蔣林峰，張新全 ，黃琳凱，馬嘯，嚴(yán)德飛，胡強(qiáng)，付玉鳳

(1．四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院草業(yè)科學(xué)系，四川雅安625014;2．重慶市墊江縣畜牧生產(chǎn)站，重慶408300)

目標(biāo)起始密碼子多態(tài)性(start codon targeted polymorphism，SCoT)，是基于SRAP(sequence-related amplified polymorphism，相關(guān)擴(kuò)增多態(tài)性)［1］的一種新型目的基因分子標(biāo)記技術(shù)，其產(chǎn)生的顯性多態(tài)性偏向候選功能基因區(qū)［2］。主要依據(jù)植物基因中ATG翻譯起始位點(diǎn)側(cè)翼序列的保守性而設(shè)計(jì)［3-4］。另外，較高退火溫度的設(shè)計(jì)有助于減少假陽性擴(kuò)增的可能性［5］。與其他標(biāo)記相比，SCoT標(biāo)記結(jié)合了ISSR(inter simple sequence repeat，簡(jiǎn)單重復(fù)序列間區(qū))［6-7］和RAPD(randomly amplified polymorphic DNA，隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA)的優(yōu)點(diǎn)，具引物通用性，穩(wěn)定性好，重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)能有效產(chǎn)生相關(guān)性狀多態(tài)，更好地反映物種遺傳多樣性和親緣關(guān)系［8］。自2009年開發(fā)以來，已有其用于葡萄(Vitis vinifera)［9］、芒果(Mangifera indica)［10］、花生(Arachis hypogaea)［11］、土豆(Solanum tuberosum)［12］等農(nóng)作物和植物的相關(guān)研究報(bào)道。但就牧草研究領(lǐng)域，目前僅有SCoT標(biāo)記用于苜蓿(Medicago sativa)［4］種質(zhì)遺傳分析的少量報(bào)道。

鴨茅(Dactylis glomerata)為禾本科(Poaceae)早熟禾亞科(Pooideae)鴨茅屬(Dactylis)多年生疏叢型禾草［13-14］，是鴨茅亞種中重要的同源四倍體栽培種［15］，起源于歐洲、北非和亞洲溫帶地區(qū)［16］，因草質(zhì)柔嫩、葉量豐富、耐蔭性強(qiáng)、適口性好等優(yōu)點(diǎn)，在世界各地被廣泛應(yīng)用于飼草栽培和干草制作［17］，是溫帶和亞熱帶地區(qū)重要優(yōu)良牧草。我國(guó)是鴨茅起源地之一，已發(fā)現(xiàn)野生鴨茅生長(zhǎng)地約26個(gè)［18］，可分為二倍體(2n=2x=14)、四倍體(2n=4x=28)及稀有的六倍體(2n=6x=42)3種類型［19］，近年來，鴨茅大量應(yīng)用于我國(guó)草地畜牧業(yè)及生態(tài)建設(shè)，取得了良好的經(jīng)濟(jì)和生態(tài)效益。

到目前，我國(guó)審定登記鴨茅品種僅為8個(gè)，且只有“寶興”、“川東”、“古藺”3個(gè)品種通過野生栽培馴化而來，其余5個(gè)皆為引進(jìn)品種，國(guó)內(nèi)鴨茅品種遺傳基礎(chǔ)相對(duì)狹窄，引進(jìn)品種普遍表現(xiàn)出在當(dāng)?shù)乜剐缘汀⑦m應(yīng)性差等缺點(diǎn)，難以滿足我國(guó)生態(tài)治理和畜牧業(yè)發(fā)展的需求。采用不同的育種方法，綜合選育利用我國(guó)豐富的鴨茅種質(zhì)資源已經(jīng)刻不容緩。而縱觀全球，國(guó)外通過不同的選育目標(biāo)和育種方式已獲得近500個(gè)鴨茅品種，品種適應(yīng)性強(qiáng)。采用不同的技術(shù)手段開展鴨茅種質(zhì)遺傳研究，對(duì)于鴨茅育種具有重要意義。同時(shí)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)鴨茅的研究已從形態(tài)學(xué)［20］、細(xì)胞學(xué)［21］、同工酶［22］深入到分子水平。分子標(biāo)記因不受環(huán)境影響、效率快、分辨率高等優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用。謝文剛等［23］利用SSR(simple sequence repeat，簡(jiǎn)單重復(fù)序列)對(duì)11份鴨茅種質(zhì)的110個(gè)單株遺傳分析表明，我國(guó)西南地區(qū)鴨茅種質(zhì)遺傳多樣性豐富，其遺傳變異主要存在于種質(zhì)內(nèi)和地理區(qū)域內(nèi);Peng等［24］利用AFLP(amplified fragment length polymorphism，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性)對(duì)32份鴨茅分析表明，鴨茅遺傳多樣性與染色體倍性、地理分布等顯著相關(guān);萬剛等［25］對(duì)23份鴨茅二倍體、四倍體SSR研究表明，四倍體較二倍體遺傳多樣性更為豐富，是鴨茅品種選育的優(yōu)良材料。這些研究主要集中于鴨茅野生材料、栽培馴化品種等的研究，但對(duì)于鴨茅國(guó)內(nèi)栽培馴化品種與引進(jìn)品種的遺傳變異對(duì)比研究，國(guó)內(nèi)外均未有報(bào)道。了解我國(guó)現(xiàn)有鴨茅栽培馴化品種的遺傳背景和變異，有助于保證我國(guó)鴨茅種質(zhì)資源的合理利用和豐富我國(guó)鴨茅野生馴化栽培馴化品種的遺傳多樣性。

