劉亭亭， 張德芹， 王 萌* ， 金秀麗

(1. 天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津市現(xiàn)代重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室-省部共建國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，天津300193;2. 天津國際生物醫(yī)藥聯(lián)合研究院，天津300457;3. 現(xiàn)代中藥發(fā)現(xiàn)與制劑技術(shù)教育部工程研究中心，天津300193)

三葉片是由張伯禮院士主持研制的治療二型糖尿病的中藥新藥，由桑葉、荷葉、山楂葉等五味藥材組成。中藥復(fù)方是通過組方藥材及其中多種成分的共同或協(xié)調(diào)作用起效的，具有多成分、多靶點(diǎn)的作用特點(diǎn)。藥物的溶出是固體藥物吸收的前提條件，藥物吸收又是口服藥物發(fā)揮全身作用的第一步。研究和考察復(fù)方中藥，特別是復(fù)方中藥口服制劑的體外溶出特征應(yīng)遵循其作用特點(diǎn)，選取藥物中多個具有代表性的藥效活性成分進(jìn)行研究。以多種代表性成分為指標(biāo)，對中藥復(fù)方口服制劑體外溶出特征進(jìn)行研究是反映其體內(nèi)吸收情況，表征和衡量中藥復(fù)方制劑藥效和質(zhì)量的重要手段之一。

針對三葉片用于糖尿病早期糖耐量低及糖脂代謝紊亂的療效，本研究查閱文獻(xiàn)篩選制劑中具有降糖和降脂藥效活性報(bào)道的主要成分，并綜合考慮制劑中成分含有量因素，確定選取蘆丁［1-4］、荷葉堿［5-6］、金絲桃苷［7-8］、芍藥苷［9-11］等成分作為三葉片體外溶出度研究指標(biāo)成分。

本研究以UPLC 作為研究分析手段，選取多種藥效活性成分為指標(biāo)，建立專屬性強(qiáng)、快速、高效的三葉片中多指標(biāo)性成分UPLC 同時定量測定的方法。并以此進(jìn)行中藥復(fù)方制劑三葉片體外溶出研究，以期較為真實(shí)的對復(fù)方中藥口服制劑中多種成分的復(fù)雜體內(nèi)吸收過程進(jìn)行預(yù)判。在此過程中，對各成分溶出特征同步性進(jìn)行考察，從而在一定程度上反映多成分體內(nèi)吸收過程和藥效作用過程中的相互作用，從溶出角度詮釋中藥復(fù)方口服制劑配伍機(jī)制和復(fù)方中藥口服制劑中多成分的協(xié)同作用。

1 材料

H class 超高效液相色譜儀 (美國Waters);CH-4123 溶出儀(瑞士Sotax 公司);Milli-Q 超純水儀(美國Millipore 公司);H1650-W 離心機(jī)(長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司);HHS 型電熱恒溫水浴鍋(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)。

三葉片(由天津中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院制得);芍藥苷、蘆丁、荷葉堿對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號分別為110736-101035，100080-200707，111566-200703)，金絲桃苷對照品(中新藥業(yè)，批號2013.5.14);乙腈(CHROMASOLV，色譜純);甲酸(天津市大茂化學(xué)試劑廠，色譜純);無水乙醇(天津市大茂化學(xué)試劑廠，分析純)。

2 方法與結(jié)果

2.1 成分測定

2.1.1 色譜條件 Waters BEH RP C18色譜柱(2.1 mm × 100 mm，1.7 μm)，流動相為乙腈(A) -0.3%甲酸水(B)，梯度洗脫(0 ～4 min，13%A;4 ～5 min，13% ～15% A;5 ～10 min，15%A;10 ～10.5 min，15% ～16% A;10.5 ～16 min，16%A);體積流量0.3 mL/min;柱溫35 ℃;檢測波長0 ～12 min，225 nm;12 ～16 min，360 nm。

2.1.2 對照品溶液的制備 分別精密稱取芍藥苷、荷葉堿、蘆丁、金絲桃苷對照品適量，加30%乙醇制成每1 mL 含芍藥苷、荷葉堿、蘆丁、金絲桃苷分別為103.5、28.3、5.062 5、20.25 μg 的混合對照品溶液。

