等不同時期不同部位中的表達(dá)情況，初步明確洋蔥成花基因結(jié)構(gòu)，并發(fā)現(xiàn)其在春化后抽薹前的葉片中表達(dá)量最高。研究發(fā)現(xiàn)，早熟枳中FT的同源基因在葉和果實中的表達(dá)量比在莖和花器官中明顯較高，可能因為在同一個植物中存在多個FT或FT類似基因，并有不同的表達(dá)模式[19]。Nishikawa等研究發(fā)現(xiàn)，溫州蜜柑中存在的CiFT1、CiFT2和CiFT3三種FT同源基因在植物中的表達(dá)量不同，CiFT1和CiFT2基因在果實中表達(dá)量較高，在莖和葉片中表達(dá)量較低，而CiFT3基因在莖和葉片中的表達(dá)量較高，與洋蔥的AcLFT3基因表達(dá)特性較為相似[20]。試驗研究表明，在洋蔥中同樣存在多個FT基因，這些FT在洋蔥中的表達(dá)模式是否一致，在功能上是否冗余，具體以何種方式、何種途徑參與成花調(diào)控，尚待深入研究。

4 結(jié)論

利用RT-PCR結(jié)合RACE技術(shù)從洋蔥中克隆得到AcLFT3，該基因開放讀碼框為540 bp，編碼由179個氨基酸組成的蛋白。經(jīng)同源性分析與系統(tǒng)發(fā)育樹分析，表明該蛋白與大蔥和鳶尾成花素的同源性較高。表達(dá)模式分析表明，AcLFT3基因在洋蔥春化后抽薹前的葉片中表達(dá)量最高，而在根、假莖、花序中的表達(dá)量相對較低。

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Molecular cloning and expression analysis of FT homologous gene AcLFT3 inAllium cepa

WANG Yong,WEI Heyuan,LIU Bingxin,CHEN Dian(School of Horticulture,Key Laboratory of Biology and Genetic Improvement of Horticultural Crops Northeast Region,Ministry of Agriculture,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China)

The full-length cDNA of florigen homologous geneAcLFT3 was obtained by RT-PCR and Rapid Amplification of cDNA Ends.The protein structure ofAcLFT3 was analyzed by bioinformatics methods.The expression pattern ofAcLFT3 among organs with different developmental stages in Allium cepa were analyzed by QRT-PCR.All the results will establish a foundation for molecular mechanism of bolting and florescence inAllium cepa.In this study,the cloned cDNA sequence of AcLFT3 inAllium cepawas 838 bp with a 540 bp open reading frame(ORF).The deducedAcLFT3 protein was a member of the PEBP family,which had 179 amino acids.The molecular weight of AcLFT3 protein was 20.1 ku and its isoelectric point was 8.81.AsAcLFT3 had the closest relationship to Allium fistulosum(84.4%),followed byIris fulva.QRT-PCR result showed thatAcLFT3 was expressed during all the organs with different developmental stages.More interestingly,AcLFT3 was highly expressed in leaves ofAllium cepafrom the stage of vernalization to bolting.

Allium cepa;AcLFT3;fluorescence quantitative;sequence analysis;expression pattern

S633.2

A

1005-9369（2014）09-0040-07

2014-03-03

黑龍江省科技特派員項目（GC13B809）；公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項項目（200903018）

王勇（1971-），女，教授，博士，碩士生導(dǎo)師，研究方向為蔬菜遺傳育種。E-mail:lwang2002@163.com

時間2014-9-18 10:45:24[URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20140918.1045.008.html

王勇,韋賀遠(yuǎn),劉彬昕,等.洋蔥成花素同源基因AcLFT3的克隆與表達(dá)分析[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2014,45(9):40-46.

Wang Yong,Wei Heyuan,Liu Bingxin,et al.Molecular cloning and expression analysis of FT homologous geneAcLFT3 in Allium cepa[J].Journal of Northeast Agricultural University,2014,45(9):40-46.(in Chinese with English abstract)