王祥 殷偉 唐云雯 殷雪 于蕾 岳才軍

摘 要：扼要綜述了植物細(xì)胞核的分離制備技術(shù)，闡述了實(shí)驗(yàn)環(huán)節(jié)的關(guān)鍵點(diǎn)，分析了制備植物細(xì)胞核存在的主要問題，并提出了解決方法。

關(guān)鍵詞：植物；細(xì)胞核；分離；純化

植物細(xì)胞非對(duì)稱融合、染色體雜交育種、大片段基因組文庫構(gòu)建、DNA纖維制備、細(xì)胞核中DNA、RNA、蛋白質(zhì)含量的分析及染色質(zhì)結(jié)構(gòu)分析等，需要分離純化出較多個(gè)體完整，分散較好的細(xì)胞核。學(xué)者們?cè)鴩L試用不同方法進(jìn)行植物細(xì)胞核的分離，比如大豆、玉米、水稻、煙草、小麥、棉花、長春花、杉木等細(xì)胞核的分離或純化近來又有過報(bào)道[1-7]，但由于不同植物材料由于結(jié)構(gòu)和組分的不同，所以適合一種植物的細(xì)胞核制備方法并不適合于其它植物。本文就一些分離純化植物細(xì)胞核的方法進(jìn)行探討。

對(duì)動(dòng)物細(xì)胞核的分離純化已經(jīng)有了比較好的方案可查，然而對(duì)植物細(xì)胞卻不盡然。主要是由于植物細(xì)胞在結(jié)構(gòu)與內(nèi)含物等方面顯著不同于動(dòng)物細(xì)胞，植物細(xì)胞除了具有細(xì)胞壁外，還含有胞間連絲和次生代謝物，這就給細(xì)胞核的制備增加了難度。分離純化細(xì)胞核需要在材料選擇、預(yù)處理、提取液選擇、細(xì)胞的破碎方法及純化方法上做綜合考慮。

1 材料選擇

制備植物細(xì)胞核一般可以選擇愈傷組織、下胚軸、子葉、懸浮培養(yǎng)細(xì)胞和葉片等材料，其中選擇后者居多。然而，愈傷組織和懸浮培養(yǎng)細(xì)胞有著自身的優(yōu)越性。愈傷組織和懸浮培養(yǎng)細(xì)胞取材方便，本身就是無菌材料更便于做融合、雜交試驗(yàn)。離體培養(yǎng)的植物細(xì)胞更易于進(jìn)行同步化處理，且黑暗下培養(yǎng)的細(xì)胞基本不含葉綠體，這些都便于核的純化。

2 預(yù)處理

處于不同細(xì)胞周期的細(xì)胞核的大小是不同的，體積可相差幾倍之多，為了便于純化、提高收率，可先將用于制備細(xì)胞核的植物材料進(jìn)行同步化處理。通常可采用低溫（用冰水混合物）培養(yǎng)12h-48h的物理方法；也可采用使用羥基脲、8-羥基喹啉（0.001M-0.004M）或秋水仙素（0.01%-0.5%）的化學(xué)方法，處理時(shí)間在4h-24h。對(duì)于離體培養(yǎng)材料，還可以盡量縮短繼代的周期使得細(xì)胞經(jīng)常處于對(duì)數(shù)增殖期的辦法使細(xì)胞核盡可能均勻一致。對(duì)于懸浮培養(yǎng)細(xì)胞還應(yīng)在破碎細(xì)胞之前去除漂浮的已自溶的細(xì)胞碎片等雜質(zhì)。

3 細(xì)胞破碎方法

主要有研磨法、刀切法、酸解法和酶解法。研磨法提取植物細(xì)胞核， 在研磨過程中酚類等物質(zhì)易氧化， 不可避免的對(duì)提取細(xì)胞核產(chǎn)生影響， 細(xì)胞核提取質(zhì)量不高。研磨時(shí)間長短和力度大小難以掌握，致使很多細(xì)胞核被破壞， 產(chǎn)率較低。刀切法，一種是用剪刀將葉片快速剪碎，另一種是用鋒利刀片在放置于冰上的培養(yǎng)皿中于將葉片切碎至盡量細(xì)小的勻漿狀。刀切法的操作手法也不容易保持一致，不適用于愈傷組織、懸浮細(xì)胞和根莖尖等材料。酸解法一般采用1M-3M鹽酸解離細(xì)胞。酸解法效果不穩(wěn)定。酶解法是利用纖維素酶、果膠酶和/或半纖維素酶等處理細(xì)胞。酶濃度在0.5%-2%，纖維素酶濃度高于果膠酶，半纖維素酶有助于純化過程，不添加也可。使用蝸牛酶沒有看到更好的結(jié)果。酶解時(shí)間為4h-24h。酶解法可以先得到原生質(zhì)體，再通過擠壓低滲漲破質(zhì)膜或添加表面活性劑溶膜而釋放細(xì)胞核，也可以不收集原生質(zhì)體，一步實(shí)現(xiàn)收獲細(xì)胞核，而且不必使用表面活性劑，這時(shí)需要延長酶解時(shí)間（12h左右）并使材料處于震蕩當(dāng)中。利用酶解法制備植物細(xì)胞核收獲量較大，當(dāng)然收獲量的大小還與所用的提取液（酶解液）的其它成分密切相關(guān)。

