何冰倩， 李俊麗， 劉小平， 林如文

(武漢理工大學(xué)化工學(xué)院制藥工程系，湖北 武漢430070)

苦參堿(Matrine)是豆科植物苦參、苦豆子、山豆根等藥用植物的活性成分，于1958 年被首次分離和確認(rèn)，屬四環(huán)喹嗪啶類化合物［1］，具有抗菌、抗炎、抗心律失常、抗腫瘤等重要作用?，F(xiàn)代藥理研究表明，苦參堿對(duì)多種病原微生物、陰道滴蟲等有顯著抑制作用，故常用于治療婦科炎癥。由于婦科炎癥發(fā)病率高、發(fā)作反復(fù)、臨床表現(xiàn)多樣化、發(fā)作年齡段廣等特點(diǎn)，因此對(duì)婦科炎癥的治療刻不容緩［2］。目前，臨床治療主要以局部給藥為主，常用的有栓劑、軟膏、溶液等［3］。但由于存在皮膚角質(zhì)層的屏障作用使得藥物難以透過皮膚發(fā)揮藥效，臨床療效差。所以促進(jìn)藥物在給藥部位的滲透吸收成為研究熱點(diǎn)。

醇質(zhì)體(Ethosomes)是一種由磷脂、高濃度低分子量的醇、水組成的具有脂質(zhì)雙分子層結(jié)構(gòu)的新型柔性脂質(zhì)體，能有效地運(yùn)送藥物通過角質(zhì)層進(jìn)入皮膚更深層甚至血液循環(huán)，憑借其高滲透率、高包封率、高變形性等顯著優(yōu)點(diǎn)越來越受到青睞［4-5］。但醇質(zhì)體中存在的高濃度乙醇的揮發(fā)性易引起穩(wěn)定性問題，用乙醇和丙二醇的混合醇替換單一的乙醇來制備醇質(zhì)體，即二元醇質(zhì)體，與普通醇質(zhì)體相比，具有良好的變形性、透皮性及穩(wěn)定性，具有良好的應(yīng)用前景［6-7］。

本實(shí)驗(yàn)擬制備苦參堿二元醇質(zhì)體，對(duì)其處方進(jìn)行優(yōu)化，并對(duì)其質(zhì)量控制進(jìn)行研究，以期為研發(fā)新型苦參堿制劑奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 FA2004 電子分析天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司);DF-101S 恒溫加熱磁力攪拌器(鞏義市英峪予華儀器廠);TGL16C 超速離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠);LC-20AT 高效液相色譜儀(HPLC，日本島津);BI-200SM動(dòng)態(tài)光散射儀(DLS，美國(guó)BROOKHAVEN);Tecnai G220 S-TWIM 透射電子顯微鏡(TEM，美國(guó)FEI);LS-3000 低溫光照儀(藥物制劑國(guó)家工程研究中心)。

1.2 材料 苦參堿 (江蘇天晟藥業(yè)有限公司，批號(hào)20130203，純度98%);苦參堿對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)110805-201302);卵磷脂、膽固醇等(均購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);其他試劑均為分析純，流動(dòng)相所用乙腈、乙醇(色譜純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 醇質(zhì)體的制備

2.1.1 苦參堿二元醇質(zhì)體的制備 采用醇注入法制備［8］。稱取處方量卵磷脂溶于處方量乙醇與丙二醇混合溶液中，同時(shí)稱取處方量苦參堿溶于處方量醋酸鹽緩沖液(pH =4.5)。(37 ±1)℃恒溫密封持續(xù)攪拌條件下，將醇相緩慢注入到水相中，注射完畢后，繼續(xù)恒溫?cái)嚢?0 min，過0.22 μm 濾膜濾過即得醇質(zhì)體溶液。

2.1.2 空白醇質(zhì)體的制備 稱取處方量卵磷脂溶于處方量乙醇與丙二醇混合溶液中，量取處方量醋酸鹽緩沖液，其他操作同上。

2.2 苦參堿測(cè)定方法的確定

2.2.1 色譜條件 YMC-Pack NH2色譜柱 (4.6 mm ×250 mm，5 μm);流動(dòng)相乙腈-乙醇(9 ∶1，V/V);體積流量0.8 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)215 nm;柱溫室溫;進(jìn)樣量20 μL。

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的確定 精密稱取10 mg 苦參堿對(duì)照品，置于100 mL 量瓶中，加流動(dòng)相溶解，稀釋至刻度并搖勻，得100 μg/mL 的苦參堿溶液。精密量取上述溶液1 mL 置于100 mL 量瓶中，另取1、2、4、6、8 mL 分別置于10 mL 量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度并搖勻，分別得苦參堿質(zhì)量濃度為1、10、20、40、60、80、100 μg/mL 的溶液。按“2.2.1”項(xiàng)下條件進(jìn)行檢測(cè)，以峰面積(A)對(duì)質(zhì)量濃度(C)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程A =32 046C +22 081，r2=0.999 1，結(jié)果表明苦參堿在1 ～100 μg/mL 范圍內(nèi)峰面積與質(zhì)量濃度呈良好的線性關(guān)系。

