李鈺瑩，董寬虎

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山西太谷030801)

白羊草(Bothriochloa ischaemum)是禾本科孔穎草屬叢生、具匍匐莖的多年生暖季型牧草，屬C4植物，具有高產(chǎn)、抗旱、耐牧等特點(diǎn)，是我國(guó)暖性草叢類草地的建群種，主要分布于我國(guó)暖溫帶森林草原區(qū)和落葉闊葉林區(qū)。白羊草草地是山西中南部地區(qū)低山丘陵區(qū)的主要草地類型［1］。國(guó)外早在20世紀(jì)50年代對(duì)于白羊草能進(jìn)行無(wú)融合生殖(apomixis)已有報(bào)道［2-3］，即白羊草可以不經(jīng)過(guò)雌雄性細(xì)胞的融合而產(chǎn)生有胚的種子;國(guó)內(nèi)肖輔珍和王景林［4］采用石蠟切片法和蘇木精淺染整體透明法觀察了北京地區(qū)的白羊草生殖過(guò)程，觀察到不定胚、雙胚、多胚囊以及雙苗現(xiàn)象，證實(shí)了白羊草的無(wú)融合生殖現(xiàn)象。白羊草可以進(jìn)行有性繁殖和無(wú)融合生殖［2-3，5-6］，而這2種繁殖存在資源的競(jìng)爭(zhēng)，兩者之間的權(quán)衡很大程度上受植物生理生化特性和生境條件的影響［7］，對(duì)于山西省境內(nèi)不同地域的白羊草自然狀態(tài)下的生殖特點(diǎn)還罕有報(bào)道。約在20世紀(jì)早期白羊草作為牧草引入美國(guó)［8］，白羊草現(xiàn)已廣泛分布于美國(guó)的中部和南部地區(qū)，對(duì)于白羊草的研究國(guó)內(nèi)外已做了大量的工作，主要集中在生理生態(tài)方面［9-12］，利用分子手段對(duì)白羊草的研究還罕有報(bào)道［13-14］。

簡(jiǎn)單序列重復(fù)區(qū)間(inter simple sequence repeat，ISSR)DNA分子標(biāo)記技術(shù)是Zietkiewicz等［15］于1994年提出，在PCR(polymerase chain reaction)中直接使用微衛(wèi)星序列進(jìn)行DNA擴(kuò)增［16］，具有操作簡(jiǎn)單、成本低、快速、靈敏、檢測(cè)多態(tài)性能力強(qiáng)、所需DNA模板的量少而倍受青睞。ISSR標(biāo)記在雀麥(Bromus)［17］、燕麥(Avena sativa)［18］、扁蓿豆(Melissitus)［19］和苜蓿(Medicago)［20］等牧草種質(zhì)資源的遺傳多樣性研究領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。山西省白羊草野生資源豐富，分布廣泛，是較為重要的建群種植物之一。本研究利用ISSR分子標(biāo)記對(duì)山西省內(nèi)33個(gè)自然居群白羊草進(jìn)行了遺傳多樣性研究，以期從遺傳上鑒定這些材料，為后期的育種和種質(zhì)資源的收集、保存工作奠定基礎(chǔ)，同時(shí)從分子層面揭示出山西省內(nèi)不同地域白羊草的繁殖特點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料

參試白羊草種質(zhì)資源于2010年10月采自山西境內(nèi)，共33個(gè)自然居群，各居群地理信息如表1。2011年6月種植于山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院草業(yè)科學(xué)實(shí)驗(yàn)室，待植株正常生長(zhǎng)到50 d后采樣。對(duì)不同居群，隨機(jī)收集8株以上［21］的白羊草無(wú)污染葉片均勻混合后存于－80℃冰箱備用。

1.2 方法

1.2.1 總DNA的提取與檢測(cè) 采用改良的CTAB法提取基因組DNA［16］，紫外分光光度計(jì)檢測(cè)純度，核酸分析儀測(cè)定DNA濃度。稀釋至10 ng/μL，母液于－20℃冰箱中備用［13］。

1.2.2 引物篩選 引物從哥倫比亞大學(xué)(University of British Columbia Biotechnology，UBC)提供的96條引物序列中選出25條在禾本科牧草中多態(tài)性較高的引物進(jìn)行篩選，引物由生工生物工程(上海)公司合成，其中23條引物都能擴(kuò)增出清晰的條帶。經(jīng)過(guò)綜合考慮其多態(tài)性、重復(fù)性和穩(wěn)定性，最終選出10條用于本次試驗(yàn)，引物序列如表2所示。Taq DNA酶、dNTPs、Mg2+和10×PCR Buffer購(gòu)自寶生物工程(大連)公司。

表1 山西白羊草33個(gè)種質(zhì)資源的地理位置Table 1 Geographic location of 33 B.ischaemum germplasm resources in Shanxi

