吳文輝， 胡 麟， 馮 健， 李文兵， 胡昌江*

(1. 成都中醫(yī)藥大學(xué)，四川 成都610075;2. 四川新綠色藥業(yè)科技發(fā)展股份有限公司，四川 成都611930)

淫羊藿為小檗科植物淫羊藿Epimedium brevicornu Maxim.、箭葉淫羊藿Epimedium sagittatum (Sieb. et Zucc.)Maxim.、柔毛淫羊藿Epimedium pubescens. Maxim. 或朝鮮淫羊藿Epimedium koreanum Nakai 的干燥葉，味辛、甘，性溫，歸肝、腎經(jīng)，具有補(bǔ)腎陽(yáng)，祛風(fēng)除濕，強(qiáng)筋健骨之功效［1-2］。中醫(yī)臨床對(duì)淫羊藿的使用主要體現(xiàn)在生熟異用，分為生品和炙品:生品主要用于強(qiáng)筋骨，祛風(fēng)濕;炙品以羊脂油炙淫羊藿最為常用，主要功效也由強(qiáng)筋骨，祛風(fēng)濕轉(zhuǎn)為補(bǔ)腎陽(yáng)，用于陽(yáng)痿遺精，虛冷不育，尿頻失禁，腎虛喘咳等［3-4］。研究表明，加熱可使淫羊藿主要活性成分黃酮的量發(fā)生變化，即加熱使淫羊藿產(chǎn)生更多的易于吸收的具有生物活性的黃酮，如淫羊藿苷、寶藿苷Ⅰ;同時(shí)淫羊藿苷在體內(nèi)會(huì)水解成寶藿苷Ⅰ，而寶藿苷Ⅰ比淫羊藿苷更容易被吸收［5-8］。

維生素C (VC)又叫L-抗壞血酸，是一種水溶性維生素。主要功效為合成膠原蛋白，治療壞血病等，是腎上腺皮質(zhì)內(nèi)固醇合成時(shí)的重要物質(zhì)。腎上腺皮質(zhì)內(nèi)固醇合成時(shí)會(huì)不斷消耗VC，而當(dāng)腎上腺皮質(zhì)功能低下時(shí)會(huì)使大量VC在體內(nèi)聚集。現(xiàn)代研究表明下丘腦-垂體-性腺(hypothalamus-pituitary-gonadal axis，HPGA)和下丘腦是淫羊藿促性激素作用的重要途徑和靶器官，中醫(yī)臨床腎陽(yáng)虛患者下丘腦-垂體-腎上腺、性腺軸多表現(xiàn)為低下［9-11］。因此可以通過測(cè)定腎上腺中VC的量來評(píng)價(jià)腎上腺皮質(zhì)功能，作為評(píng)價(jià)藥物治療腎陽(yáng)虛的生理指標(biāo)之一［12-14］。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 昆明種小鼠，雄性，體質(zhì)量18 ～22 g。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK (川)2008-24，由成都達(dá)碩生物科技有限公司提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器 JY20002 電子天平(感量0.01 g，上海方瑞儀器有限公司);小型離心機(jī)FV-200 (北京中興偉業(yè)儀器有限公司);FA1204B 電子天平(感量0.000 1 g，上海精密儀器廠);控溫冰箱 (青島海爾電冰箱生產(chǎn)廠);UV1100H 型可見-紫外分光光度計(jì)(北京科豐恒業(yè)儀器儀表有限公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)用藥及試劑 氫化可的松注射液(規(guī)格為10 mg/2 mL，太極西南藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)121103);NaCl 注射液(規(guī)格為500 mL/瓶，四川科倫藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)M12120821);金匱腎氣丸(北京同仁堂科技發(fā)展股份有限公司制藥廠，批號(hào)12030713);維生素C 測(cè)定試劑盒(規(guī)格96T，北京冬歌博業(yè)生物科技有限公司，批號(hào)20130213);維生素C 對(duì)照品(規(guī)格100 mg/支，中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)100425-201103)。

1.4 實(shí)驗(yàn)藥物及制備

1.4.1 淫羊藿 購(gòu)于成都藥材市場(chǎng)，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院胡昌江教授鑒定為小檗科植物淫羊藿Epimedium brevicornu Maxim。

