秦 淳，林秀萍，艾 文，鐘志龍，冼嘉韻，徐石海，劉永宏*

1暨南大學化學系，廣州 510632;2中國科學院南海海洋研究所 廣東省海洋藥物重點實驗室，廣州 510301

紅樹林作為自然生長在熱帶和亞熱帶海灣河口潮間帶的一種特殊的木本植物群落，一直處于高鹽、強風、高溫、強紫外輻射和缺氧污泥的特殊環(huán)境。內(nèi)生真菌指生活在生物組織內(nèi)部，不會引發(fā)生物組織產(chǎn)生明顯病癥的一類真菌［1］。植物內(nèi)生真菌全部或部分生活周期都在植物體內(nèi)，與植物形成互惠共生的關系。由于紅樹林生存環(huán)境獨特，根據(jù)自然進化理論，可以推測紅樹植物及其內(nèi)生真菌的次級代謝產(chǎn)物可能蘊含著生物活性多樣、結(jié)構(gòu)新穎的代謝產(chǎn)物［1］。近年來，世界各地的多個研究小組開展了對紅樹林內(nèi)生真菌次級代謝產(chǎn)物的研究，已分離出一批結(jié)構(gòu)新穎，具有細胞毒活性、抗菌、抗氧化，抗炎，保肝等生物活性的化合物［2-6］。

為了獲得結(jié)構(gòu)新穎、生物活性良好的化合物，作者對分離來自紅樹植物無瓣海桑Sonneratia apetala的一株內(nèi)生真菌Neofusicoccum sp.SaBA3 進行了大米發(fā)酵。從其發(fā)酵產(chǎn)物中分離得到8個化合物，通過1D 和2D NMR 以及文獻對照等手段鑒定了這些化合物的結(jié)構(gòu)，化合物2-8 首次從Neofusicoccum 屬中分離得到。

1 儀器與材料

NMR 譜用Bruker AV-500 核磁共振儀測定;質(zhì)譜圖采用API2000 型ESI 質(zhì)譜儀測定;中壓制備柱色譜為Buchi 公司產(chǎn)品(C615/605);葡聚糖凝膠Sephadex LH-20(Pharmacia);薄層色譜硅膠、柱色譜硅膠和薄層制備板(20 × 20 × 0.03 cm)均購自青島海洋化工廠，化學試劑均為國產(chǎn)分析純。

海洋真菌Neofusicoccum sp.SaBA3 從紅樹植物無瓣海桑Sonneratia apetala 的樹枝中分離得到，無瓣海桑Sonneratia apetala 與2010 年10 月采自廣東省廣州市南沙區(qū)紅樹林。采集后的紅樹植物裝于干凈容器中，避免擠壓。放置于冰箱中，次日對其進行內(nèi)生真菌的分離。

發(fā)酵培養(yǎng)基及條件:大米200 g，粗海鹽2 g，自來水200 mL，裝于1000 mL 三角瓶中，浸泡過夜，121 ℃滅菌20 分鐘。將種子液接種到20 瓶大米培養(yǎng)基中，25 ℃恒溫發(fā)酵一個月。

