沈 熊， 許根英， 董 穎， 梁 健， 呂遷洲 ， 許 青

(復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院藥劑科，上海200032)

漢黃芩素(wogonin，Wo)是從唇形科植物黃芩Scutellaria baicalensis Georgi、半枝蓮Scutellaria barbata D. Don 以及夾竹桃科植物鱔藤Anodendron affine (Hook. et Arn)Druce 等植物中分離或者通過(guò)合成得到的黃酮類化合物［1］，具有抗炎、抗腫瘤等廣泛的治療作用［1-4］。同很多黃酮類化合物一樣，漢黃芩素存在水溶性差、吸收后易被代謝等缺陷［5-6］。文獻(xiàn)報(bào)道將漢黃芩素制成脂質(zhì)體［7］、固體脂質(zhì)納米粒［8］、白蛋白微球等［9］可以達(dá)到緩釋、靶向給藥、提高生物利用度等效果。同時(shí)也報(bào)道了血漿對(duì)漢黃芩素脂質(zhì)體的穩(wěn)定性有一定影響，血漿中的調(diào)理素等成分可能影響脂質(zhì)體的緩釋效果［7］。因此，選擇適當(dāng)?shù)妮d體制備漢黃芩素納米粒，在保留緩釋的基礎(chǔ)上增加長(zhǎng)循環(huán)特性，提高藥物穩(wěn)定性，以提高藥物吸收和生物利用度［10-11］，有助于漢黃芩素的開(kāi)發(fā)利用。

乳酸-羥基乙酸共聚物［poly (lactic-co-glycolic acid)，PLGA］是一類可生物降解的高分子材料，具有良好的生物相容性和體內(nèi)安全性，已被美國(guó)FDA 錄用為藥用輔料，被廣泛用做納米載藥系統(tǒng)的載體。在PLGA 納米粒表面修飾親水性材料，如聚乙二醇(PEG)、聚氧乙烯(PEO)等，可以提高其親水性，靜脈注射給藥后可以降低被血漿中酶系統(tǒng)降解的程度，且不易被單核吞噬細(xì)胞系統(tǒng)識(shí)別吞噬，延長(zhǎng)藥物的體內(nèi)循環(huán)時(shí)間，提高生物利用度［12］。

本實(shí)驗(yàn)以單甲氧基聚乙二醇-聚乳酸-羥基乙酸共聚物(mPEG-PLGA)為載體，采用溶劑擴(kuò)散法制備載漢黃芩素的納米粒(Wo-mPEG-PLGA NPs)，考察其形態(tài)、載藥性能、血清穩(wěn)定性和體外釋放行為等指標(biāo)。

1 儀器與材料

Agilent 1200 高效液相色譜儀(美國(guó)Agilent 公司);Zetasizer Nano ZS 納米粒度及Zeta 電位分析儀(英國(guó)Malvern 公司);JY 92-II DN 超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司);Eppendorf 5430 R 小型臺(tái)式高速離心機(jī)［艾本德(上海)國(guó)際貿(mào)易有限公司］;VOS-90AG 真空干燥箱［施都凱儀器設(shè)備 (上海)有限公司］;Tecnai G220 透射電子顯微鏡 (荷蘭 FEI 公司);UV760CRT 雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(日本島津);SHZ-B 型恒溫水浴振蕩器(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠)。