本研究首次利用SCoT標(biāo)記技術(shù)對(duì)來自世界4大洲的32個(gè)鴨茅品種進(jìn)行遺傳變異分析，比較栽培馴化品種與引進(jìn)品種之間的遺傳差異，以期為進(jìn)一步加快我國(guó)鴨茅育種進(jìn)程和針對(duì)性提高鴨茅品種生態(tài)適應(yīng)能力及利用價(jià)值等提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 試驗(yàn)材料

供試材料為32個(gè)鴨茅品種，包括8個(gè)國(guó)內(nèi)栽培馴化品種(系)和24個(gè)國(guó)外引進(jìn)品種，均為四川農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)科學(xué)系從國(guó)內(nèi)及國(guó)外采集和收集而來(表1)，于2012年9月種植于四川農(nóng)業(yè)大學(xué)雅安草業(yè)科學(xué)試驗(yàn)基地。

1．2 方法

1．2．1 DNA提取 每份種質(zhì)隨機(jī)選取25個(gè)單株的幼嫩葉片等量混合，采用Doyle等［26］的CTAB(cetyl trimethyl ammonium bromide，十六烷基三甲基溴化銨)法提取DNA，并用1%瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)分別檢測(cè)其DNA的純度和濃度，合格的樣品保存于－20℃低溫冰箱，實(shí)驗(yàn)開始時(shí)，取出部分按照其測(cè)得濃度稀釋至10 ng/μL，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1．2．2 SCoT引物篩選 所用80個(gè)SCoT引物由澳大利亞Collard和Mackill［3］(SCoT1～SCoT36)及中國(guó)廣西農(nóng)業(yè)大學(xué)Luo等［5］(SCoT37～SCoT80)提供，引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。PCR所用Mix混合液(含有10×PCR buffer、Mg2+、dNTPs)和Taq酶均購(gòu)自天根科技生化公司。采用田間形態(tài)差異較大的4個(gè)品種，即栽培馴化品種“寶興”、引進(jìn)品種“安巴”、“Chinook”和新品系“YA01472”，對(duì)引物進(jìn)行預(yù)先篩選，從中選取擴(kuò)增條帶清晰且重復(fù)性較好的22個(gè)SCoT引物，用于供試32個(gè)鴨茅品種的進(jìn)一步PCR擴(kuò)增(表2)。

1．2．3 SCoT-PCR擴(kuò)增 本實(shí)驗(yàn)PCR程序參考植物水稻(Oryza sativa)［3］和牧草苜蓿［4］并有所改動(dòng)，擴(kuò)增體系優(yōu)化為15 μL:包括DNA 模板1 μL(10 ng/μL)，引物1．5 μL(10 pmol/μL)，Mix混合液7．5 μL，Taq酶0．4 μL(2．5 U/μL)，ddH2O 4．6 μL。PCR 反應(yīng)程序?yàn)?4℃預(yù)變性3 min;94℃變性50 s，50℃退火1 min，72℃延伸2 min，36個(gè)循環(huán);72℃延伸5 min，最后冷卻至4℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在含0．05μL/mL Gelred(10000×水溶液)的1．8%瓊脂糖凝膠中電泳，待溴酚藍(lán)電泳至凝膠尾端約1 cm時(shí)停止電泳，約需2．5～3．0 h。電泳完畢觀察，再用凝膠成像系統(tǒng)拍照。