2 提取分離

固體發(fā)酵物用丙酮浸泡過夜，切成小塊，充分攪拌后，超聲提取10 min，抽濾，收集上清液。殘渣再用乙酸乙酯浸提三次，每次充分攪拌后，超聲提取10 分鐘，抽濾，收集上清液。將四次得到的上清液合并，減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，水浴控制溫度低于60 ℃，得浸膏30.3 g。粗浸膏溶解后按1∶1 的比例與100-200的硅膠H 拌勻，干燥完全后用中低壓正相硅膠柱分離，石油醚-丙酮(1∶0～0∶1)梯度洗脫，經(jīng)TLC 薄層檢測合并，得到15個餾分Frs.1-15。Frs.2 經(jīng)SephadexLH-20 凝膠柱(氯仿-甲醇，1∶1)分離，得到6個餾分Frs.21-Frs.26，其中Frs.23 經(jīng)硅膠柱分離，氯仿-丙酮(100∶1，50∶1，20∶1)梯度洗脫，TLC 檢測合并，減壓蒸餾得到化合物5(86 mg);Frs.3 經(jīng)重結(jié)晶，得到化合物3(139 mg);Frs.4 經(jīng)SephadexLH-20凝膠柱(氯仿-甲醇，1∶1)分離，得到3個餾分Frs.41-Frs.43，F(xiàn)rs.41 經(jīng)硅膠柱分離，石油醚-氯仿(100∶0，50∶1，0∶100)梯度洗脫，TLC 檢測合并，減壓蒸餾得到化合物7(16 mg);Frs.6 經(jīng)Sephadex LH-20 凝膠柱(氯仿-甲醇，1∶1)分離，得到4個餾分Frs.61-Frs.64，其中Frs.62 經(jīng)正相硅膠柱分離，石油醚乙酸乙酯(100∶0，50∶1，20∶1，5∶1)梯度洗脫，TLC 檢測合并，減壓蒸餾得到化合物4(150 mg);Frs.9 經(jīng)SephadexLH-20 凝膠柱(氯仿-甲醇，1∶1)分離，得到6個餾分Frs.91-Frs.96，其中Frs.95 經(jīng)硅膠柱分離，氯仿-甲醇(100∶0，50∶1，20∶1，10∶1，5∶1)梯度洗脫，TLC 檢測合并，經(jīng)薄層制備板(氯仿-丙酮，2∶1)分離，得到化合物1 (1.6 mg);Frs.10 經(jīng)Sephadex LH-20 凝膠柱(氯仿-甲醇，1 ∶1)分離，得到3個餾分Frs.101-Frs.103，其中Frs.102 經(jīng)硅膠柱分離，氯仿-甲醇(100∶0，20∶1，10∶1，2∶1)梯度洗脫，TLC 檢測合并，經(jīng)薄層制備板(石油醚-丙酮，5∶1)分離，得到化合物2(1.9 mg);Frs.15 經(jīng)SephadexLH-20 凝膠柱(甲醇)分離，得到4個餾分Frs.151-Frs.154，其中Frs.151 經(jīng)硅膠柱分離，氯仿-丙酮(100∶0，50∶1，20∶1，10∶1)，TLC 檢測合并，經(jīng)薄層制備板(石油醚-丙酮，10∶1)分離，得到化合物6 (3.1 mg);Frs.154 經(jīng)硅膠柱分離，氯仿-甲醇(50∶1，20∶1，10∶1，2∶1，0∶1)，經(jīng)TLC 檢測合并，得化合物8(10.2 mg)。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1 白色固體，分子式為C13H16O5。ESIMS m/z 253［M+H］+，此化合物在紫外(甲醇)222和288 nm 處有最強吸收。13C NMR(DEPT)顯示13個碳信號，兩個甲基其中包括一個氧甲基，兩個亞甲基，三個次甲基其中包括兩個連氧的次甲基，六個季碳其中包括一個羰基，兩個連氧的季碳。通過HSQC 把相應的氫原子和碳原子連接起來。1H-1HCOSY 顯示H-C(2)/ H-C(3)/ H-C(4)相關，在結(jié)合HMBC 里面的H-C(2)跟C(1)，C(3)，C(4)相關可以得到片段1b(Fig.1)。通過H-C(4)跟C(4a)，C(5)，C(8a)相關就能夠把1a，1b 這兩個片段連接起來。該化合物3，4 位的相對立體構(gòu)型是通過NOESY 確定的，NOESY 顯示H-3 和H-4 不相關，說明H-3 和H-4 不在同一側(cè)，是反式構(gòu)型。以上數(shù)據(jù)和文獻［7］報道基本一致，故確定該化合物為(3S*，4S*)-3，4-二氫-3，4，8-三羥基-7-乙基-6-甲氧基萘-1-酮。具體的NMR 數(shù)據(jù)歸屬如下:1H NMR (500 MHz，CD3OD)δH:6.85 (1H，s，H-5)，4.58 (1H，m，H-4)，4.03 (1H，m，H-3)，3.95 (3H，s，-OCH3)，3.03 (1H，dd，J=4.0，4.5 Hz，H-2)，2.68 (1H，m，H-2)，2.68 (2H，m，H-2')，1.08 (3H，t，J=7.5 Hz，H-1');13C NMR (125 MHz，CD3OD)δC:202.3(C-1)，165.3 (C-6)，162.7 (C-8)，145.8 (C-4a)，119.3 (C-7)，111.3 (C-8a)，102.9 (C-5)，73.9 (C-4)，71.9 (C-3)，56.3 (-OCH3)，44.5 (C-2)，16.3(C-2')，13.5(C-1')。

圖1 化合物1 的結(jié)構(gòu)片段，部分重要的HMBC (H→C)，1H，1H-COSY (—)相關Fig.1 Sturcture fragments of 1，and selected HMBC (H→C)，1H，1H-COSY (—)correlations