漢黃芩素原料藥(上海同田生物技術(shù)有限公司，純度≥98.5%，批號(hào)20121210);漢黃芩素對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)110773—201011);單甲氧基聚乙二醇-聚乳酸-羥基乙酸共聚物(mPEG-PLGA，mPEG 相對(duì)分子質(zhì)量為2 000，PLGA，相對(duì)分子質(zhì)量為30 000，LA ∶GA =75 ∶25，濟(jì)南岱罡生物科技有限公司);胎牛血清(美國(guó)Sigma 公司);泊洛沙姆188 (Pluronic F-68，德國(guó)BASF 公司);甲醇為色譜純，水為雙蒸水，其他試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 納米粒的制備 采用溶劑擴(kuò)散法制備納米粒，室溫下精密稱取2.5 mg 漢黃芩素和50 mg mPEGPLGA 溶解于2.5 mL 丙酮作為有機(jī)相，磁力攪拌下注入到25 mL 含有0.5% (m/V)Pluronic F-68的水相中，加完后超聲45 s (輸出功率200 W)，繼續(xù)攪拌20 min，60 ℃磁力攪拌下除去有機(jī)溶劑，0.45 μm 微孔濾膜濾過(guò)，低溫超速離心(21 000×g，45 min，4 ℃)，棄去上清液，收集納米粒，加10 mL 水分散后再次離心，如此重復(fù)2 次，取納米粒減壓干燥(-0.08 MPa，50 ℃)，即得漢黃芩素納米粒，稱定質(zhì)量，記為mNP。取該納米粒約20 mg，精密稱定，置10 mL 量瓶中，加適量水超聲分散，加水稀釋至刻度，搖勻，記為“漢黃芩素納米混懸液A”。

2.2 納米粒的表征

2.2.1 掃描電鏡(SEM)觀察 取1 ～2 滴漢黃芩素納米混懸液A 滴于銅網(wǎng)上，用1.0%磷鎢酸溶液染色，室溫晾干后置透射電鏡下觀察，可見(jiàn)所得Wo-mPEG-PLGA NPs 呈球形，表面較光滑，大小均勻，分散性好，粒徑約100 nm。

2.2.2 粒徑及ζ電位 取漢黃芩素納米混懸液A 加水稀釋5 倍，用粒度儀測(cè)定粒徑和ζ電位。測(cè)得Wo-mPEG-PLGA NPs 的平均粒徑為 (112 ± 33)nm，ζ電位為(-23.71 ±2.95)mV (n=3)。

2.2.3 血清穩(wěn)定性 按文獻(xiàn)方法［13］，取1 mL 漢黃芩素納米混懸液A 與等體積50% 胎牛血清混合均勻，于37 ℃孵育24 h，取樣，于檢測(cè)波長(zhǎng)750 nm，以50%胎牛血清透光率(T%)為100%，測(cè)得孵育后的溶液透光率為(99.02 ±0.27)% (n =3)，未見(jiàn)納米粒凝聚現(xiàn)象，說(shuō)明37 ℃下24 h 內(nèi)納米粒在血清中保持穩(wěn)定。

2.3 Wo-mPEG-PLGA NPs 載藥量的測(cè)定

2.3.1 HPLC 條件和方法學(xué)驗(yàn)證 按文獻(xiàn)方法［7，14］，采用HPLC 法測(cè)定Wo-PLGA NPs 的載藥量。Luna C18色譜柱(150 mm ×4.6 mm，5 μm，美國(guó)菲羅門公司);流動(dòng)相為甲醇-水-三氟乙酸(60 ∶40 ∶0.05);體積流量1 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)275 nm;柱溫30 ℃;進(jìn)樣量20 μL。

取漢黃芩素約10 mg，精密稱定。加適量甲醇溶解，并稀釋至 25 mL，制成質(zhì)量濃度為400 μg/mL的貯備液，用流動(dòng)相稀釋成質(zhì)量濃度為0.1 ～5.0 μg/mL 的系列漢黃芩素對(duì)照品溶液，按上述方法進(jìn)樣分析，以峰面積對(duì)漢黃芩素質(zhì)量濃度做線性回歸，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果顯示漢黃芩素在此質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程為:A=4.68 ×103+3.12 ×105C (r=0.999 8)，其中A為漢黃芩素色譜峰的峰面積，C 為對(duì)照品質(zhì)量濃度(μg/mL)。以漢黃芩素峰面積計(jì)，低、中、高3 種質(zhì)量濃度對(duì)照品溶液(0.2、2.5、5.0 μg/mL)的日內(nèi)和日間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差 (RSD)均小于2%(n=5);方法回收率分別為 (99.21 ±1.62)%、(101.67 ±1.76)% 和(100.45 ±1.20)%，方法的準(zhǔn)確性良好。