1.4.2 羊脂油炙淫羊藿 取羊脂油加熱熔化，加入淫羊藿絲，用文火炒至均勻有光澤，取出，放涼［15］。

1.4.3 試驗(yàn)藥物制備 取淫羊藿或炙淫羊藿適量，分別用10 倍量和8 倍量75%乙醇回流2 次，時(shí)間為1.5 h 和1 h，濾過，藥渣再分別用10 倍量和8 倍量水煎煮兩次，時(shí)間為1 h和0.5 h，濾過;合并75%乙醇提取液與水提液，濃縮。低劑量組濃縮至0.042 g 生藥/mL，中劑量組濃縮至0.084 g 生藥/mL，高劑量組濃縮至0.168 g 生藥/mL。

1.4.4 金匱腎氣丸 適量，搗碎，純凈水溶解，制備成質(zhì)量濃度為0.25 g/mL 的混懸液，使用過程中保持磁力攪拌混勻狀態(tài)［16］。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 分組及藥物劑量 取雄性小鼠240 只，按體質(zhì)量隨機(jī)搭配分成16 組:空白對(duì)照組，模型對(duì)照組，陽(yáng)性正常對(duì)照組，陽(yáng)性陽(yáng)虛對(duì)照組，生品正常低劑量組(0.83 g/kg)，生品正常中劑量組(1.67g/kg)，生品正常高劑量組(3.33 g/kg)，生品陽(yáng)虛低劑量組(0.83 g/kg)，生品陽(yáng)虛中劑量組(1.67g/kg)，生品陽(yáng)虛高劑量組(3.33 g/kg)，炙品正常低劑量組 (0.83 g/kg)，炙品正常中劑量組 (1.67 g/kg)，炙品正常高劑量組(3.33 g/kg)，炙品陽(yáng)虛低劑量組(0.83 g/kg)，炙品陽(yáng)虛中劑量組(1.67 g/kg)，炙品陽(yáng)虛高劑量組(3.33 g/kg)，每組15 只。除空白對(duì)照組和模型對(duì)照組給予等體積純凈水外，其余各組動(dòng)物均每日灌胃給藥0.4 mL/20 g 體質(zhì)量，連續(xù)16 d［17］。

2.2 腎陽(yáng)虛造模方法 預(yù)防給藥3 d，第4 天起每日給藥后60 min，模型組和金匱腎氣丸組動(dòng)物每天按25 mg/kg 體質(zhì)量臀部皮下注射氫化可的松注射液，正常組每天注射等體積的NaCl 注射液，連續(xù)注射7 d，停藥6 d［18-19］。

2.3 腎上腺中VC提取 最后一次灌胃1 h 后處死小鼠，取雙側(cè)腎上腺置玻璃黏膜勻漿器內(nèi)，精密加入0.5 mL 生理鹽水制備成黏膜勻漿，取0.15 mL 黏膜勻漿照試劑盒使用說明書分別加入試劑盒中1、2、3、4、5 號(hào)試劑進(jìn)行處理，制備成待測(cè)樣品。取空白玻璃試管，精密加入0.15 mL 生理鹽水同法制備成空白溶液。

2.4 VC測(cè)定方法 取VC對(duì)照品溶液(6 μg/mL)0.4 mL置于玻璃試管中，照上法制成對(duì)照品溶液。用紫外-可見分光光度計(jì)，在536 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定VC對(duì)照品管的吸光度值。

2.5 腎上腺中VC水平計(jì)算公式［17］腎上腺中VC水平=［(樣品A 值-空白A 值)/ (VC對(duì)照品A 值-空白A 值)×6 μg/mL×4 ×0.5］ /腎上腺質(zhì)量×100

2.6 腎上腺中VC水平降低率計(jì)算公式［17］腎上腺中VC水平降低率= (造模組腎上腺中VC水平-正常組腎上腺中VC水平)/ 造模組腎上腺中VC水平×100%

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)用Spss 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件處理，兩組間比較用Student T 檢驗(yàn)。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 對(duì)正常組腎上腺VC的影響 與正常組相比:陽(yáng)性組腎上腺中VC水平降低了10.71%，P ＜0.01 (P =0.005 2)，存在顯著差異;炙品正常高劑量組腎上腺中VC水平降低了7.01%，P ＜0.05 (P=0.047)，存在差異;其余各組均無表現(xiàn)出差異。結(jié)果見表1。

