喻夢嵐，徐 幫，程 凡，鄒 坤，陳劍鋒

三峽大學(xué)生物與制藥學(xué)院 天然產(chǎn)物研究與利用湖北省重點實驗室，宜昌 443002

昆蟲與微生物的共生是自然界的一種普遍的現(xiàn)象，緣于昆蟲龐大的種群和復(fù)雜的生活環(huán)境，其共生菌有著異常豐富的多樣性，故有可能產(chǎn)生結(jié)構(gòu)新穎，類型豐富的活性次級代謝產(chǎn)物，因而昆蟲共生真菌已成為尋找新生物活性物質(zhì)的新的重要來源［1］。本課題組從中華劍角蝗的腸道中分離得到一株草酸青霉(Penicillium oxalicum)菌株，采用細(xì)胞毒活性追蹤法對其發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行了化學(xué)分離，從中分離得到1個具有較好抗腫瘤活性的化合物，通過波譜數(shù)據(jù)分析及理化性質(zhì)鑒定結(jié)構(gòu)。同時對其進(jìn)行了體外抗腫瘤活性研究并利用流式細(xì)胞儀技術(shù)初步探究了該活性活性產(chǎn)物的抗腫瘤機制，為進(jìn)一步的開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Bruker AV 400 核磁共振波譜儀，瑞士布魯克公司;AmozonSL+1200 液相色譜-雙重漏斗傳輸離子阱質(zhì)譜儀，德國布魯克·道爾頓公司;Dionex Ultimate 3000 型高效液相色譜儀，美國戴安公司;Cosmosil MS-II RP-C18色譜柱(5 μm，250 ×10 mm 半制備型;5 μm，250 ×4.6 mm 分析型);EPICS XL-4 型流式細(xì)胞儀，美國Beckman Coulte 公司;Stat Fax-2100 型酶標(biāo)儀，美國Awareness 公司;倒置顯微鏡，日本Olympus CKX41 公司;四甲基偶氮唑鹽(MTT)購自Sigma 公司;Annexin V-FITC 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒、JC-1 細(xì)胞線粒體膜電位檢測試劑盒購自南京凱基生物。

1.2 菌株和細(xì)胞株

實驗菌株分離自中華劍角蝗腸道，昆蟲樣品于2011 年7 月采集于湖北省神農(nóng)架大九湖國家濕地公園，菌株由三峽大學(xué)涂璇博士鑒定為草酸青霉(Penicillium oxalicum)，保存于三峽大學(xué)天然產(chǎn)物研究與利用湖北省重點實驗室;人永生化表皮細(xì)胞HaCAT、犬腎細(xì)胞MDCK、人肝癌細(xì)胞HepG2、人肺癌細(xì)胞A549、人宮頸癌細(xì)胞Ca Ski、鼻咽癌細(xì)胞CNE2 和人乳腺癌細(xì)胞(MDA-MB-231)購自武漢大學(xué)中國典型培養(yǎng)物保藏中心，由三峽大學(xué)天然產(chǎn)物研究與利用湖北省重點實驗室傳代保藏。

1.3 培養(yǎng)基

培養(yǎng)基:SDA 培養(yǎng)基(葡萄糖40 g，蛋白胨10 g，瓊脂20 g，水1000 mL，pH 值自然);SD 培養(yǎng)基(葡萄糖40 g，蛋白胨10 g，水1000 mL，pH 值自然)，1.25 ×105Pa 滅菌20 min。

1.4 菌株P(guān)enicillium oxalicum 的發(fā)酵

菌株經(jīng)SDA 培養(yǎng)基斜面活化后，接種于SD 種子培養(yǎng)基中，于28 ℃、125 rpm 振蕩培養(yǎng)3 d;將培養(yǎng)好的種子以5%的接種量接種于SD 發(fā)酵培養(yǎng)基中，于28 ℃、125 rpm 振蕩培養(yǎng)16 d，共發(fā)酵40 L。

