陳 銳，許 群，陳 昱，李漢全，楊建遠(yuǎn)，過(guò)七根，張炳火

九江學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，九江 332000

旱蓮草是一年生草本植物，為雙子葉植物菊科鯉腸屬鯉腸(E.alba)的俗稱(chēng)，是一種重要的藥用植物［1-3］，具有促使毛發(fā)生長(zhǎng)［4］、降低血脂、防止動(dòng)脈粥樣硬化［5］、止血和治療炎癥［6-9］、滋補(bǔ)肝腎等功效，為歷版《中國(guó)藥典》收載的藥材。旱蓮草最早用于止血［6］，常用來(lái)治療陰虛血熱、吐血、血衄、尿血、血痢、崩漏下血及外傷出血等出血性病癥，是民間外傷傷口止血最常用的中草藥之一。我們研究發(fā)現(xiàn)，旱蓮草不但含有多種凝血物質(zhì)，還含有許多溶血物質(zhì)。為更好開(kāi)發(fā)豐富的旱蓮草資源，本文以活性跟蹤為指導(dǎo)，對(duì)其凝血和溶血活性成分進(jìn)行了研究，分離到6個(gè)化合物，其中3個(gè)化合物有很強(qiáng)的溶血活性，2個(gè)化合物有很強(qiáng)的凝血活性，1個(gè)化合物首次從該植物中分離獲得。

1 材料與儀器

質(zhì)譜用VG Auto Spec-3000 型質(zhì)譜儀測(cè)定;核磁共振用Bruker AV.DRX500 測(cè)定;薄層層析硅膠板和柱層析硅膠(200～300 目)均為青島海洋化工廠產(chǎn)品;大孔吸附樹(shù)脂為羅門(mén)哈斯(上海)Amberlite XAD16N;柱層析用凝膠 Sephadex LH-20 (GE Healthcare)。分離試劑均為工業(yè)重蒸試劑。

本研究所用旱蓮草(E.alba)為2012 年9 月采自江西省九江市郊區(qū)，由九江學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院廖亮教授鑒定。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 提取與分離

將干燥的旱蓮草粉碎，并用甲醇∶乙酸乙酯∶丙酮∶去離子水=1∶1∶1∶1 的混合溶劑浸泡24 h 后過(guò)濾，收集濾液，按照該方法處理3 次，合并濾液，減壓蒸餾除去濾液中的有機(jī)溶劑，得到膏狀物。在膏狀物中加入大量去離子水，并加熱至50 ℃使樣品盡可能溶解，將樣品溶液加入再生好的大孔吸附樹(shù)脂Amberlite XAD16N 中進(jìn)行吸附，吸附后先用3 倍柱體積的去離子水洗脫，再用甲醇洗脫，收集甲醇洗脫組分。利用硅膠柱色譜和凝膠柱色譜反復(fù)分離甲醇洗脫組分，得到6個(gè)化合物。在整個(gè)分離純化過(guò)程中，采用玻片溶血或凝血實(shí)驗(yàn)跟蹤活性。

2.2 溶血活性實(shí)驗(yàn)

用真空采血器(內(nèi)有抗凝劑)進(jìn)行人體靜脈采血，血液用0.9%的生理鹽水稀釋50 倍備用。用移液器定量取樣品溶液涂于潔凈的載玻片上，待溶劑揮發(fā)后用移液器取適量稀釋血液于待檢樣品上，置于顯微鏡下觀察，如果血細(xì)胞逐漸破裂則說(shuō)明樣品有溶血活性。

2.3 凝血活性實(shí)驗(yàn)

將采集的新鮮血液在10 ℃、2000 rpm 的條件下離心5 min，將血漿和血細(xì)胞分別收集，用等滲生理鹽水洗滌血細(xì)胞6 次，每次生理鹽水用量為血液體積的5 倍，再用50 倍血液體積的生理鹽水重懸紅細(xì)胞備用。用移液器定量取樣品溶液涂于潔凈的載玻片上，待溶劑揮發(fā)后用移液器分別取適量稀釋血液、血細(xì)胞生理鹽水重懸液和血漿于待檢樣品上，置于顯微鏡下觀察。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 化合物結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1 無(wú)色針晶(甲醇)，紫外線254 nm 下有暗斑，365 nm 下無(wú)吸收，碘蒸汽顯黃色，anis 顯色劑(大茴香醛顯色劑)顯紫紅色。質(zhì)譜ESI(+)-MS m/z:819［M+Na］+顯示相對(duì)分子質(zhì)量為796。13C NMR(pyridine-d5)和DEPT 顯示有7個(gè)甲基C 信號(hào)，化學(xué)位移分別為:15.8、17.2、17.7、24.7、27.4、28.4 和33.3，11個(gè)亞甲基C 信號(hào)，化學(xué)位移分別為:18.7、23.9、26.7、32.3、33.6、36.1、36.2、39.0、47.3、62.3 和63.1，16個(gè)次甲基C 信號(hào)，化學(xué)位移分別為:41.4、47.3、56.0、71.2、71.9、74.2、74.5、75.8、78.3、78.8、79.0、79.4、89.0、95.9、106.9 和122.8，8個(gè)季C 信號(hào)，化學(xué)位移分別為:30.9、37.1、39.6、40.2、42.2、49.2、144.6 和176.0，以上數(shù)據(jù)和文獻(xiàn)報(bào)道一致［10］，推斷該化合物eclalbasaponin I。