1．2．4 數(shù)據(jù)分析 SCoT是顯性標(biāo)記，對(duì)獲得的清晰可重復(fù)的DNA條帶進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，在相同遷移位置上將穩(wěn)定出現(xiàn)的條帶的有或無賦值為1和0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，構(gòu)成原始數(shù)據(jù)矩陣。利用軟件Excel 2007和POPGENE 1．31［27］計(jì)算多態(tài)性條帶百分比(percentage of polymorphic bands，PPB)，Nei氏遺傳多樣性指數(shù)(Nei’s gene diversity，H)［28］和Shannon信息多樣性指數(shù)(Shannon’s information index of diversity，I)。利用WINAMOVA 1．55對(duì)國(guó)內(nèi)栽培馴化品種與引進(jìn)品種的遺傳變異進(jìn)行分子方差分析(analysis ofmolecular variance，AMOVA)［29］。POPGENE和AMOVA數(shù)據(jù)輸入文件均由軟件 DCFA1．1［30］生成。利用軟件 FreeTree［31］基于 Nei-Li［32］遺傳相似系數(shù)(genetic similarity，GS)的不加權(quán)成對(duì)群算術(shù)平均法(unweighted pair-group method with arithmetic averages，UPGMA)計(jì)算各品種的遺傳距離(genetic distance，GD)，按公式GD=1－GS計(jì)算。采用Dendroscope 3［33］構(gòu)建各品種的聚類樹，利用NTsyspc V2．1［34］進(jìn)行鴨茅品種的主成分分析(principal coordinate analysis，PCoA)。

表1 供試?guó)喢┎牧厦Q及來源Table 1 Names and sources of D．glomerata used in this study

2 結(jié)果與分析

2．1 SCoT標(biāo)記多態(tài)性分析

22個(gè)引物共擴(kuò)增出308條清晰可辨條帶，擴(kuò)增片段大小在250～2000 bp，大部分集中在250～1500 bp(圖1)，平均每個(gè)引物擴(kuò)增條帶數(shù)為14條，條帶變化為9條(SCoT8，SCoT9和SCoT20)到19條(SCoT40)，其中，多態(tài)性譜帶245條，平均每個(gè)引物擴(kuò)增多態(tài)性條帶數(shù)為11．14條，多態(tài)性比率(PPB)為79．55%，多態(tài)性條帶變化為5條(SCoT9，SCoT11和SCoT12)到18條(SCoT65)，表明SCoT標(biāo)記能檢測(cè)到較多的遺傳位點(diǎn)，獲得多態(tài)性較好的PCR結(jié)果(表3)。

圖1 引物SCoT 23對(duì)鴨茅品種的擴(kuò)增結(jié)果Fig．1 Am plified resultsw ith primer No．SCoT 23 on orchardgrass varieties

2．2 供試?guó)喢┢贩N遺傳距離(GD)分析

根據(jù)0，1原始數(shù)據(jù)表征矩陣，利用軟件Freetree［31］基于Nei-Li遺傳相似系數(shù)得到供試?guó)喢┢贩N的遺傳距離，用于分析其相互之間的親緣關(guān)系。32份鴨茅品種遺傳距離范圍為0．0251～0．3157，平均遺傳距離為0．1916，其中來自法國(guó)的Cristobal和來自捷克的Intensiv遺傳距離最大，表明其之間的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，來自匈牙利的Georgikon和來自波蘭的Nika遺傳距離最小，表明其親緣關(guān)系最近?？傮w上遺傳距離的差異呈現(xiàn)了不同供試?guó)喢┢贩N來源地的分布差異，品種間遺傳差異較大。將所有品種按照育種背景劃分為國(guó)內(nèi)栽培馴化品種和國(guó)外引進(jìn)品種，可以進(jìn)一步分析2種選育背景下不同鴨茅品種之間的遺傳分化和差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)栽培馴化品種內(nèi)部的遺傳距離范圍為0．0601～0．1802，平均遺傳距離為0．1242，其中“寶興”和“川東”遺傳距離最小，其都為國(guó)審栽培馴化品種，“YA01472”和“YA02-116”遺傳距離最大，其為鴨茅栽培馴化新品系，表明目前國(guó)內(nèi)登記的鴨茅栽培馴化品種間遺傳相似度較高，新品系“YA01472”和“YA02-116”遺傳多樣性較已經(jīng)登記的栽培馴化品種(“寶興”、“古藺”、“川東”)有所提高;而引進(jìn)品種內(nèi)部的遺傳距離范圍為0．0251～0．3157，平均遺傳距離為0．1952，可見國(guó)內(nèi)栽培馴化品種的遺傳多樣性水平低于引進(jìn)品種。