化合物2 無色針狀結(jié)晶(氯仿)，分子式為C12H12O4。ESI-MS m/z 221［M+H］+，此化合物在紫外(甲醇)308 nm 處有最強吸收。13C NMR (DEPT)顯示12個碳信號，三個甲基其中包括兩個氧甲基，三個次甲基(雙鍵)，6個季碳其中包括三個連氧季碳和一個酯羰基。1H NMR 顯示δH:6.66 (1H，d，J=2.5 Hz，H-8)，6.61 (1H，d，J=2.5 Hz，H-6)，這是苯環(huán)上間位的兩個氫原子的相互耦合裂分的特征峰。通過HSQC 把相應的氫原子和碳原子連接起來。HMBC 顯示CH3-C (7)跟C (10)，C (6)，C(7)相關，CH3O-(δH3.86)跟C (7)，CH3O-(δ:3.93)跟C (4)都有相關，就能夠把三個甲基的相對位置給定下來。H-C (3)跟C (4)，C (10)相關，H-C (8)跟C (7)，C (9)，C (6)，C (10)相關，H-C (6)跟C (10)，C (8)，CH3-C (5)也有相關，這樣把化合物2 的結(jié)構(gòu)連接起來，如圖Fig.2。以上數(shù)據(jù)和文獻［8］報道基本一致，故鑒定為4，7-二甲氧基-5-甲基香豆素。具體NMR 數(shù)據(jù)歸屬如下:1H NMR (500 MHz，CDCl3)δH:6.66 (1H，d，J=2.5 Hz，H-8)，6.61 (1H，d，J=2.5 Hz，H-6)，5.53(1H，s，H-3)，3.93 (3H，s，-OCH3)，3.83 (3H，s，-OCH3)，2.61 (3H，s，-CH3);13C NMR (125 MHz，CDCl3)δC:169.7 (C-4)，163.1 (C-2)，162.0 (C-7)，156.7 (C-9)，138.5 (C-5)，115.6 (C-6)，107.9(C-10)，98.8 (C-8)，87.6 (C-3)，55.9 (-OCH3)，55.5 (-OCH3)。

圖2 化合物2 的結(jié)構(gòu)，部分HMBC (H→C)相關Fig.2 Structure of 2，and selected HMBC (H→C)correlations

化合物3 白色針狀結(jié)晶(甲醇)，分子式為C28H44O。254 nm 下有紫外吸收，碘熏顯色，TLC 展開10%硫酸乙醇顯紅色斑點。1H NMR (500 MHz，CDCl3)顯示有6個甲基1.03 (3H，d，J=6.5 Hz，H-21)，0.94 (3H，s，H-19)，0.91 (3H，d，J=7.0 Hz，H-28)，0.83 (3H，d，J=7.0 Hz，H-27)，0.80(3H，d，J=7.0 Hz，H-26)，0.63 (3H，s，H-18)，0.91 (3H，d，J=7.0 Hz，H-28)和3.36 (1H，m，H-3)連氧次甲基的信號，推測該化合物為甾醇類。δH5.56 (1H，brs，H-6)，5.38 (1H，brs，H-7)，為環(huán)上的雙鍵，5.22 (1H，dd，J=15.3，7.0 Hz，H-22)，5.18(1H，dd，J=15.3，7.1 Hz，H-23)，為側(cè)鏈上的反式雙鍵。13C NMR (125 MHz，CDCl3)δC:38.4 (C-1)，32.0 (C-2)，70.5 (C-3)，40.8 (C-4)，139.8 (C-5)，119.6 (C-6)，116.3 (C-7)，141.3 (C-8)，46.3(C-9)，37.1 (C-10)，21.1 (C-11)，39.1 (C-12)，42.8 (C-13)，54.6 (C-14)，23.0 (C-15)，28.2 (C-16)，55.8 (C-17)，12.0 (C-18)，16.3 (C-19)，40.4(C-20)，21.1 (C-21)，135.6 (C-22)，132.0 (C-23)，42.8 (C-24)，33.1 (C-25)，19.8 (C-26)，19.6(C-27)，17.6 (C-28)。以上數(shù)據(jù)和文獻［9］報道基本一致，故鑒定為麥角甾-5，7，22-三烯-3β-醇。