化合物2 白色粉末，紫外線254 nm 下有暗斑，365 nm 下無(wú)吸收，碘蒸汽顯黃色，anis 顯色劑顯紫紅色。質(zhì)譜ESI(+)-MS m/z:819［M+Na］+顯示相對(duì)分子質(zhì)量為796。13C NMR(pyridine-d5)和DEPT 顯示有7個(gè)甲基C 信號(hào)，化學(xué)位移分別為:15.7、16.9、17.6、24.8、27.3、28.3 和33.5，11個(gè)亞甲基C 信號(hào)，化學(xué)位移分別為:18.6、23.9、26.7、32.9、33.6、36.2、36.3、38.9、47.4、62.7 和62.8，16個(gè)次甲基C 信號(hào)，化學(xué)位移分別為:41.5、47.2、56.0、71.7、71.7、74.8、77.1、77.9、78.0、78.3、78.4、83.4、89.1、105.1、106.0 和122.4，8個(gè)季C信號(hào)，化學(xué)位移分別為:31.1、37.1、39.6、40.0、42.2、48.9、145.2 和180.1，以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道一致［10］，推斷化合物2 為eclalbasaponin IV。

化合物3 白色粉末，紫外線254 nm 下有暗斑，365 nm 下無(wú)吸收，碘蒸汽顯黃色，anis 顯色劑顯紫紅色。質(zhì)譜ESI(-)-MS m/z:713［M-H］-顯示相對(duì)分子質(zhì)量為714。13C NMR(DMSO)和DEPT 顯示有7個(gè)甲基C 信號(hào)，化學(xué)位移分別為:15.4、16.5、17.3、24.7、26.6、27.7 和33.0，10個(gè)亞甲基C 信號(hào)，化學(xué)位移分別為:18.0、23.0、25.6、31.1、32.7、34.8、35.4、34.8、46.4 和61.2，11個(gè)次甲基C 信號(hào)，化學(xué)位移分別為:40.5、46.4、55.2、70.2、73.3、76.3、76.6、79.4、88.7、102.9 和120.9，8個(gè)季C 信號(hào)，化學(xué)位移分別為:30.4、36.4、38.3、38.8、41.2、47.7、144.6 和180.6。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道一致［10］，因此推斷該化合物為eclalbasaponin V。

化合物4 白色粉末，紫外線254 nm 下有暗斑，365 nm 下無(wú)吸收，碘蒸汽顯黃色，anis 顯色劑顯黃色。質(zhì)譜ESI(-)-MS m/z:555［M -H］-顯示相對(duì)分子質(zhì)量為556。13C NMR(DMSO)和DEPT 顯示有1個(gè)甲基C 信號(hào)，化學(xué)位移為14.0，12個(gè)亞甲基C信號(hào)，化學(xué)位移分別為:22.2、24.5、28.6、28.8、28.9、29.0、29.2、31.4、33.5、54.4、65.5 和69.2，6個(gè)次甲基C 信號(hào)，化學(xué)位移分別為:67.3、68.5、72.1、73.4、74.3 和98.9，1個(gè)羰基C 信號(hào)，化學(xué)位移為173.0。1H NMR(DMSO)δ:0.82(3H)，1.20(24H)，1.47(2H)，2.26(2H)，2.49(1H)，2.57(1H)，2.88 (1H)，2.99 (1H)，3.15 (1H)，3.25(1H)，3.36 (1H)，3.71 (1H)，3.84 (1H)，3.89(1H)，3.91 (1H)，3.99 (1H)，4.55 (1H)，4.62(1H)，4.81(1H)，5.12(1H)，5.29(1H)。HSQC 顯示，1.20(24H)分屬于7個(gè)C 原子δC22.2、δC28.6、δC28.8、δC28.9、δC29.0、δC29.2和δC31.4，結(jié)合13C NMR 和COSY 相關(guān)信號(hào)發(fā)現(xiàn)，δC29.2有6個(gè)C 信號(hào)重合，因此，該化合物有17個(gè)CH2，以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致［11］，因此，推斷該化合物為3，4，5-trihydroxy-6-(2-hydroxy-3-(palmitoyloxy)propoxy)-tetrahydro-2H-pyran-yl)methanesulfonic acid。