2．3 鴨茅類群的遺傳變異比較分析

將32份鴨茅品種劃分為栽培馴化品種類群和國(guó)外引進(jìn)品種類群，比較他們之間的遺傳變異。采用軟件AMOVA 1．55［29］分析其類群之間和之內(nèi)的方差、方差分量及貢獻(xiàn)率(表 4)，采用 POPGENE version 1．32［27］分析其類群的遺傳多樣性和反應(yīng)其類群的等位基因豐富度和均勻程度(表5)。分子方差分析(AMOVA)結(jié)果表明，16．32%的遺傳變異存在于兩類群之間，兩類群之內(nèi)的遺傳變異較高，占有83．68%，2種品種類群之間和之內(nèi)的差異均極顯著(P＜0．001)。此外，供試?guó)喢┢贩N類群間的表型預(yù)測(cè)(Фst)值為0．1630，也說明遺傳結(jié)構(gòu)的變異主要存在于品種類群之內(nèi)。由表5可知，供試?guó)喢┢贩N基因多樣性指數(shù)為0．2646，Shannon指數(shù)為0．3983。其中引進(jìn)品種的多態(tài)性條帶(NPB)，多態(tài)性比率(PPB)，基因多樣性指數(shù)(H)，Shannon指數(shù)(I)都高于栽培馴化品種，基本代表了鴨茅物種的整體遺傳水平，與2．2中分析的遺傳距離分析結(jié)果相符合，說明鴨茅引進(jìn)品種較目前國(guó)內(nèi)普遍存在的栽培馴化品種有更為豐富的遺傳多樣性和變異水平，這可能是國(guó)外品種選育方法和選育材料較為多元化的結(jié)果。

2．4 基于Nei-Li遺傳相似系數(shù)的聚類分析

利用Freetree［31］軟件計(jì)算出供試各鴨茅品種間的Nei氏遺傳一致度和遺傳距離的無偏估計(jì)值，然后用Dendroscope 3［33］繪制 UPGMA 聚類圖?？傮w看來，供試32份鴨茅品種主要可分為6類(圖2)。類群I有8個(gè)品種(系)，包括來自中國(guó)的3個(gè)栽培馴化品種(“寶興”、“古藺”、“川東”)和 5個(gè)野生馴化新品系(“YA79-9”、“YA01-103”、“YA02-116”、“YA01175”、“YA01472”);類群II包括3個(gè)品種，即來自大洋洲的“Gippsland”、“草地瓦納”和“Akaroa”;類群 VI包括 8個(gè)品種，即來自歐洲的“Georgikon”、“Nika”、“Weihenstephaner”、“金?！薄ⅰ暗录{塔”、“大拿”、“Asta”和“Intensiv”;類群 III包括來自南美洲的 3個(gè)品種(“Hawk”、“遠(yuǎn)航”、“Oron”)及來自歐洲的 6 個(gè)品種(“Krasnodarskaya”、“Frode”、“安巴”、“波特”、“斯巴達(dá)”、“阿索斯”);其余2個(gè)類群(IV和V)包括了來自歐洲的其余供試?guó)喢┢贩N。由聚類分析可知，目前國(guó)內(nèi)已經(jīng)登記的鴨茅栽培馴化品種間具有一定的遺傳相似度，遺傳距離較近，3個(gè)品種(“古藺”、“寶興”、“川東”)育成登記時(shí)間分別為1995，1999和2003年，可能由當(dāng)時(shí)較為簡(jiǎn)單的選育方法、相似的生態(tài)地理環(huán)境等原因?qū)е?，而新品系“YA02-116”較之前栽培馴化品種有所改善，但遺傳變異仍較為狹窄，這與前面的分析結(jié)果一致，可能是由于不同生境材料混合采樣及選育過程中混合選擇等原因;而反觀國(guó)外選育的品種，其大多數(shù)為綜合品種，其同一來源的品種間存在較大的遺傳距離和遺傳差異，但總體上供試品種的聚類與地理分布存在一定的相關(guān)性，且其品種繼承了更為豐富的遺傳多樣性和更為一致的群體一致性，利于品種的推廣和應(yīng)用。