1.5 活性追蹤法分離提取Penicillium oxalicum 的發(fā)酵次級代謝產(chǎn)物

發(fā)酵液40 L 過濾，用乙酸乙脂萃取濾液，減壓濃縮得12.2 g 粗提物;菌絲體經(jīng)37 ℃烘干處理后，用氯仿-甲醇(1∶1)浸提烘干的菌絲體，過濾，上清液減壓濃縮得10.6 g 粗提物。將上述粗提物合并，經(jīng)正相硅膠柱色譜(800 g 正相硅膠，200～300 目)分離，氯仿-甲醇(100∶0～50∶50%，v/v)梯度洗脫，得5個洗脫部分(1～5)。對合并的粗提物和5個洗脫部分進(jìn)行體外抗腫瘤活性研究(MTT 法［2］)。根據(jù)各段活性進(jìn)行下一步分離，其中1 部分在低溫下析出一黃色晶體化合物(36.6 mg)，通過波譜分析與查閱文獻(xiàn)對純化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，并測定其體外抗腫瘤活性。

1.6 單體化合物抗腫瘤活性機制初步探究

鑒于1 部分及其分離到的單體化合物對HepG2細(xì)胞抑制活性相對較好，故以HepG2 細(xì)胞為檢測模型，應(yīng)用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)變化、流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡和線粒體膜電位的變化。細(xì)胞凋亡用AnnexinV-PI 雙染法檢測，線粒體膜電位用JC-1 探針法檢測，試劑盒均購自南京凱基生物，按照說明書提供的方法操作。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌液粗提物及5個分離部分的活性篩選結(jié)果

菌液粗提物及經(jīng)正相硅膠柱色譜分離后的1～5，5個洗脫部分，用DMSO 溶解配制成100 mg/mL的儲存濃度，然后用細(xì)胞培養(yǎng)基稀釋成100、50、25至1.56 μg/mL，分別通過MTT 法進(jìn)行體外抗腫瘤活性試驗，以絲裂霉素為陽性藥物對照，根據(jù)SPSS軟件計算IC50值。其結(jié)果如表1 所示。

表1 粗提物及各洗脫部分對不同腫瘤細(xì)胞的IC50(μg/mL)(n=3，)Table 1 IC50(μg/mL)of total extract and its eluted fractions against tumor cells (n=3，)

表1 粗提物及各洗脫部分對不同腫瘤細(xì)胞的IC50(μg/mL)(n=3，)Table 1 IC50(μg/mL)of total extract and its eluted fractions against tumor cells (n=3，)

從表1 可以看出，菌株發(fā)酵產(chǎn)物的粗提物具有一定的抗腫瘤活性，而且對HepG2 細(xì)胞的細(xì)胞毒性要比A549 細(xì)胞強。過正相硅膠柱，用不同比例的氯仿-甲醇梯度洗脫后，抗腫瘤活性化合物主要集中于100∶0 (v/v)的氯仿-甲醇洗脫部位(1 部分)，IC50值達(dá)到9.34 μg/mL，相對其他部分而言活性最好，故綜合考慮首先分離1 部分。將1 部分放置于4 ℃冰箱過夜，結(jié)果析出大量黃色晶體化合物。

2.2 單體化合物的結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1 的理化性質(zhì)和波譜數(shù)據(jù)如下:黃色針晶，mp.244～248 ℃;ESI-MS m/z:639［M+1］+;1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ:13.78(2H，s，8，8'-OH)，11.74(2H，s，1，1'-OH)，7.45(2H，d，J=8.5Hz，H-3，3')，6.63(2H，d，J=8.5 Hz，H-4，4')，3.93(2H，d，J=11 Hz，H-5，5')，3.72(6H，s，13，13'-OCH3)，2.73(2H，dd，J=6.0，19.1 Hz，H-7a，7a')，2.41(2H，m，H-6，6')，2.31(2H，dd，J=10.5，19.2 Hz，H-7b，7b')，1.17(6H，d，J=6.6 Hz，H-11，11');13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ:187.2(C-9，9')，177.5(C-8，8')，170.3(C-12，12')，159.4(C-1，1')，158.3(C-4a，4a')，140.2(C-3，3')，117.3(C-2，2')，107.5(C-4，4')，106.3(C-9a，9a')，101.7(C-8a，8a')，84.7(C-10a，10a')，77.0(C-5，5')，53.2(13，13'-OCH3)，