2.1.3 供試品溶液的制備 取三葉片一粒，照《中國藥典》2010 年版二部附錄XC［12］溶出度測定法槳法，以500 mL 經(jīng)脫氣處理的純水為溶出介質(zhì)，轉(zhuǎn)速120 r/min，4 h 時取出溶出液適量，10 000 r/min下離心5 min，取上清液進(jìn)樣。

上述色譜條件下測定芍藥苷，荷葉堿，蘆丁，金絲桃苷對照品和供試品的色譜圖如圖1 所示，由圖可知三葉片中4 種指標(biāo)成分分離良好，且其他成分及雜質(zhì)不干擾其測定。

圖1 UPLC 色譜圖Fig.1 UPLC chromatograms

2.1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 將“2.1.2”項(xiàng)下的對照品混合溶液依次精密稀釋成系列混合對照品溶液，10 000 r/min 離心5 min，注入超高效液相色譜儀，按“2.1.1”項(xiàng)下的色譜條件測定峰面積，以峰面積為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，質(zhì)量繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程、r 值及線性范圍見表1，結(jié)果表明各成分在以下線性范圍內(nèi)線性良好。

表1 線性關(guān)系考察Tab.1 Linear corelation

2.1.5 精密度試驗(yàn) 將供試品溶液重復(fù)進(jìn)樣6 次，按方法測定計(jì)算峰面積，芍藥苷、荷葉堿、蘆丁、金絲桃苷峰面積的RSD 值分別為0.5%、2.3%、0.2%、0.3%，符合溶出度試驗(yàn)要求。

2.1.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 將供試品溶液分別于2、4、8、12、18、24 h 進(jìn)樣，記錄各考察成分峰面積，芍藥苷、荷葉堿、蘆丁、金絲桃苷峰面積的RSD值分別為1.2%、2.9%、1.8%、1.1%，表明樣品在24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批三葉片，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備6 份供試品溶液，依次進(jìn)樣，記錄各考察成分峰面積，芍藥苷、荷葉堿、蘆丁、金絲桃苷的重復(fù)性考察結(jié)果RSD 值分別為1.6%、4.3%、0.8%、1.8%，表明方法重復(fù)性良好。

2.1.8 加樣回收試驗(yàn) 精密稱定80 目三葉片細(xì)粉6 份，置于50 mL 錐形瓶中，各精密加入與三葉片細(xì)粉中芍藥苷，荷葉堿，蘆丁，金絲桃苷質(zhì)量相等的對照品溶液，加入適量30%乙醇溶液至20 mL，超聲處理2 h 取出放至室溫，10 000 r/min 下離心5 min，按方法測定計(jì)算峰面積，計(jì)算加樣回收率。測得芍藥苷、荷葉堿、蘆丁、金絲桃苷的平均回收率分別為 96.3%、101.4%、100.6%、100.5%，RSD 分 別 為 0.5%、0.7%、2.0%、2.4%。表明方法準(zhǔn)確度良好。

2.2 溶出度的測定

2.2.1 溶出條件的篩選 分別考察pH 7.2、pH 6.8、pH 4.5 磷酸鹽緩沖溶液，超純水，0.1 mol/L鹽酸，30%乙醇等溶出介質(zhì)中三葉片4 種藥效成分的溶出度，通過比較芍藥苷、荷葉堿、蘆丁、金絲桃苷的溶出量，以30%乙醇為溶出介質(zhì)時各成分的溶出量最大，其他溶出介質(zhì)稍小，但溶出百分率均在70%以上，選擇超純水作為溶出介質(zhì)。另外轉(zhuǎn)速對溶出度也有一定的影響，以水為溶出介質(zhì)對比100 r/min 和120 r/min 下的溶出情況，溶出量差別不大，120 r/min 時重復(fù)性更好，故將轉(zhuǎn)速定為120 r/min。