表3 SCoT標(biāo)記擴(kuò)增結(jié)果Table 3 Amp lified results of SCoT markers

2．5 主成分分析

主成分分析(PCoA)可作為種質(zhì)聚類分析結(jié)果的驗(yàn)證和對(duì)比，同時(shí)各種質(zhì)在主成分分析二維或三維圖上的遠(yuǎn)近關(guān)系可以更為直觀的反映它們之間的親緣關(guān)系和遺傳差異。利用原始矩陣數(shù)據(jù)基于遺傳相似系數(shù)(GS)，用NTsys-pc V2．1［34］軟件對(duì)供試32份鴨茅品種進(jìn)行主成分分析，前3個(gè)主成分所能解釋的遺傳變異為46．08%，并根據(jù)第一、第三主成分進(jìn)行作圖(圖3)。主成分結(jié)果與聚類分析結(jié)果基本一致，整體上顯示出國(guó)內(nèi)的栽培馴化品種(系)，尤其是3個(gè)國(guó)審鴨茅栽培馴化品種間親緣關(guān)系較近，遺傳豐富度和遺傳變異水平較引進(jìn)品種稍差，通過栽培馴化品種和引進(jìn)品種遺傳變異的對(duì)比，反思目前國(guó)內(nèi)普遍使用的選育手段是否具有代表性、品種遺傳一致度是否較好等問題，對(duì)于今后我國(guó)的鴨茅新品種選育工作和加快鴨茅育種進(jìn)程具有一定的指導(dǎo)意義。

表4 鴨茅品種分子變異方差分析(AMOVA)Table 4 Analysis ofmolecular variance(AMOVA)for variety of orchardgrass

表5 2種品種類群遺傳多樣性指數(shù)Table 5 Genetic diversity index of two varieties groups

3 討論

3．1 SCoT標(biāo)記的多態(tài)性

SCoT標(biāo)記是一種基于翻譯起始位點(diǎn)(translation initiation site，TIS)的目標(biāo)分子標(biāo)記新技術(shù)，具有操作簡(jiǎn)單、引物通用性、多態(tài)性高、成本低、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)［2］，其較多的基因組基因形成了較多的引物結(jié)合位點(diǎn)，且其單引物的設(shè)計(jì)，使得那些較近而又反向結(jié)合的引物結(jié)合位點(diǎn)之間的片段得以有效擴(kuò)增。擴(kuò)增不確定性介于外顯子與內(nèi)含子之間，大幅度地提升了其引物的多態(tài)性［8］。較其他分子標(biāo)記(AFLP，ISSR，SSR，SRAP，RAPD等)，其與功能基因相關(guān)，更能反應(yīng)相關(guān)功能性狀多態(tài)［11］，是用于農(nóng)作物、水果和牧草等植物種質(zhì)資源鑒定、保護(hù)和利用，高密度遺傳連鎖圖譜構(gòu)建，分子標(biāo)記輔助育種，基因定位和克隆等研究的非常有效的一種分子標(biāo)記。

本研究首次將SCoT標(biāo)記技術(shù)應(yīng)用于鴨茅品種的DNA多態(tài)性鑒定，其能在鴨茅品種資源中檢測(cè)出較豐富的遺傳多態(tài)性，這與鴨茅品種資源間具有較豐富的表型性狀多態(tài)性相一致。擴(kuò)增平均多態(tài)性條帶為11．14條，而謝文剛等［23］使用SSR標(biāo)記對(duì)來自中國(guó)西南地區(qū)鴨茅的遺傳多樣性研究多態(tài)性條帶為6．8條，Guo等［9］采用SCoT標(biāo)記對(duì)64份葡萄品種研究的多態(tài)性條帶為7．7條，可見SCoT標(biāo)記能夠產(chǎn)生較多的多態(tài)位點(diǎn)用于鴨茅遺傳變異研究。另外，其多態(tài)性位點(diǎn)率為79．55%，而Luo等［5］采用SCoT標(biāo)記對(duì)來自中國(guó)的50份芒果種質(zhì)研究的多態(tài)性為76．19%，Luo等［35］采用ISSR標(biāo)記對(duì)23份芒果種質(zhì)分析的多態(tài)性為55．77%，熊發(fā)前等［8］對(duì)花生屬采用與功能基因相關(guān)的SCoT研究多態(tài)性為31．80%，韓國(guó)輝等［2］對(duì)柑橘(Citrus)SCoT研究多態(tài)性為54．80%，由此可知，SCoT標(biāo)記可以作為研究鴨茅遺傳多樣性的有效手段，其得到的分子標(biāo)記極有可能是功能基因的一部分，是進(jìn)一步開發(fā)特定功能基因標(biāo)記和建立分子標(biāo)記輔助育種技術(shù)體系的基礎(chǔ)。