4 提取液

可以使用緩沖鹽或非緩沖鹽。緩沖鹽常被選用的包括Tris、MES、HEPES、MOPS和檸檬酸等，濃度在0.015-0.2M，pH7.0-8.0居多，也有使用pH2.0-3.0的。提取液中可選擇添加的成分比較多，比如Mg2+、K+、Na+、精胺、TritonX-100、Tween20、EDTA、葡萄糖、蔗糖、甘露醇、甘油、PVP、β-巰基乙醇、DTT、PMSF、抗壞血酸等。這些成份能夠穩(wěn)定核染色質(zhì)（體）、提供一定的離子強(qiáng)度、維持滲透壓、促進(jìn)細(xì)胞核釋放，移走細(xì)胞質(zhì)，分散葉綠體，減少核粘連、防止細(xì)胞核被氧化、減輕酚類等次生物質(zhì)的干擾，提高細(xì)胞核質(zhì)量。這些成份用量在0.1mM-0.6M，其中糖類物質(zhì)用量大。

5 分離純化方法

過濾、差速離心和密度梯度離心是最常用的方法。細(xì)胞破碎以后通常需要過濾。過濾常利用不銹鋼、尼龍網(wǎng)（120目-400目）和過濾棉等。差速離心需多次反復(fù)沉淀和再懸浮，容易使核破裂。沉淀核的離心速度很低即可，如果離心時(shí)間過長和速度過高， 雖然會(huì)提高核的產(chǎn)量， 但也會(huì)增加其他非核材料的沾染。密度梯度溶液多用蔗糖、甘露醇和Percoll。濃度高的蔗糖溶液是非常粘的， 而且這種溶液的粘度受蔗糖含量的增加影響大，濃度高的蔗糖溶液濃度的小的改變對(duì)核的沉淀速度會(huì)產(chǎn)生很大的影響，所以用蔗糖作梯度離心純化細(xì)胞核需格外小心。甘露醇溶液用粘度沒有蔗糖高，但同密度情況下，甘露醇溶液的滲透壓要高于蔗糖溶液的，這也是需要注意的，以免核皺縮。Percoll是較好的介質(zhì)，只是價(jià)格偏高。低速離心（500×g 左右），細(xì)胞核集中30%、35%的蔗糖界面較多。

6 存在主要問題及解決措施

植物細(xì)胞核提取遇到的主要問題有雜質(zhì)多、核與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等粘連成網(wǎng)、容易破裂。雜質(zhì)主要來自細(xì)胞壁、膜碎片和細(xì)胞質(zhì)成分。過濾可以去除一些雜質(zhì)，但嚴(yán)重降低核的收率，一方面網(wǎng)篩的大小不好選擇，另一方面導(dǎo)致細(xì)胞核破裂，特別是使用抽濾。圖1告訴我們植物細(xì)胞核膜連著一些網(wǎng)狀的細(xì)胞成分，篩孔小了，它過不去，篩孔大了，大的雜質(zhì)就會(huì)多。如果將通過化學(xué)的方法將與膜連接的成分盡量去除，發(fā)現(xiàn)核又非常容易破損，即使是蓋玻片輕輕的一壓（見圖2）。因此，對(duì)于與核膜連接的成分，既要去除，又要不能傷及核膜。減輕核與其它細(xì)胞成分粘連方法，可以考慮使用偏酸性的提取液、酶，不建議使用表面活性劑。低速離心甚至靜止片刻（相當(dāng)于1×g的離心）是較好的初步去除雜質(zhì)的方法，精細(xì)去除雜質(zhì)則需要進(jìn)行梯度離心了。對(duì)于核容易破裂的問題，可以考慮使用一些膜的保護(hù)試劑，特別是在純化的后期，比如葡聚糖硫酸鉀、葡聚糖、蔗聚糖、2-（N-嗎啉）-乙烷磺酸、氯化鈣、磷酸二氫鉀等，同時(shí)注意提取純化過程中溶液酸堿度的穩(wěn)定，離心時(shí)盡量不使細(xì)胞核沉到離心管底部，而用蔗糖等溶液托住更好。

總之，植物細(xì)胞核的提取純化目前還沒有普遍適用的方法，探索適用不同植物、不同材料的核提取純化方法還是需要研究的工作。

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作者簡介：王祥，黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院 2010級(jí)生物技術(shù)專業(yè)本科生。

*通訊作者：岳才軍