2.2.2 三葉片溶出曲線的繪制 根據(jù)《中國藥典》2010 年版二部附錄XC 溶出度測定法，選用第二法槳法進(jìn)行三葉片溶出度研究。取三葉片6片，以經(jīng)脫氣處理后的超純水500 mL 為溶出介質(zhì)，轉(zhuǎn)速為120 r/min，溫度(37 ±0.5)℃，依法測定，不同時間點(diǎn)取樣1 mL，經(jīng)10 000 r/min 離心5 min，每次取樣后補(bǔ)加同體積同溫度的溶出介質(zhì)，UPLC測定樣品中芍藥苷、荷葉堿、蘆丁、金絲桃苷的量，計(jì)算各時間點(diǎn)藥效成分的平均累積溶出百分率和標(biāo)準(zhǔn)差，繪制溶出曲線 (含誤差線)結(jié)果見圖2。

圖2 三葉片各成分平均累積溶出百分率Fig.2 Average cumulative dissolution rates foreach component of Sanye Tablets

2.2.3 相似因子法(f2)比較三葉片中4 種活性成分溶出曲線一致性 比較兩條釋放曲線差異的方法有很多，其中f2相似因子法是一種較好的區(qū)分釋放度差異的方法。這種比較釋放度差異的方法已被美國FDA 的“藥物評價與研究中心”采納，推薦為比較兩條溶出曲線的首選方法［13-14］，認(rèn)為f2值在50 ～100 時兩條釋放曲線相似，本實(shí)驗(yàn)采用f2值比較三葉片中4 種有效成分溶出曲線的差異。計(jì)算的公式如下:

式中Rt為對照成分t 時間的累積溶出率;Tt為試驗(yàn)成分t 時間的累積溶出率;n 為溶出度實(shí)驗(yàn)的取樣次數(shù)。

以荷葉堿的溶出曲線為參比，芍藥苷、蘆丁、金絲桃苷f2值分別為50.84、58.37、55.04。4 條溶出曲線相比f2均大于50 表明運(yùn)用相似因子法比較中藥口服制劑三葉片中4 種成分的釋放特征，該4 種活性成分溶出具有一定的同步性。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)采用分析速度快、高峰容量和高靈敏度的超高效液相色譜技術(shù)，大大降低了復(fù)雜的中藥復(fù)方口服制劑分析時間，整個分析時間在16 min 內(nèi)完成，經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證，測定結(jié)果準(zhǔn)確，具有良好的重復(fù)性，可用于三葉片多種成分體外溶出度的分析測定，為體外判斷三葉片體內(nèi)吸收情況提供科學(xué)、可靠的依據(jù)。同時，該分析方法靈敏、高效，對制劑中不同極性成分具有一定的覆蓋能力，也可以直接用于三葉片制劑中相關(guān)成分的質(zhì)量控制。

溶出度研究結(jié)果表明三葉片中的4 種活性成分的溶出進(jìn)程較為統(tǒng)一，在5 h 之內(nèi)累積釋放度均達(dá)到了70%以上，基本能夠表現(xiàn)出一致的釋放行為特征，從溶出度角度在一定程度上說明了4 種活性成分可能在體內(nèi)同時發(fā)揮藥效，起到協(xié)同增效的作用。三葉片臨床試驗(yàn)中體內(nèi)過程研究發(fā)現(xiàn)，對比每日服藥3 次與每日服藥兩次受試者的血藥濃度和達(dá)峰時間，每日服藥3 次的受試者血藥濃度更穩(wěn)定，與本研究體外溶出試驗(yàn)結(jié)果較為一致。說明本實(shí)驗(yàn)建立中藥口服藥物多成分體外溶出模型能夠較為真實(shí)地反映出三葉片主要藥效成分的體內(nèi)吸收特征，與體內(nèi)試驗(yàn)結(jié)果具有一定的相關(guān)性。

選取的4 種成分均為每一種組方中藥中具有降脂降糖活性的代表性成分，然而三葉片中還含有另一部分極性較低的成分，同樣具有較好的藥效活性，如槲皮素和丹參酮ⅡA。本實(shí)驗(yàn)也對其溶出情況進(jìn)行了考察，但因二者極性較小，在水介質(zhì)中溶出極少，低于本研究UPLC 檢測方法的檢測限，這類成分具體吸收和藥效情況還有待于進(jìn)行進(jìn)一步的體內(nèi)過程研究。

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