3．2 鴨茅栽培馴化品種與引進(jìn)品種遺傳差異

圖2 SCoT標(biāo)記對(duì)32份鴨茅品種親緣關(guān)系聚類圖Fig．2 Dendrogram of the relationship UPGMA cluster of 32 orchardgrass varieties based on SCoT markers

本研究采用SCoT標(biāo)記技術(shù)開展鴨茅栽培馴化品種與引進(jìn)品種的遺傳變異比較，研究表明，國(guó)內(nèi)鴨茅栽培馴化品種平均遺傳距離為0．1242，多態(tài)性條帶為135條，基因多樣性指數(shù)為0．1596，Shannon指數(shù)為0．2383，而鴨茅引進(jìn)品種的遺傳多樣性從以上幾個(gè)水平都遠(yuǎn)高于栽培馴化品種，基本代表了鴨茅物種的遺傳變異水平。從側(cè)面揭示了目前國(guó)內(nèi)鴨茅品種遺傳基礎(chǔ)狹窄的現(xiàn)狀。通過分子方差分析表明，鴨茅栽培馴化品種和引進(jìn)品種2個(gè)類群的遺傳變異主要還是分布于類群內(nèi)部，尤其是引進(jìn)品種內(nèi)部的不同鴨茅品種間具有更為豐富的遺傳差異。聚類分析和主成分分析的結(jié)果基本一致，供試32個(gè)鴨茅品種主要可分為6類，其中來自國(guó)內(nèi)的8個(gè)栽培馴化品種聚為類群I，進(jìn)一步印證了目前國(guó)內(nèi)鴨茅栽培馴化品種內(nèi)部遺傳變異較小的瓶頸。這與萬剛等［25］的研究結(jié)果一致，認(rèn)為3個(gè)國(guó)內(nèi)栽培馴化品種(“寶興”、“川東”、“古藺”)間的遺傳變異較為狹窄，可能是緣于3個(gè)鴨茅栽培馴化品種采集地相似的自然氣候地理?xiàng)l件和較為傳統(tǒng)的育種方式等原因。

總的來說，就鴨茅栽培馴化品種和引進(jìn)品種的遺傳分化而言，引進(jìn)品種和國(guó)內(nèi)栽培馴化品種間差異較大，引進(jìn)品種的遺傳多樣性更為豐富，而栽培馴化品種相對(duì)來說整齊度差，品種結(jié)實(shí)性差，適應(yīng)范圍小。究其原因，可能是國(guó)外鴨茅育種家在育種方法和育種材料的選擇上，較國(guó)內(nèi)科研單位更為先進(jìn)和合理，其針對(duì)性強(qiáng)，工作延續(xù)性強(qiáng)，選育時(shí)間長(zhǎng)，品種性狀更為穩(wěn)定。目前采用較多的是選擇在各方面性狀表現(xiàn)較為優(yōu)良的不同材料，讓其自由傳粉，經(jīng)過多代選擇和淘汰，并采取一定的育種手段，使優(yōu)良基因得到穩(wěn)定遺傳，這樣選育得到的品種具有較為豐富的遺傳多樣性和較大的生境適應(yīng)能力，及更為穩(wěn)定的群體一致性。

3．3 鴨茅新品種選育及其利用

圖3 基于SCoT譜型的32份鴨茅品種主成分分析Fig．3 Principal component analysis based on SCoT patterns in 32 orchardgrass varieties