化合物5 墨綠色粉末，紫外線254 nm 下有暗斑，365 nm 有熒光，碘蒸汽顯黃色，anis 顯色劑顯綠色。13C NMR(DMSO-d6)和DEPT 顯示有1個(gè)甲氧基C 信號(hào)，化學(xué)位移為55.8，4個(gè)次甲基C 信號(hào)，化學(xué)位移分別為:93.1、98.3、99.0 和104.6，11個(gè)季C信號(hào)，化學(xué)位移分別為:96.9、101.7、113.8、144.4、145.5、148.9、154.3、155.4、157.9、159.1 和162.4。1H NMR(DMSO-d6)δ:3.78(s，3H)，6.49(s，1H)，6.42(s，1H)，7.14(s，1H)，7.22(s，1H)。以上數(shù)據(jù)和文獻(xiàn)報(bào)道一致［12］，因此，推斷化合物5 為蟛蜞菊內(nèi)酯。

化合物6 墨綠色粉末，紫外線254 nm 下有暗斑，365 nm 有熒光，碘蒸汽顯黃色，anis 顯色劑顯綠色。13C NMR(DMSO-d6)和DEPT 顯示有4個(gè)次甲基C 信號(hào)，化學(xué)位移分別為:99.0、99.2、104.6 和161.3，11個(gè)季C 信號(hào)，化學(xué)位移分別為:94.9、95.5、100.9、113.9、144.3、145.3、148.8、155.4、155.5、158.1 和159.6。1H NMR(DMSO-d6)δ:6.37(s，1H)，6.35(s，1H)，7.14(s，1H)，7.20(s，1H)，9.92(br，1H)。以上數(shù)據(jù)和文獻(xiàn)報(bào)道一致［12］，因此，推斷化合物6 為異去甲蟛蜞菊內(nèi)酯。

3.2 溶血和凝血活性的結(jié)果

3.2.1 溶血活性

溶血活性檢測(cè)結(jié)果顯示，化合物2、3、4 均有很強(qiáng)的體外溶血活性，且呈劑量效應(yīng)(圖1)，當(dāng)樣品濃度為0.6 μg/mL 時(shí)，與不加樣品的對(duì)照組相比，它們對(duì)紅細(xì)胞的溶解率分別達(dá)到(93.52 ±1.56)%、(82.55 ±2.72)%和(94.99 ±0.68)%，化合物1、2和3 都屬于齊墩果烷型五環(huán)三萜皂甙，但是化合物1 卻沒(méi)有溶血活性，化合物2 和3 在0.1～0.4 μg/mL 時(shí)溶血活性差異不顯著，但濃度在0.5～0.6 μg/mL 時(shí)卻有極顯著差異(P＜0.01)，這說(shuō)明這些化合物中的葡萄糖殘基的數(shù)量和位置可能對(duì)溶血活性有很大影響。

圖1 化合物2、3 和4 對(duì)紅細(xì)胞的溶血效果Fig.1 The rates of hemolysis induced by compounds 2，3 and 4

3.2.2 凝血活性及機(jī)理

結(jié)果顯示，化合物5 和6 既能使全血中的紅細(xì)胞凝聚成團(tuán)，又能使充分除去血漿的紅細(xì)胞凝聚成團(tuán)，還能使血漿出現(xiàn)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)(圖2)，這說(shuō)明它們既能直接凝聚紅細(xì)胞又能導(dǎo)致纖維蛋白原轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維蛋白，再由纖維蛋白凝聚紅細(xì)胞。

圖2 化合物5 和6 對(duì)紅細(xì)胞和纖維蛋白原的影響Fig.2 The influence of compounds 5 and 6 on red blood cell and fibrinogen

4 討論

旱蓮草的凝血或止血活性受到國(guó)內(nèi)外的關(guān)注，但多數(shù)研究只涉及各種提取方法所得的粗提物，而很少涉及具體的單體化合物。蟛蜞菊內(nèi)酯和去甲蟛蜞菊內(nèi)酯是旱蓮草中含有的兩個(gè)凝血化合物，它們最早分離自金絲桃屬(HypericumHerba)［13］。本文發(fā)現(xiàn)異去甲蟛蜞菊內(nèi)酯也具有很強(qiáng)的凝血活性，這三個(gè)化合物均為香豆草醚類(lèi)，因此，旱蓮草中的香豆草醚類(lèi)化合物是其凝血活性物質(zhì)之一，這些成分可直接和間接凝聚紅細(xì)胞。

文獻(xiàn)尚未見(jiàn)旱蓮草溶血活性的報(bào)道，我們研究發(fā)現(xiàn)旱蓮草中含有大量溶血物質(zhì)，它們既可使游離的血細(xì)胞破裂，也可以使血凝塊溶解，這些溶血物質(zhì)主要是三萜皂苷類(lèi)化合物，研究結(jié)果顯示，與這類(lèi)化合物母體結(jié)構(gòu)相連的其他化學(xué)基團(tuán)的數(shù)量和位置，可能對(duì)其溶血活性有重要影響。這些溶血活性成分與旱蓮草的功能有何關(guān)系?由于能夠溶解血細(xì)胞和血凝塊，血細(xì)胞的破裂會(huì)導(dǎo)致其中的抗菌物質(zhì)和其他凝血因子迅速釋放，從而促進(jìn)止血，抑制炎癥，因此，推測(cè)這些溶血化合物與旱蓮草的止血消炎功效應(yīng)該有著重要聯(lián)系。

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