36.3 (C-7，7')，29.3(C-6，6')，18.0(C-11，11')。結(jié)合文獻(xiàn)報道［3-5］的波譜數(shù)據(jù)，化合物1 可能是secalonic acid A(SAA)或secalonic acid D(SAD)，兩者不同之處在于5、6、10a 和5'、6'、10a' 位羥基構(gòu)型不同。通過測定比旋光度與文獻(xiàn)值相比較，化合物1的比旋光度［α］20D-73.3°(c=0.10，氯仿)，文獻(xiàn)中，SAD 的比旋光度［α］20D+88°(c=0.10，氯仿)［3，5］，SAA 的比旋光度［α］20D-75°(c=0.10，氯仿)［4］。最終鑒定化合物1 為secalonic acid A，結(jié)構(gòu)式如圖1 所示。

圖1 secalonic acid A 的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 The structure of secalonic acid A

2.3 secalonic acid A 的體外抗腫瘤活性

為了評價secalonic acid A (SAA)的體外抗腫瘤活性，我們擴大了腫瘤細(xì)胞譜，并增加了2 種正常細(xì)胞株，結(jié)果如表2 所示，secalonic acid A 對多種腫瘤細(xì)胞株均具有較好的細(xì)胞毒活性，其中對肝癌HepG2 細(xì)胞的毒性最強，IC50值為1.12 μM，而且對2 種正常細(xì)胞的毒性均較小，IC50值在100 μM 以上，兩者相差100 倍左右，可見secalonic acid A 具有一定的細(xì)胞毒選擇性。

表2 secalonic acid A 對不同腫瘤細(xì)胞的IC50(μM)(n=3，)Table 2 IC50(μM)of secalonic acid A against tumor cells (n=3，)

表2 secalonic acid A 對不同腫瘤細(xì)胞的IC50(μM)(n=3，)Table 2 IC50(μM)of secalonic acid A against tumor cells (n=3，)

2.4 secalonic acid A 對HepG2 細(xì)胞形態(tài)的影響

用不同濃度(5.0、2.5、1.25 μM)的secalonic acid A 作用HepG2 細(xì)胞48 小時，在光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)的變化(放大倍數(shù)10 ×10)，如圖2 所示，與未加藥的對照組細(xì)胞相比，1.25 μM Secalonic acid A 作用后，可見細(xì)胞收縮變圓，細(xì)胞貼壁能力減弱，隨著藥物作用濃度的增加，細(xì)胞的生長逐漸受到抑制，細(xì)胞表面逐漸突起形成小膜泡不斷脫落懸浮于細(xì)胞培養(yǎng)液中。5.0 μM Secalonic acid A 作用于HepG2 細(xì)胞48 h 后，細(xì)胞出現(xiàn)大量的細(xì)胞碎片，細(xì)胞壞死。而對照組細(xì)胞生長良好。

2.5 secalonic acid A 對HepG2 細(xì)胞凋亡的影響

圖2 A :正常HepG2 細(xì)胞;Fig.2 A:normal HepG2 cell;

HepG2 細(xì)胞經(jīng)不同濃度的Secalonic acid A(5.0、2.5、1.25 μM)作用24 h 后，用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡的變化，F(xiàn)ITC+/PI-為早期凋亡細(xì)胞，F(xiàn)ITC+/PI+為晚期凋亡細(xì)胞，結(jié)果如圖3 所示，Secalonic acid A 誘導(dǎo)HepG2 細(xì)胞發(fā)生了顯著的凋亡，且具有濃度依賴性。0、1.25、2.5 和5.0 μM 的Secalonic acid A 誘導(dǎo)的早期凋亡率分別為2.6%、27.8%、32.5%、40.6%，晚期凋亡率分別為1.8%、17.2%、23.6%和23.2%。