2.3.2 載藥量的測(cè)定 取“2.1”項(xiàng)下制得納米粒10 mg，精密稱定，加入2 mL 乙腈-水(9 ∶1)溶解載體材料使?jié)h黃芩素釋放出，轉(zhuǎn)移至10 mL 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，精密吸取1 mL轉(zhuǎn)移至10 mL 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，以0.45 μm 微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，按“2.3.1”項(xiàng)下方法進(jìn)樣，測(cè)定漢黃芩素量，記為mE，即納米粒包封的漢黃芩素量，根據(jù)下列公式計(jì)算載藥量(Drug Loading，DL):

其中，mNP為測(cè)定取用的納米粒的質(zhì)量(10 mg)，得納米粒的平均載藥量為(3.27 ±0.04)%(n=3)。

2.4 Wo-mPEG-PLGA NPs 的體外釋放試驗(yàn) 采用透析法考察納米粒的體外釋藥。按“2.1”項(xiàng)下方法制備，得納米粒約42.7 mg，精密稱定，加適量水超聲分散，轉(zhuǎn)移至10 mL 量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，得每1 mL 約含140 μg 漢黃芩素的混懸液，記為“漢黃芩素納米混懸液B”。

精密吸取0.5 mL 漢黃芩素納米混懸液B，加入1 mL磷酸鹽緩沖液(0.05 mol/L，pH 7.4，以下簡(jiǎn)稱PBS)，混合均勻，置透析袋(截留分子質(zhì)量15 000)中，兩端扎緊，置50 mL PBS 中，(37 ±0.5)℃下恒溫水浴中水平振蕩(100 次/min，振幅20 mm)，定時(shí)取透析外液，同時(shí)補(bǔ)充等量等溫的PBS 至釋放介質(zhì)，將取出的溶液離心后按“2.3.1”項(xiàng)下條件測(cè)定，計(jì)算漢黃芩素量和累積釋放率。

精密吸取0.5 mL 漢黃芩素納米混懸液B，加入1 mL血漿，漩渦混勻，置透析袋中，同法測(cè)定累積釋放率，考察血漿對(duì)納米粒釋放的影響。

取漢黃芩素原藥約5 mg，精密稱定，加適量助溶劑溶解于水中，制成約為140 μg/mL 的混懸液，同法考察累積釋放率，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 體外釋放曲線(n=6)Fig.1 Profile for in vitro release (n=6)

結(jié)果可見(jiàn)，漢黃芩素溶液從透析袋中迅速釋放，在4 h 內(nèi)釋放完全。分散于PBS 的Wo-mPEGPLGA NPs 在0 ～3 h 釋藥較快，3 h 至12 h 釋放減慢，12 h 以后逐漸趨于平緩，24 h 累積釋放率約為39%，說(shuō)明Wo-mPEG-PLGA NPs 具有緩釋效應(yīng)。納米粒先與血漿混合后，其釋放曲線與納米粒分散于PBS 中的釋放行為類似，在0 ～3 h 的各時(shí)間點(diǎn)基本重疊，3 ～12 h 的釋放度略高于前者，24 h 時(shí)累積釋放率約為42%，說(shuō)明血漿對(duì)納米粒的釋放度影響不明顯。

3 討論

本研究用以mPEG-PLGA 為載體材料，采用溶劑擴(kuò)散法制備了載漢黃芩素的納米粒，表征納米粒，并考察其體外釋放特性。

納米粒溶液在血清中的凝聚特性是其穩(wěn)定性的重要指標(biāo)［13］。本研究采用納米混懸液在50%胎牛血清中孵育后測(cè)定透光率(T%)的方法考察其穩(wěn)定性。因?yàn)橥腹饴?T%)的范圍為0 ～100%，便于直觀比較，所以采用測(cè)定透光率(T%)而不是吸收度(A)的方法。以50%胎牛血清透光率為100%，納米溶液孵育24 h 后透光率為(99.02 ±0.27)% (n =3)，可見(jiàn)納米溶液在血清中凝聚程度輕微，穩(wěn)定性良好。

