孫忠華，肖建輝，遲 強(qiáng)，范成路，徐珺陽(yáng)，林志平

1中國(guó)人民解放軍第215 醫(yī)院全軍心理衛(wèi)生中心睡眠調(diào)整中心，大連 116041;2遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院貴州省細(xì)胞工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遵義 563003

蟲草屬真菌是我國(guó)的一種傳統(tǒng)中藥材，屬于大型真菌類，在我國(guó)很多地區(qū)都有分布，其中以冬蟲夏草(Cordeceps sinensis)最為名貴。然而由于天然蟲草資源緊缺，且無節(jié)制的采集會(huì)破壞生態(tài)平衡，利用蟲草無性型進(jìn)行液態(tài)深層發(fā)酵所得菌絲體是一種良好的替代品，而且應(yīng)用發(fā)酵工程的技術(shù)可以縮短蟲草的生產(chǎn)周期，增大蟲草菌絲體的產(chǎn)量［1，2］。目前，許多研究已經(jīng)證明蟲草的多種成分具有明確的藥理活性，如免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗氧化及調(diào)節(jié)腎臟和肝臟功能等［3］。蟲草屬真菌中的有效活性成分比較多，其中核苷類化合物是其中的一類重要成分，在真菌發(fā)酵液中，人們的興趣多集中于菌絲體，而其多種次生代謝產(chǎn)物可能同時(shí)會(huì)富集于胞外，但目前未見對(duì)胞外部分核苷類化合物含量測(cè)定。另外，傳統(tǒng)的紫外檢測(cè)方法僅以樣品色譜行為的保留時(shí)間作為定性指標(biāo)而缺少光譜數(shù)據(jù)，從而增加了檢測(cè)結(jié)果的不確定性［4］。江西蟲草(Cordyceps jiangxines)、古尼蟲草(Cordyceps gunni)、戴氏蟲草(Cordyceps taii)是我國(guó)梁宗琦研究組在全國(guó)蟲草資源調(diào)查時(shí)，發(fā)現(xiàn)的三個(gè)蟲草屬新記錄［5-6］。本研究擬對(duì)蟲草發(fā)酵液(包括菌絲體和胞外發(fā)酵液部分)中五種重要核苷類化合物的含量進(jìn)行測(cè)定，并以保留時(shí)間和吸收光譜雙指標(biāo)作為定性依據(jù)，建立蟲草中核苷類化合物的定量檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 試劑

標(biāo)準(zhǔn)品:腺苷(批號(hào):046K0661)、蟲草素(批號(hào):054K4053)、尿苷(批號(hào):1181124)、肌苷(批號(hào):080912)、鳥苷(批號(hào):450233)(均為Sigma 產(chǎn)品);甲醇(色譜級(jí)，Tedia，美國(guó));超純水(Millipore)。

1.2 儀器與設(shè)備

全溫振蕩培養(yǎng)箱(QHZ-98A，江蘇太倉(cāng)華美儀器廠);旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(Buchi，瑞士);數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱(GZX-9070MBE，上海博訊公司);超聲破碎儀(Soniprep150，SANYO MSE，英國(guó));Centrifuge 5804R 型冷凍高速離心機(jī)(Eppendorf，德國(guó));Milli-Q Biocel 超純水制備系統(tǒng)(Millipore，美國(guó));超聲儀(Grant XB14，英國(guó));電子天平(精確到0.1 mg，BP121S，Sartorius，德國(guó));LC-20A 型高效液相色譜儀(DAD detector，Shimadzu，日本)。

1.3 供試品制備

江西蟲草、古尼蟲草、戴氏蟲草三種真菌的菌種保藏在貴州大學(xué)真菌研究室和遵義醫(yī)學(xué)院貴州省細(xì)胞工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

樣品的制備:采用液體深層發(fā)酵培養(yǎng)的方法制備蟲草菌絲體，方法見參考文獻(xiàn)［1，2］。將發(fā)酵產(chǎn)物減壓抽濾，合并固體部分(菌絲體)并置于55 ℃干燥箱中烘干至恒重，收集液體部分(胞外發(fā)酵液)4℃低溫儲(chǔ)存。

胞內(nèi)菌絲體部分:采用超聲水提取法。將干燥的菌絲體粉碎(60 目)，精確稱取0.5 g 并加入10 mL 超純水，超聲粉碎0.5 h，提取液5000 rpm 離心15 min，收集上清液，重復(fù)提取一次。合并上清液并用0.22 μm 的微孔濾膜過濾，過濾后濾液用超純水定容至25 mL 容量瓶中，4 ℃冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

胞外發(fā)酵液部分:將發(fā)酵液5000 rpm 離心10 min，上清液用0.22 μm 的微孔濾膜過濾，過濾后濾液用超純水定容至25 mL 容量瓶中，4 ℃冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆?。胞?nèi)與胞外部分的每份樣品均平行測(cè)定3個(gè)樣本。