我國(guó)是鴨茅的主要起源地之一，具有包括二倍體、四倍體和六倍體的野生鴨茅分布地26個(gè)［18-19］，大量的研究表明我國(guó)野生鴨茅種質(zhì)資源遺傳多樣性豐富。謝文剛等［23］對(duì)西南區(qū)鴨茅種質(zhì)研究也表明我國(guó)鴨茅野生種質(zhì)資源豐富，保持了較大的變異度和遺傳多樣性;萬剛等［25］對(duì)鴨茅栽培馴化品種與野生材料遺傳多樣性的SSR研究分析表明，我國(guó)目前推廣應(yīng)用的鴨茅栽培馴化品種少且遺傳基礎(chǔ)狹窄，而我國(guó)的野生鴨茅種質(zhì)資源具有豐富的遺傳多樣性，可通過開展相關(guān)的雜交篩選等工作，選育出能夠滿足我國(guó)不同生態(tài)條件下的鴨茅品種。Peng等［24］和鐘聲［20］的研究同樣也證明了上述結(jié)論。本研究表明，鴨茅引進(jìn)品種基因多樣性指數(shù)等指標(biāo)都高于栽培馴化品種。同時(shí)，目前國(guó)外已登記鴨茅品種達(dá)500個(gè)，在今后我國(guó)的鴨茅新品種選育策略上，應(yīng)更多的針對(duì)于不同倍性、抗病、抗旱、葉量、適應(yīng)性等特性進(jìn)行雜交親本材料選擇，特別是在鴨茅易感的銹病等癥狀方面，選出在不同特性上表現(xiàn)突出和較弱的材料進(jìn)行雜交，通過采用較為合理的育種方法，選育出適合我國(guó)不同生境生長(zhǎng)的鴨茅新品種。另外，鴨茅為高度異花授粉植物［14］，天然的雜交會(huì)引起品種內(nèi)部的分化，對(duì)于品種的有效隔離也是一個(gè)必不可少的保護(hù)措施。

［1］李杰勤，王麗華，詹秋文，等．20個(gè)黑麥草品系的SRAP遺傳多樣性分析［J］．草業(yè)學(xué)報(bào)，2013，22(2):158-164．

［2］韓國(guó)輝，向素瓊，汪衛(wèi)星，等．柑橘SCoT分子標(biāo)記技術(shù)體系的建立及其在遺傳分析中的應(yīng)用［J］．園藝學(xué)報(bào)，2011，38(7):1243-1250．

［3］Collard BCY，Mackill D J．Start codon targeted(SCoT)polymorphism:A simple，novel DNAmarker technique for generating genetargeted markers in plants［J］．Plant Molecular Biology Reporter，2009，27:86-93．

［4］何慶元，王吳斌，楊紅燕，等．利用SCoT標(biāo)記分析不同秋眠型苜蓿的遺傳多樣性［J］．草業(yè)學(xué)報(bào)，2012，21(2):133-140．

［5］Luo C，He X H，Chen H，et al．Analysis of diversity and relationships amongmango cultivars using start codon targeted(SCoT)markers［J］．Biochemical Systematics and Ecology，2010，38:1176-1184．

［6］曾漢元，魏麟，劉鵬，等．能源草蘆竹遺傳多樣性的ISSR分析［J］．草業(yè)學(xué)報(bào)，2013，22(3):266-273．

［7］曾亮，袁慶華，王方，等．冰草屬植物種質(zhì)資源遺傳多樣性的ISSR分析［J］．草業(yè)學(xué)報(bào)，2013，22(1):260-267．

［8］熊發(fā)前，蔣菁，鐘瑞春，等．目標(biāo)起始密碼子多態(tài)性(SCoT)分子標(biāo)記技術(shù)在花生屬中的應(yīng)用［J］．作物學(xué)報(bào)，2010，36(12):2055-2061．

［9］Guo D L，Zhang JY，Liu CH．Genetic diversity in some grape varieties revealed by SCoT analyses［J］．Molecular Biology Reports，2012，39:5307-5313．

［10］Luo C，He X H，Chen H，etal．Genetic relationship and diversity of Mangifera indica L．:revealed through SCoT analysis［J］．Genetic Resources and Crop Evolution，2012，59:1505-1515．

［11］Xiong FQ，Zhong R C，Han ZQ，etal．Start codon targeted polymorphism for evaluation of functional genetic variation and relationships in cultivated peanut(Arachis hypogaea L．)genotypes［J］．Molecular Biology Reports，2011，38:3487-3494．

［12］Gorji A M，Poczai P，Polgar Z，etal．Efficiency of arbitrarily amplified dominantmarkers(SCOT，ISSR and RAPD)for diagnostic fingerprinting in tetraploid potato［J］．American Journal of Potato Research，2011，88:226-237．

［13］Lindner R，Garcia A．Geographic distribution and genetic resources of Dactylis in Galicia(northwest Spain)［J］．Genetic Resources and Crop Evolution，1997，44:499-507．