表2 ISSR分析的引物序列及其擴(kuò)增結(jié)果Table 2 Primer sequence used in ISSR analyses and amplified results

1.2.3 PCR擴(kuò)增及產(chǎn)物的檢測(cè)［13］采用Eppendorf梯度PCR儀對(duì)白羊草進(jìn)行ISSR－PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增程序:94℃預(yù)變性5 min，94℃變性45 s，50～60℃(溫度隨引物不同而定)退火60 s，72℃延伸90 s，共35個(gè)循環(huán)，72℃后延伸5 min，4℃冰箱保存;反應(yīng)體系:25 μL 體系中 dNTP 0.2 mmol/L、Taq 酶1.0 U、引物0.6 μmol/L、Mg2+2.5 mmol/L、DNA 模板 30 ng、10 × PCR Buffer 2.5 μL。

擴(kuò)增產(chǎn)物用含有EB的1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離，90 V電泳1 h左右，用Bio－Rad GelDoc XR凝膠成像系統(tǒng)觀察、拍照保存。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

用Quantity One軟件選取清晰可辨的擴(kuò)增條帶進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，對(duì)于同一引物的擴(kuò)增產(chǎn)物，遷移率相同的條帶記為1個(gè)位點(diǎn)，有條帶的記為“1”，無(wú)帶的記為“0”，依次構(gòu)建原始數(shù)據(jù)矩陣。采用PopGene 32軟件計(jì)算居群間等位變異數(shù)(Na:Observed number of alleles)、有效等位基因數(shù)(Ne:Effective number of alleles)、Nei’s基因多樣性(H:Nei’s gene diversity)、Shannon 信息指數(shù)(I:Shannon’s information index)、多態(tài)位點(diǎn)比率(P:The percentage of polymorphic loci);利用NTSYSpc-2.10c軟件計(jì)算33個(gè)白羊草自然居群間遺傳距離(GD)和遺傳相似系數(shù)(GS)，然后用非加權(quán)配對(duì)算術(shù)平均法(UPGMA)構(gòu)建親緣關(guān)系聚類樹(shù)狀圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 多態(tài)性分析

本研究按最適反應(yīng)體系及程序最終篩選出10條穩(wěn)定性和重復(fù)性好、多態(tài)性較高且條帶清晰的引物，用于33份白羊草樣品的擴(kuò)增。由表2可知，10條引物中(AC)n、(AG)n、(GA)n各2條，說(shuō)明白羊草基因中可能存在大量的(AG)二核苷酸重復(fù)序列。10條引物共擴(kuò)增出99條帶，大小在200～2500 bp之間(引物UBC823擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖1)，平均每個(gè)引物擴(kuò)增出9.90條帶，平均多態(tài)性比率(P)為52.53%。其中引物UBC822的擴(kuò)增條帶為12條，多態(tài)性比率最高為75.00%;引物UBC826的擴(kuò)增條帶為12條，多態(tài)性比率最低為33.33%。33份白羊草材料的遺傳變異較穩(wěn)定，有一定的多態(tài)性，ISSR標(biāo)記能夠解釋白羊草基因組部分的信息量。

2.2 遺傳變異分析

試驗(yàn)利用PopGen 32軟件對(duì)10條引物分別擴(kuò)增33份白羊草的99條擴(kuò)增條帶進(jìn)行了分析，結(jié)果表明，等位基因數(shù)(Na)為1.5253 ±0.5019，有效等位基因數(shù)(Ne)為 1.2941 ±0.3665，Nei’s基因多樣性(H)為 0.1723 ±0.1983，Shannon信息指數(shù)(I)為0.2590±0.2841，多態(tài)性條帶比率(P)為52.53%。結(jié)果表明，山西境內(nèi)不同居群的白羊草遺傳變異較穩(wěn)定。用NTSYSpc 1.20c軟件計(jì)算白羊草自然居群間的遺傳距離(GD)，其變異為0.0200～0.1988，其中陽(yáng)高縣孤山(1)和忻府區(qū)奇村鎮(zhèn)(9)之間的遺傳距離最小，為0.0200，說(shuō)明2個(gè)居群的白羊草親緣關(guān)系最近;芮城縣中條山(20)和運(yùn)城市鹽湖區(qū)(32)之間的遺傳距離最大，為0.1988，表明2個(gè)居群的白羊草之間親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。