化合物4 無色針狀結(jié)晶(甲醇)，分子式為C28H46O3。254 nm 下有紫外吸收，碘熏顯色，TLC 展開10%硫酸乙醇顯黑色斑點。1H NMR (500 MHz，CD3COCD3)顯示C-3 位連氧次甲基質(zhì)子信號δH:3.76 (1H，m)，C-3 位羥基δH3.68 (1H，brs)和6個甲基信號，分別為1.02 (3H，d，J=6.6 Hz)，0.93(3H，d，J=6.8 Hz)，0.89 (3H，s)，0.86 (3H，s)，0.85 (3H，d，J=7.2 Hz)，0.83 (3H，d，J=6.8 Hz)，初步推測為該化合物為一甾醇類化合物。1H NMR 中還顯示兩對鄰位烯質(zhì)子信號δH6.22 (1H，d，J=8.5 Hz，H-6)，6.48 (1H，d，J=8.5 Hz，H-7)，5.19 (1H dd，J=15.5，7.5 Hz，H-22)，5.25(1H，dd，J=15.5，7.5 Hz，H-23);13C NMR (125 MHz，CD3COCD3)δC:36.3 (C-1)，31.7 (C-2)，66.8(C-3)，38.4 (C-4)，83.0 (C-5)，137.0 (C-6)，131.7 (C-7)，80.0 (C-8)，53.1 (C-9)，38.6 (C-10)，24.6 (C-11)，40.9 (C-12)，45.8 (C-13)，53.3(C-14)，21.9 (C-15)，29.9 (C-16)，57.6 (C-17)，13.8 (C-18)，19.0 (C-19)，44.1 (C-20)，21.9 (C-21)，137.1 (C-22)，133.5 (C-23)，44.3 (C-24)，34.4 (C-25)，20.5 (C-26)，20.8 (C-27)，18.6 (C-28)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻［10］對照基本一致，故鑒定為麥角甾-6，22-二烯-5α，8α-環(huán)二氧-3-醇。

化合物5 白色粉末狀固體，分子式為C28H46O。1H NMR (500 MHz，CDCl3)，δH5.70 (1H，s，H-4)，1.16 (3H，s)，0.89 (3H，d，J=5.5 Hz)，0.82(3H，d，J=8.0 Hz)，0.81 (3H，d，J=7.0 Hz)，0.78 (3H，d，J=7.0 Hz)，0.69 (3H，s);13C NMR(125 MHz，CDCl3)δC:35.6 (C-1)，33.9 (C-2)，199.3 (C-3)，123.7 (C-4)，171.4 (C-5)，32.0 (C-6)，28.1 (C-7)，35.6 (C-8)，53.8 (C-9)，38.5 (C-10)，21.0 (C-11)，39.5 (C-12)，42.2 (C-13)，55.8(C-14)，22.6 (C-15)，26.1 (C-16)，56.0 (C-17)，11.9 (C-18)，17.3 (C-19)，35.7 (C-20)，19.7 (C-21)，32.8 (C-22)，24.1 (C-23)，45.8 (C-24)，29.1(C-25)，18.6 (C-26)，18.5 (C-27)，11.9 (C-28)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻［11］對照基本一致，故鑒定為麥角甾醇-5-烯-3-酮。

化合物6 白色晶體(甲醇)，分子式為C28H48O。1H NMR (500 MHz，CDCl3)δH:0.66 (3H，s，18-CH3)，0.86 (6H，d，J=6.5 Hz)，0.95 (3H，d，J=6.8 Hz，21-CH3)，1.05 (3H，d，J=6.5 Hz)，1.16(3H，s)，3.78 (1H，m，H-3)，5.23 (2H，m)。以上數(shù)據(jù)與文獻［12］對照基本一致，與膽甾醇標準品進行TLC 展開對照，發(fā)現(xiàn)Rf 值及顯色行為均一致，故鑒定為3β-羥基膽甾醇。

化合物7 無色油狀物，分子式為C10H10O4。1H NMR (500 MHz，CDCl3)δH:7.73 (1H，dd，J=5.5，3.0 Hz，H-3)，7.54 (1H，dd，J=5.5，3.5 Hz，H-4)，3.91 (3H，s，-OCH3);13C NMR (125 MHz，CDCl3)δC:168.0 (C-1)，132.0 (C-2)，131.0 (C-3)，128.8 (C-4)，52.5 (-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻［13］報道的數(shù)據(jù)基本一致，故鑒定為鄰苯二甲酸二甲酯。

化合物8 白色固體，分子式為C4H4N2O2。ESI-MS m/z 113 ［M+H］+，1H NMR (500 MHz，DMSO-d6)δH10.99 (1H，brs，3-NH)，10.82 (1H，brs，1-NH)，7.39 (1H，d，J=7.5 Hz，H-5)，5.45(1H，d，J=7.5 Hz，H-6)。以上數(shù)據(jù)與文獻［14］報道的數(shù)據(jù)基本一致，故鑒定為尿嘧啶。

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