圖1 混合標(biāo)準(zhǔn)品與三種蟲草樣品的HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of mixed standards and three cordyceps

1.4 色譜條件

應(yīng)用Shimadzu-ODS C18色譜柱(4.6 mm ×250 mm，5 μm)，色譜柱前應(yīng)用Shimadzu C18保護(hù)小柱;流動(dòng)相:水(A)-甲醇(B)，采用梯度洗脫，0～6.5 min，8%B;6.5～7.5 min，8%～12%B;7.5～8 min，12%～35%B;8.0～15.0 min，35%B;15.0～15.03 min，35%～8%B;使用柱前超聲脫氣，流動(dòng)相中的每一組分均用0.22 μm 微孔濾膜過濾，配制流動(dòng)相用Milli-Q 超純水;應(yīng)用二極管陣列檢測(cè)器(DAD)，檢測(cè)波長(zhǎng):λ=254 nm，掃描范圍(λ=190～500 nm);柱溫箱溫度:40 ℃;流速:1.0 mL/min;進(jìn)樣量:20 μL。在此條件下，五種核苷類化合物分離良好且峰形較好。計(jì)算柱效，得到色譜參數(shù)理論塔板數(shù)大于2000?；旌蠘?biāo)準(zhǔn)品的色譜圖見圖1-a。

1.5 HPLC-DAD 方法學(xué)考察

1.5.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

采用外標(biāo)法。精確稱取各標(biāo)準(zhǔn)品1 mg，超純水定容至10 mL，制成混合標(biāo)準(zhǔn)品，濃度為0.1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照液，分別取各對(duì)照液0.05 到2.5 mL 至5 mL 容量瓶中并定容，逐級(jí)稀釋至濃度分別為0.001、0.005、0.01、0.02、0.05、0.1 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液，即每一組分分別配制6個(gè)濃度，其范圍在1.0-100 μg/mL。分別進(jìn)樣20 μL 進(jìn)行測(cè)定，并建立峰面積與組分濃度的回歸方程，確定r 值，評(píng)估線性關(guān)系，確定線性范圍、檢測(cè)限和定量限。檢測(cè)限和定量限的計(jì)算根據(jù)藥典以信噪比的方法確定，即分別以基線噪聲的3 倍和10 倍表示二者的值［7］。具體參見表格1。

表1 五種核苷化合物的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程及檢測(cè)限和定量限Table 1 Regression equation，limit of detection(LOD)and limit of quantification(LOQ)of 5 nucleosides

1.5.2 選擇性和峰純度

根據(jù)每一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間RT 和%RSD、最大吸收峰的光密度值γ，以色譜-光譜-時(shí)間三維立體圖確定每一種待檢測(cè)的物質(zhì)，確定了以保留時(shí)間和光密度值雙指標(biāo)作為定性依據(jù)的可行性。利用二極管陣列檢測(cè)器計(jì)算每一個(gè)目標(biāo)峰的純度指數(shù)。

1.5.3 精密度

對(duì)色譜系統(tǒng)的性能進(jìn)行考察。取混合對(duì)照品溶液連續(xù)進(jìn)樣5 次，記錄色譜圖，計(jì)算峰面積，計(jì)算精密度。

1.5.4 穩(wěn)定性

選擇戴氏蟲草菌絲體作為檢測(cè)對(duì)象，考察樣品在36 h 內(nèi)各有效成分的穩(wěn)定性。將樣品提取液在避光及4 ℃條件下儲(chǔ)存，在36 h 內(nèi)即第0、4、8、12、24、36 h 分6 次進(jìn)樣測(cè)定，考察峰面積的變化。

1.5.5 重現(xiàn)性

按預(yù)定提取方法平行提取樣品江西蟲草菌絲體5份，制備供試液，并進(jìn)樣檢測(cè)，計(jì)算平均值和%RSD。

1.5.6 加標(biāo)回收率

檢查提取方法與色譜條件的可靠性。取戴氏蟲草菌絲體的樣品3 份，分別按照樣品中各個(gè)成分的含量加入一定比例(80%、100%、120%)的混合標(biāo)準(zhǔn)品(尿苷、鳥苷和腺苷)，按照前述方法重新提取并進(jìn)樣檢測(cè)，計(jì)算回收率。

1.6 供試品測(cè)定

將四個(gè)樣品(三種蟲草的菌絲體和戴氏蟲草的胞外發(fā)酵液部分)分別按照前述2.4 項(xiàng)所述色譜條件進(jìn)行測(cè)定，并計(jì)算其中核苷類化合物的含量。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 方法學(xué)考察結(jié)果