3.2 對(duì)腎陽(yáng)虛小鼠腎上腺VC的影響 與空白組相比，模型組腎上腺中VC水平升高了21.16%，P ＜0.01 (P =0.006 1)，存在顯著差異，成功復(fù)制出腎陽(yáng)虛模型。與模型組相比:陽(yáng)性組腎上腺中VC水平降低15.51%，P ＜0.01 (P=0.004 8)，存在顯著差異;生品陽(yáng)虛高劑量組腎上腺中VC水平降低了9.07%，P ＜0.05 (P =0.033)，存在差異;炙品陽(yáng)虛中劑量腎上腺中VC水平降低了7.12%，P ＜0.05 (P=0.048)，存在差異;炙品陽(yáng)虛高劑量組腎上腺中VC水平降低了13.94%，P ＜0.01 (P=0.005 2)，存在顯著差異。結(jié)果見表2。

表1 淫羊藿和炙淫羊藿對(duì)正常小鼠腎上腺VC 的影響(±s)

表1 淫羊藿和炙淫羊藿對(duì)正常小鼠腎上腺VC 的影響(±s)

注:陽(yáng)性組與空白組比較，##P ＜0.01;給藥組與空白組比較，* P ＜0.05

組別 動(dòng)物數(shù)/只劑量/(g 生藥·kg-1)腎上腺中VC/(μg·100 mg -1)降低率/%空白對(duì)照組 15 ― 306.44 ±32.94―陽(yáng)性正常對(duì)照組 15 5 273.62 ±29.54## 10.71生品正常低劑量組 15 0.83 307.58 ±25.66 ―生品正常中劑量組 15 1.67 302.93 ±41.15 1.15生品正常高劑量組 15 3.33 297.43 ±34.82 2.94炙品正常低劑量組 15 0.83 309.63 ±37.21 ―炙品正常中劑量組 15 1.67 298.28 ±39.61 2.66炙品正常高劑量組 15 3.33 284.97 ±28.57*7.01

表2 淫羊藿和炙淫羊藿對(duì)腎陽(yáng)虛小鼠腎上腺VC 的影響(±s)

表2 淫羊藿和炙淫羊藿對(duì)腎陽(yáng)虛小鼠腎上腺VC 的影響(±s)

注:與空白組比較，## P ＜0.01;給藥組與模型組比較，* P ＜0.05

組別 動(dòng)物數(shù)/只劑量/(g 生藥·kg-1)腎上腺中VC/(μg·100 mg -1)降低率/%空白對(duì)照組 15 ― 306.44 ±32.94―模型對(duì)照組 15 ― 371.29 ±24.32## ―陽(yáng)性陽(yáng)虛對(duì)照組 15 5 313.71 ±27.66＊＊15.51生品陽(yáng)虛低劑量組 15 0.83 369.73 ±38.51 0.42生品陽(yáng)虛中劑量組 15 1.67 357.28 ±29.49 3.77生品陽(yáng)虛高劑量組 15 3.33 337.69 ±38.24* 9.07炙品陽(yáng)虛低劑量組 15 0.83 372.78 ±30.44 ―炙品陽(yáng)虛中劑量組 15 1.67 344.85 ±38.87* 7.12炙品陽(yáng)虛高劑量組 15 3.33 319.52 ±40.63＊＊13.94

4 討論

4.1 由表1 可以看出，陽(yáng)性對(duì)照藥物金匱腎氣丸能顯著地影響腎上腺皮質(zhì)內(nèi)固醇合成，增加其對(duì)生物VC的利用度。炙品高劑量組對(duì)正常小鼠腎上腺VC的水平也能起到降低的作用，說明淫羊藿經(jīng)過羊脂油炮制以后，并且在大劑量下也可以增強(qiáng)腎上腺皮質(zhì)的功能，增強(qiáng)其內(nèi)固醇的合成。

4.2 由表2 可以看出，采用氫化可的松復(fù)制小鼠腎陽(yáng)虛模型，腎陽(yáng)虛小鼠腎上腺中VC水平顯著高于正常組，說明腎陽(yáng)虛小鼠腎上腺皮質(zhì)功能顯著下降，基本符合中醫(yī)腎陽(yáng)虛概念;溫補(bǔ)腎陽(yáng)藥“金匱腎氣丸”能顯著降低腎陽(yáng)虛小鼠的腎上腺中VC的水平，提高腎陽(yáng)虛小鼠的腎上腺皮質(zhì)功能，可作為此實(shí)驗(yàn)的陽(yáng)性對(duì)照藥物;在淫羊藿生品的各組中，只有在高劑量(3.33 g/kg)作用下對(duì)腎陽(yáng)虛小鼠的腎上腺VC有降低作用，說明淫羊藿其本身應(yīng)該具有提高腎上腺皮質(zhì)內(nèi)固醇合成的功效。經(jīng)過羊脂油炮制以后，其起效劑量降低，在中劑量(1.67 g/kg)時(shí)開始表現(xiàn)出差異，當(dāng)用藥劑量達(dá)到高劑量時(shí)(3.33 g/kg)表現(xiàn)出明顯的差異。說明淫羊藿經(jīng)過羊脂油炮制以后有助于增強(qiáng)氫化可的松所致小鼠的腎上腺皮質(zhì)內(nèi)固醇的合成，且隨劑量增高治療作用越明顯。