［14］Bushman B S，Larson SR，Tuna M，et al．Orchardgrass(Dactylis glomerata L．)EST and SSR marker development，annotation，and transferability［J］．Theoretical and Applied Genetics，2011，123:119-129．

［15］Lumaret R．Cytology，genetics，and evolution in the genus Dactylis［J］．Critical Reviews in Plant Sciences，1988，7:55-89．

［16］Sanada Y，Tamura K，Yamada T．Relationship between water-soluble carbohydrates in falland spring and vigor of spring regrowth in orchardgrass［J］．Crop Science，2010，50:380-390．

［17］Jafari A，Naseri H．Genetic variation and correlation among yield and quality traits in cocksfoot(Dactylis glomerata L．)［J］．Journal of Agricultural Science，2007，145:599-610．

［18］彭燕，張新全．鴨茅種質(zhì)資源多樣性研究進(jìn)展［J］．植物遺傳資源學(xué)報(bào)，2003，4(2):179-183．

［19］Stebbins G L，Zohary D．Cytogenetics and Evolutionary Studies in the Genus Dactylis L．Morphology，Distribution and Interrelationships of the Diploid Subspecies［M］．California:University of California Press，1959，31:1-40．

［20］鐘聲．野生鴨茅雜交后代農(nóng)藝性狀的初步研究［J］．草業(yè)學(xué)報(bào)，2007，16(1):69-74．

［21］張新全，杜逸，鄭德誠(chéng)．鴨茅二倍體和四倍體PMC減數(shù)分裂，花粉育性及結(jié)實(shí)性的研究［J］．中國(guó)草地，1996，(6):38-40．

［22］帥素容，張新全，白史且．不同倍性鴨茅同工酶比較研究［J］．草業(yè)科學(xué)，1998，(6):11-16．

［23］謝文剛，張新全，馬嘯，等．中國(guó)西南區(qū)鴨茅種質(zhì)遺傳變異的SSR分析［J］．草業(yè)學(xué)報(bào)，2009，18(4):138-146．

［24］Peng Y，Zhang X Q，Deng Y L，et al．Evaluation of genetic diversity in wild orchardgrass(Dactylisglomerata L．)based on AFLP markers［J］．Hereditas，2008，145:174-181．

［25］萬剛，張新全，劉偉，等．鴨茅栽培馴化品種與野生材料遺傳多樣性比較的SSR分析［J］．草業(yè)學(xué)報(bào)，2010，19(6):187-196．

［26］Doyle J J，Doyle JL，Brown A H D．Analysis of a polyploid complex in glycine with chloroplast and nuclear DNA［J］．Australian Systematic Botany，1990，3:125-136．

［27］Yeh F C，Yang R C，Boyle T．POPGENE VERSION 1．31．Microsoft Windows-based Freeware for Population Genetic Analysis．Quick User Guide［M］．University of Alberta:Center for International Forestry Research，1999．

［28］Nei M．Analysis of gene diversity in subdivided populations［J］．Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，1973，70:3321-3323．

［29］Excoffier L，Smouse PE，Quattro JM．Analysis ofmolecular variance inferred from metric distances among DNA haplotypes:application to human mitochondrial DNA restriction data［J］．Genetics，1992，131(2):479-491．

［30］張富民，葛頌．群體遺傳學(xué)研究中的數(shù)據(jù)處理方法I．RAPD數(shù)據(jù)的AMOVA分析［J］．生物多樣性，2002，10:438-444．

［31］Pavlicek A，Hrda S，F(xiàn)legr J．FreeTree-free ware program for construction of phylogenetic trees on the basis of distance data and bootstrap/jackknife analysis of the tree robustness．Application in the RAPD analysis of the genus Frenkelia［J］．Folia Biologica，1999，45(3):97．

［32］NeiM，LiW H．Mathematicalmodel for studying the genetic variation in terms of restriction endonucleases［J］．Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，1979，76:5269-5273．

［33］Huson D H，Scornavacca C．Dendroscope 3:An interactive viewer for rooted phylogenetic trees and networks［J］．Systematic Biology，2012，61:1061-1067．

［34］Rohlf F J．NTSYS-pc:Numerical Taxonomy and Multivariate Analysis System，version 2．1．User Guide［M］．New York:Exeter Software，2000．

［35］Luo C，He X H，Chen H，etal．Genetic diversity ofmango cultivars estimated using SCoT and ISSRmarkers［J］．Biochemical Systematics and Ecology，2011，39:676-684．