2.2.3 方法學(xué)考察

2.2.3.1 精密度試驗(yàn) 精密吸取低、中、高質(zhì)量濃度苦參堿對(duì)照品溶液，分別按“2.2.1”項(xiàng)下條件進(jìn)行檢測(cè)，重復(fù)進(jìn)樣5 次，以峰面積計(jì)算，RSD 分別為0.59%、0.76%、0.57%，平均RSD=0.64%。

2.2.3.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取低、中、高質(zhì)量濃度苦參堿對(duì)照品溶液，分別在0、24、48 h 按“2.2.1”項(xiàng)下條件進(jìn)行檢測(cè)，以峰面積計(jì)算，RSD 分別為0.83%、0.75%、0.76%，平均RSD=0.78%，表明標(biāo)準(zhǔn)溶液在48 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.3.3 回收率試驗(yàn) 量取3 份空白醇質(zhì)體溶液10 mL，分別加入苦參堿對(duì)照品100、200、300 mg，使苦參堿完全溶解。按“2.2.1”項(xiàng)下條件進(jìn)行檢測(cè)，以峰面積計(jì)算，求得平均回收率為96.88% (n=9);RSD 為0.47%。

2.2.3.4 供試品溶液專屬性 供試品溶液的制備:精密吸取苦參堿二元醇質(zhì)體溶液0.1 mL，置于10 mL 量瓶中，加適量甲醇破乳，加流動(dòng)相定容搖勻后，即得供試品溶液?？瞻讓?duì)照溶液:精密吸取空白醇質(zhì)體溶液0.1 mL，置于10 mL量瓶中，加適量甲醇破乳，并用流動(dòng)相定容搖勻后，即得空白對(duì)照溶液。

專屬性試驗(yàn) 精密吸取苦參堿對(duì)照品溶液、供試品溶液和空白對(duì)照液，按“2.2.1”項(xiàng)下條件進(jìn)行測(cè)定，色譜圖見圖1。表明苦參堿對(duì)照品及所制備的苦參堿二元醇質(zhì)體在該色譜條件下4 min 左右出峰，峰形穩(wěn)定，且空白醇質(zhì)體對(duì)苦參堿的測(cè)定無干擾。

圖1 3 種溶液的HPLC 圖譜

2.3 包封率的測(cè)定 量取苦參堿二元醇質(zhì)體0.5 mL 置于超濾離心管中，置于超速離心機(jī)中以12 000 r/min 離心20 min，離心完成后吸取下層清液0.1 mL 于10 mL 量瓶中，用流動(dòng)相定容搖勻后，按“2.2.1”項(xiàng)下條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算游離藥物質(zhì)量m游;精密吸取0.1 mL 醇質(zhì)體，甲醇破乳，0.22 μm 微孔濾膜濾過后進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算醇質(zhì)體中藥物總量m總，包封率(%) = (m總-m游)/m總×100%。

2.4 滲漏率的測(cè)定 測(cè)定苦參堿二元醇質(zhì)體制備完成首日的包封率后，在一定條件下保存一段時(shí)間后再測(cè)定其包封率，滲漏率(%) = (首日包封率-定期測(cè)定包封率)/首日包封率×100%。

2.5 正交試驗(yàn)優(yōu)化苦參堿二元醇質(zhì)體處方 通過考察單因素試驗(yàn)的結(jié)果，選擇對(duì)苦參堿二元醇質(zhì)體包封率影響較大的乙醇與丙二醇醇溶液總體積與醋酸鹽緩沖液的體積比(A)、苦參堿與卵磷脂質(zhì)量比(B)、乙醇與丙二醇的體積比(C)作為考察因素，每個(gè)因素取3 個(gè)水平，選L9(34)正交表進(jìn)行處方正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以包封率為篩選指標(biāo)，確定苦參堿二元醇質(zhì)體的最佳制備工藝?？疾煲蛩嘏c水平見表1，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。由表2 可知，可知對(duì)包封率的影響因素大小為B ＞A ＞C，A3B3C2為較優(yōu)處方。按照最佳處方制備3 組苦參堿二元醇質(zhì)體，可得包封率分別為65.38%、68.01%、67.56%，平均包封率為66.98%。

表1 L9(34)正交試驗(yàn)因素水平

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果(n=3)

2.6 苦參堿二元醇質(zhì)體的質(zhì)量控制研究

2.6.1 形態(tài)觀察 將苦參堿二元醇質(zhì)體樣品用30%乙醇溶液稀釋10 倍，取一定量的稀釋液，固定于銅絲網(wǎng)格上，用透射電子顯微鏡觀察，可見醇質(zhì)體為類球狀小囊泡，形態(tài)圓整。

圖2 苦參堿二元醇質(zhì)體在透射電子顯微鏡下的形態(tài)

2.6.2 粒徑 取苦參堿二元醇質(zhì)體適量，適當(dāng)稀釋后用動(dòng)態(tài)光散射儀測(cè)定其粒徑及分布，結(jié)果見圖3。結(jié)果顯示，較優(yōu)方案制備的苦參堿二元醇質(zhì)體平均粒徑為275.8 nm，聚合度為0.064，分布均勻。