［1］ 國(guó)家藥典委員會(huì). 中華人民共和國(guó)藥典:2010 年版一部［S］. 北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010:306-308.

［2］ 張華峰，楊曉華. 淫羊藿的生物活性成分及其開發(fā)策略研究［J］. 中草藥，2010，41(2):329-332.

［3］ 中國(guó)中醫(yī)研究院中藥研究所. 歷代中藥炮制資料輯要［M］. 北京:內(nèi)部出版，1973.

［4］ 龔千鋒. 中藥炮制學(xué)［M］. 北京:中國(guó)中醫(yī)藥出版社，2003:228.

［5］ 錢 淺，孫 娥，樊宏偉，等. 羊脂油對(duì)淫羊藿炮制品提取物中寶藿苷I 在大鼠體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)特征的影響［J］. 中草藥，2012，10(43):1981-1985.

［6］ 崔 麗，孫 娥，錢 淺，等. 淫羊藿生品及不同炮制品小鼠藥代動(dòng)力學(xué)特征的比較研究［J］. 中國(guó)中藥雜志，2013，38(10):1614-1617.

［7］ 金曉勇，賈曉斌，孫 娥，等. 炙淫羊藿炮制過程中5 種黃酮類成分變化規(guī)律研究［J］中國(guó)中藥雜志，2009，34(21):2738.

［8］ Li H F，Guan X Y，Ye M，et al. Qualitative and quantitative analyses of Epimedium wushanense by high-performance liquidchromatography coupled with diode array detection and electrospray ionization tandem mass spectrometry［J］. J Sep Sci，2011，34(12):1437-1446.

［9］ 吳 瑕，楊 薇，張 磊，等. 下丘腦-垂體-性腺軸阻斷對(duì)淫羊藿促性激素作用的影響［J］. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2011，17(5):161-164.

［10］ 劉忠平，李質(zhì)馨，李守遠(yuǎn)，等. 淫羊藿對(duì)生殖系統(tǒng)影響的研究進(jìn)展［J］. 中國(guó)婦幼保健，2013，28(5):884-886.

［11］ 曾慶岳，王云山. 淫羊藿藥理作用研究進(jìn)展［J］. 醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2012，4(31):462-465.

［12］ 李儀奎. 中藥藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)［M］. 上海:上?？萍汲霭嫔纾?006:597.

［13］ 石 晶，桌海通，孫維林. 用HPLC 法測(cè)定不同皮質(zhì)功能狀態(tài)時(shí)小鼠腎上腺的Vit C 含量［J］. 中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，1990，6(6):389-391.

［14］ 謝惠民. 維生素知識(shí)［M］. 北京:人民衛(wèi)生出版社，1985:60.

［15］ 周一帆，胡昌江，余凌英. 星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)選淫羊藿油炙工藝［J］. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2012，18(16):16-18.

［16］ 李春生，張國(guó)璽，石體仁，等. 山茱萸水溶性總提取物對(duì)腎陽(yáng)虛動(dòng)物模型生命質(zhì)量和腎上腺組織的影響［J］. 中醫(yī)雜志，2001，42(8):491-493.

［17］ 劉俊達(dá)，韭菜子鹽炙前后溫補(bǔ)腎陽(yáng)的機(jī)理研究［D］. 成都:成都中醫(yī)藥大學(xué)，2011:37.

［18］ 張永祥. 中藥藥理學(xué)新論［M］. 北京:人民衛(wèi)生出版社，2004:427.

［19］ 陳小野. 實(shí)用中醫(yī)證候動(dòng)物模型學(xué)［M］. 北京:北京醫(yī)科大學(xué)/中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)聯(lián)合出版社，1993:101-117.