體外釋放度試驗(yàn)結(jié)果表明，漢黃芩素原藥在4 h內(nèi)釋放完全，這與文獻(xiàn)報(bào)道一致［7］。而WomPEG-PLGA NPs 在4 h 時(shí)的釋放度約為21%，呈現(xiàn)明顯的緩釋效果。納米粒分散于血漿后進(jìn)行的釋放試驗(yàn)表明，血漿對(duì)納米粒的釋放影響不明顯，其釋放行為與納米粒分散于PBS 基本一致。結(jié)合穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果推測(cè)，以mPEG-PLGA 為載體制備漢黃芩素納米?？梢詼p少血漿調(diào)理素的影響，從而具備長(zhǎng)循環(huán)的特性［15］。接下來(lái)可進(jìn)行體內(nèi)試驗(yàn)來(lái)進(jìn)一步驗(yàn)證其緩釋和長(zhǎng)循環(huán)的特性，為漢黃芩素的新劑型研發(fā)提供幫助。

［1］ 任曉東，符 偉，張曉蕓，等. 天然產(chǎn)物漢黃芩素的研究進(jìn)展［J］. 中國(guó)新藥雜志，2011，20(9):777-784.

［2］ 彭苗新，張海偉，陳寶安. 漢黃芩素抗腫瘤作用的分子機(jī)制中的主要信號(hào)通路［J］. 中國(guó)天然藥物，2012，10(6):401-407.

［3］ 陳慧慧，張 敏，虞慧娟，等. 柴胡和黃芩配伍解熱抗炎作用研究［J］. 中成藥，2011，33(9):1596-1598.

［4］ 嚴(yán)靜怡，陳寶安. 漢黃芩素的提取及抗腫瘤的作用機(jī)制［J］. 時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2012，23(9):2210-2212.

［5］ 王勝鵬，申?yáng)|艷，李 鵬，等. 抗腫瘤中藥新型藥物傳遞系統(tǒng)的研究(一)——清熱解毒類中藥［J］. 世界科學(xué)技術(shù)-中醫(yī)藥現(xiàn)代化，2012，14(6):2131-2135.

［6］ 謝利霞，周 娟，柳 茜，等. 漢黃芩素在FVB 小鼠體內(nèi)的磺酸化代謝特征研究［J］. 世界臨床藥物，2012，33(7):406-411.

［7］ 柯 學(xué)，許 穎，嚴(yán) 菲，等. 漢黃芩素脂質(zhì)體的制備及大鼠體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)［J］. 中國(guó)藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，38(6):502-506.

［8］ 陳永順，甘春英. 漢黃芩素固體脂質(zhì)納米粒的制備及體外釋放度考察［J］. 中國(guó)藥師，2012，15(3):302-305.

［9］ 陳永順，姜華軍，李志榮. 漢黃芩素白蛋白微球的制備及其體外釋放［J］. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2012，18(6):32-35.

［10］ 桂 卉，范學(xué)工. 控釋納米粒的研究進(jìn)展［J］. 中成藥，2004，26(11):938-940.

［11］ 曾 莉，毛春芹，陸兔林，等. 川芎嗪聚乳酸納米粒的制備和質(zhì)量研究［J］. 中成藥，2013，35(2):261-263.

［12］ 蘇麗娜，孔艷娥，劉光明，等. 載長(zhǎng)春西汀聚乙二醇-聚乳酸納米粒的制備及其大鼠體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)［J］. 中國(guó)醫(yī)藥工業(yè)雜志，2013，44(5):465-470.

［13］ Kuai R，Yuan W M，Li W Y，et al. Targeted delivery of cargoes into a murine solid tumor by a cell-penetrating peptide and cleavable poly (ethylene glycol)comodified liposomal delivery system via systemic administration［J］. Mol Pharmaceut，2011，8(6):2151-2161.

［14］ 周逸芝，劉訓(xùn)紅，許 虎，等. HPLC 法同時(shí)測(cè)定龍柴方及其組方藥材黃芩中4 種黃酮［J］. 中成藥，2013，35(5):978-981.

［15］ 趙國(guó)巍，陳緒龍，廖正根，等. 三七皂苷長(zhǎng)循環(huán)納米粒制備及其體外溶出行為［J］. 中國(guó)醫(yī)藥藥學(xué)雜志，2011，31(16):1329-1333.