圖3 苦參堿二元醇質(zhì)體粒徑分布圖(Gd 為醇質(zhì)體個(gè)數(shù)，Cd 為累積百分比)

2.7 初步穩(wěn)定性試驗(yàn)

2.7.1 滲漏率的測(cè)定 采用最佳制備工藝制備的苦參堿二元醇質(zhì)體3 批測(cè)得首日包封率后，于冰箱4 ℃保存7 d 后依照“2.4”項(xiàng)下的方法測(cè)定其滲漏率，平均首日包封率為67.12%，7 d 后平均包封率為66.58%，滲漏率為0.81%。

2.7.2 光照對(duì)穩(wěn)定性的影響 采用最佳制備工藝制備的苦參堿二元醇質(zhì)體3 批測(cè)得首日包封率后，于低溫光照儀4 ℃、4 500 Lx 照度條件下保存14、30 d 后測(cè)其滲漏率。首日包封率為68.11%，14 d 后包封率為64.48%，滲漏率為5.33%;30 d 后包封率為59.48%，滲漏率為12.67%。分別對(duì)制備當(dāng)天及光照條件下保存14 d 及30 d 后的醇質(zhì)體進(jìn)行形態(tài)觀察:制備當(dāng)天的苦參堿二元醇質(zhì)體為均勻同質(zhì)的乳白色溶液，光照下有藍(lán)色乳光。在4 ℃、4 500 Lx 照度條件下保存14 d，仍為均勻同質(zhì)的乳白色溶液，光照下有藍(lán)色乳光;30 d 后顏色不及剛制備時(shí)明亮，有少許沉淀，輕輕搖晃，可恢復(fù)原狀。

2.7.3 溫度對(duì)穩(wěn)定性的影響 測(cè)定采用最佳制備工藝制備的苦參堿二元醇質(zhì)體6 批的平均首日包封率，將其分為兩組分別置于低溫(4 ℃)及室溫(25 ℃)下避光保存30 d，兩組首日包封率分別為67.38%、67.12%，30 d 后包封率分別為65.33%、58.83%，滲漏率分別為2.58%、12.36%。分別對(duì)制備當(dāng)天及30 d 后的醇質(zhì)體進(jìn)行形態(tài)觀察:剛制備完成的苦參堿二元醇質(zhì)體為均勻同質(zhì)的乳白色溶液，光照下有藍(lán)色乳光。在4 ℃條件下避光放置30 d 后，無明顯變化;在室溫(25 ℃)條件下密封避光放置30 d 后，有少許沉淀產(chǎn)生，無明顯顏色變化，輕輕搖晃后可恢復(fù)原狀。

3 討論

采用醇注入法制備的苦參堿二元醇質(zhì)體為類球狀小囊泡，形態(tài)圓整，具有較高的包封率，平均粒徑為275.8 nm，聚合度為0.064，分布均勻。且實(shí)驗(yàn)設(shè)備操作簡(jiǎn)單，重現(xiàn)性好，安全性更佳。通過對(duì)苦參堿二元醇質(zhì)體處方的正交篩選結(jié)果可知，丙二醇的適當(dāng)加入可使醇質(zhì)體包封率增加，可能的原因是丙二醇分子滲入到磷脂膜材中降低了醇質(zhì)體雙分子層內(nèi)的流動(dòng)性，增加其親水性，使苦參堿藥物分子進(jìn)入其中而使包封率增加。但當(dāng)丙二醇的質(zhì)量分?jǐn)?shù)增大到一定程度時(shí)，磷脂膜柔性過大可以形成粒徑更小的醇質(zhì)體使內(nèi)水相減少，導(dǎo)致包封率降低［9］。另外，通過對(duì)醇質(zhì)體的初步穩(wěn)定性試驗(yàn)，確定了其貯存條件及存放時(shí)間，對(duì)保證制劑的質(zhì)量具有一定的實(shí)際意義。

醇質(zhì)體具有磷脂膜結(jié)構(gòu)，能夠很好地融合或者穿透皮膚細(xì)胞。其中含有的高體積分?jǐn)?shù)乙醇在一定程度上起到了促滲作用，提高藥物療效，但其也具有較大揮發(fā)性，穩(wěn)定性差，使藥物容易泄露，在一定程度上限制了其應(yīng)用。而丙二醇黏度較大，不易揮發(fā)，刺激性小，可改善揮發(fā)性及對(duì)皮膚的刺激性，增加醇質(zhì)體的穩(wěn)定性。同時(shí)，丙二醇作為透皮吸收促進(jìn)劑時(shí)，單獨(dú)應(yīng)用的效果不佳，而與其他促進(jìn)劑合用，可增加藥物及促進(jìn)劑的溶解度。丙二醇與乙醇合用，與普通醇質(zhì)體相比，既可產(chǎn)生顯著的促透協(xié)同作用，也可增加藥物的溶解度［10］。

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