2.3 ISSR 聚類分析

利用NTSYSpc 1.20c軟件中的SAHN程序和UPGMA算法，根據(jù)遺傳相似系數(shù)(GS)構(gòu)建33個(gè)白羊草種質(zhì)資源遺傳關(guān)系聚類圖(圖2)，從圖2可以看出，來(lái)自不同地域條件下的33份種質(zhì)資源居群水平的遺傳多樣性較低，這也與33份材料具有較高的表觀相似性一致。如果以0.88作為相似系數(shù)分界點(diǎn)，33份材料能分成2類，16和32號(hào)分為一類，其余31份材料為一類。沁水縣胡底村(16)，運(yùn)城鹽湖區(qū)(32)為同一類，均來(lái)自晉南地區(qū);陽(yáng)高縣孤山(1)、忻府區(qū)奇村鎮(zhèn)(9)、陽(yáng)高縣重興鎮(zhèn)(15)和婁煩縣(19)，材料遺傳相似度最高，在地理位置上也距離較近都屬于晉北地區(qū)。

圖1 引物UBC823對(duì)33份材料DNA的ISSR擴(kuò)增圖Fig.1 The ISSR －PCR amplification electrophoresis of 33 DNA sample by primer UBC822

圖2 33份白羊草基于ISSR的遺傳相似性UPGMA的聚類圖Fig.2 UPGMA cluster analysis based on ISSR genetic similarity coefficient among 33 B.ischaemum materials

3 討論與結(jié)論

種質(zhì)資源遺傳變異與地理生態(tài)環(huán)境之間的關(guān)系一直是植物遺傳研究中關(guān)注的熱點(diǎn)。本研究結(jié)果顯示山西省內(nèi)白羊草居群間有一定的地域關(guān)系，但是遺傳距離和地理距離沒(méi)有顯著的相關(guān)性。這一方面符合郭敏等［22］、曾亮等［23］的聚類分析呈現(xiàn)一定地域性分布的規(guī)律;另一方面也符合孫群等［24］、俞靚等［25］得出的遺傳多樣性與地域性沒(méi)有明顯關(guān)系的規(guī)律。

Hamrick和Loveless［26］的研究表明，植物的繁育系統(tǒng)、基因流和種子擴(kuò)散機(jī)制、繁殖方式及自然選擇等因素對(duì)植物的遺傳結(jié)構(gòu)有明顯的影響。白羊草既可進(jìn)行種子繁殖(有性繁殖以及無(wú)融合生殖)［2-3，5-6］，又可進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)繁殖［9，27］，在天然草地上主要依靠營(yíng)養(yǎng)繁殖的形式實(shí)現(xiàn)種群的補(bǔ)充更新，使其成為群落中的優(yōu)勢(shì)種［9，28］。當(dāng)白羊草進(jìn)行兼性無(wú)融合生殖時(shí)，既存在基因的分離和重組，提供了可供自然選擇的遺傳變異，產(chǎn)生的新的有益基因又可經(jīng)過(guò)無(wú)融合生殖迅速占領(lǐng)某個(gè)地區(qū)，從而補(bǔ)充了因無(wú)融合生殖而降低的遺傳多樣性，提高了種群間的遺傳變異水平并降低了種群內(nèi)的遺傳差異。楊艷娟等［29］研究表明高的無(wú)融合生殖率可能是造成其種群內(nèi)遺傳多樣性較低的原因之一;姚家玲等［30］研究表明專性或高度無(wú)融合生殖個(gè)體之間，因缺乏有性生殖，沒(méi)有基因交流。雖然山西省地形較為復(fù)雜，境內(nèi)有山地、丘陵、高原、盆地、臺(tái)地等多種地貌類型，但是其總面積為15.67 km2，僅占全國(guó)總面積的1.6%。風(fēng)的驅(qū)動(dòng)和人為因素都促進(jìn)了種子的遠(yuǎn)距離傳播，增大了采樣地自然居群間的交配機(jī)會(huì)，使得山西省內(nèi)白羊草自然居群間遺傳分化較小。

ISSR分子標(biāo)記是一種基于微衛(wèi)星序列發(fā)展起來(lái)的分子標(biāo)記，具有簡(jiǎn)便迅速、穩(wěn)定高效、DNA多態(tài)性高，該方法克服了RFLP技術(shù)的局限性以及RAPD的假陽(yáng)性等優(yōu)點(diǎn)。本研究利用10條ISSR引物對(duì)山西省白羊草進(jìn)行遺傳多樣性研究，得到52條多態(tài)性條帶，平均多態(tài)性比率(P)52.53%。說(shuō)明ISSR分子標(biāo)記法可以區(qū)分33個(gè)不同居群的白羊草，對(duì)其遺傳多樣性的研究具有一定的意義。本研究利用ISSR分子標(biāo)記法研究了山西地區(qū)33個(gè)自然居群的白羊草的遺傳多樣性，為擴(kuò)展白羊草的遺傳資源，研究、利用白羊草種質(zhì)資源，發(fā)掘新種質(zhì)，培育白羊草新品種提供了豐富的物質(zhì)基礎(chǔ)。

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