2.1.1 選擇性和峰純度

每一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間RT 和%RSD 分別為尿苷(5.52 ±0.05，0.91%)、肌苷(8.21 ±0.09，1.18%)、鳥苷(8.95 ±0.10，1.19%)、腺苷(14.20±0.12，0.87%)、蟲草素(14.56 ±0.08，0.61%);其最大吸收峰的波長(zhǎng)γ 分別為262、249、253、259、260 nm。各檢測(cè)峰在其保留時(shí)間范圍內(nèi)沒有受到明顯干擾，有較高的專屬性。每一個(gè)檢測(cè)目標(biāo)峰純度指數(shù)均大于92%。

2.1.2 精密度

計(jì)算得到的每一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積的%RSD分別為1.89%、2.46%、2.00%、0.98%、1.48%，說明該色譜系統(tǒng)在本次操作條件下有良好的精密度。

2.1.3 穩(wěn)定性

本次實(shí)驗(yàn)未能檢測(cè)到蟲草素，其中尿苷、肌苷、鳥苷、腺苷四種檢測(cè)目標(biāo)峰面積的% RSD 分別為3.078%，5.0%，1.606%，4.300%，說明各有效成分在36 小時(shí)之內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.4 重現(xiàn)性

計(jì)算平均值和%RSD 分別為尿苷(3.15 ±0.53 mg/g，4.04%)、鳥苷(0.11 ±0.02 mg/g，2.84%)、腺苷(1.60 ±0.41 mg/g，2.44%)，證明此方法重現(xiàn)性良好。

2.1.5 加標(biāo)回收率

尿苷、鳥苷、腺苷三個(gè)檢測(cè)指標(biāo)的回收率分別為尿苷(92.04 ±1.91 %)、鳥苷(95.67 ±1.04 %)、腺苷(90.13 ±2.12%)，這表明了該方法所建立的提取方法和色譜條件的可靠性比較好。

2.2 樣品中的含量

結(jié)果見表格2，以戴氏蟲草菌絲體和胞外發(fā)酵液比較，可見胞外部分未檢測(cè)到肌苷，且其中尿苷、鳥苷和腺苷的含量均低于菌絲體部分超過10 倍的數(shù)量。其中腺苷存在于每一個(gè)樣品中，戴氏蟲草胞外發(fā)酵液部分、古尼蟲草菌絲體與野生冬蟲夏草比較其含量相當(dāng)，而戴氏蟲草和江西蟲草菌絲體與野生冬蟲夏草比較其中含量均比較高［8］。本次實(shí)驗(yàn)在四個(gè)樣品中均未能檢測(cè)到蟲草菌素。戴氏(胞外與菌絲體)、古尼江西、蟲草四個(gè)樣品的HPLC 色譜圖見圖1b～e。

表2 各樣品中核苷類化合物的種類及其含量Table 2 The sorts and contents of nucleosides in the samples

3 討論

本實(shí)驗(yàn)主要考察了江西、戴氏、古尼三種蟲草菌絲體和發(fā)酵液中五種核苷類化合物的含量，建立了核苷類化合物的定量檢測(cè)方法，從精密度、重現(xiàn)性等實(shí)驗(yàn)結(jié)果看這一方法是可靠的。應(yīng)用HPLC-DAD的檢測(cè)方法，采用保留時(shí)間和吸光光譜兩個(gè)指標(biāo)，建立色譜-光譜雙指標(biāo)法有利于準(zhǔn)確測(cè)量，優(yōu)于單波長(zhǎng)的紫外檢測(cè)方法［4，8］。另外，整個(gè)檢測(cè)過程僅用15 分鐘就全部完成，采用梯度洗脫的方法即可實(shí)現(xiàn)五種核苷類化合物的完全分離，而未使用緩沖鹽，這樣減少了維護(hù)成本，保護(hù)了色譜柱和整個(gè)系統(tǒng)。

從測(cè)定結(jié)果看，胞外發(fā)酵液部分也含有一定量的核苷類化合物，雖然含量較低，但仍可以作為進(jìn)一步開發(fā)的對(duì)象，如功能性食品或保健飲料等，在野外訓(xùn)練和軍事保健中具有極大的潛在應(yīng)用價(jià)值;核苷類化合物在菌絲體中的種類不是很全，但含量比較高，如腺苷的含量與野生冬蟲夏草相比較高出10 倍左右［8］，并且均在藥物化學(xué)實(shí)驗(yàn)中獲得分離純化［9］，相關(guān)實(shí)驗(yàn)表明這些化合物不排除與抗氧化等活性相關(guān)［10，11］。從核苷類化合物的種類和含量來看，這種發(fā)酵菌絲體作為冬蟲夏草替代品是可行的。下一步可結(jié)合分離純化和藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步完善其質(zhì)控指標(biāo)，以期建立系統(tǒng)的品質(zhì)評(píng)價(jià)體系和質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，為今后有目的的開發(fā)研究打下基礎(chǔ)。

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