圖3 A :正常HepG2 細(xì)胞Fig.3 A:normal HepG2 cell

2.6 secalonic acid A 對HepG2 細(xì)胞線粒體膜電位的影響

HepG2 細(xì)胞經(jīng)不同濃度的Secalonic acid A(5.0、2.5、1.25 μM)作用24 h 后，用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡的變化(JC-1 探針法)，結(jié)果如圖4 所示，Secalonic acid A 顯著破壞了HepG2 細(xì)胞的線粒體膜電位，相對破壞率由15.3%(0 μM SAA)上升到97.3%(5.0 μM SAA)。

圖4 A :正常HepG2 細(xì)胞Fig.4 A:normal HepG2 cell

3 討論

本研究將1 株昆蟲來源的草酸青霉(Penicillium oxalicum)菌株的發(fā)酵液和菌絲體的粗提物經(jīng)正相硅膠柱色譜分離，氯仿-甲醇(100∶0～50∶50%，v/v)梯度洗脫，得5個洗脫部分(1～5)，通過細(xì)胞毒性MTT 法進(jìn)行活性追蹤分離，從1 洗脫部分獲得了1個較好活性的單體化合物Secalonic acid A，該化合物為首次從該屬菌種中分離得到。Secalonic acid A對多種腫瘤細(xì)胞株均具有較好的細(xì)胞毒性，尤其對人肝癌細(xì)胞Hep G2，IC50值達(dá)到1.12 μM，而且對正常細(xì)胞株的毒性較小，顯示了一定的選擇性細(xì)胞毒力。初步的機制研究結(jié)果表明，Secalonic acid A 主要通過線粒體途徑誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡從而發(fā)揮抗腫瘤作用。另外，該化合物得率高，分離方法簡單(低溫結(jié)晶析出)，容易獲得較大產(chǎn)量，所以下一步我們將進(jìn)行動物試驗和深入的機制研究，以綜合評估Secalonic acid A 的應(yīng)用價值。

微生物次級代謝產(chǎn)物之間往往存在著各種拮抗或協(xié)同作用，因此粗提物的活性與分離到的單體化合物活性之間沒有絕對的聯(lián)系，各種活性次級代謝產(chǎn)物在微生物體內(nèi)的代謝產(chǎn)生與分布平衡可能取決于微生物的體內(nèi)生長代謝機制和所處外部環(huán)境等［6］。所以有必要對其余部分的化合物進(jìn)行分離。本課題組從余下的2～5 洗脫部分分離到5個化合物［7］，分別為asperpyrones A、asperpyrones B、asperpyrones C、asperpyrones D 和aurasperone A，均為苯并吡喃酮二聚體類化合物。但MTT 結(jié)果顯示，上述5個化合物對人肝癌細(xì)胞Hep G2 和人肺癌細(xì)胞A549 均無細(xì)胞毒活性，IC50值均大于100 μM，這也和洗脫部位的活性結(jié)果相符，說明Penicillium oxalicum 菌株次級代謝產(chǎn)物的抗腫瘤活性主要由Secalonic acid A 體現(xiàn)。苯并吡喃酮類化合物的單體及二聚體類廣泛分布于黑曲霉和鐮刀屬真菌的次級代謝產(chǎn)物中［8-11］。根據(jù)文獻(xiàn)報道，這類化合物對大鼠和小鼠的中樞神經(jīng)系統(tǒng)表現(xiàn)出急性毒性作用［12］，并且對Taq DNA 聚合酶具有抑制作用。所以其其它活性更是有待于進(jìn)一步研究。

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